コロイドプローブナノスを使用して、粒子間相互作用の定量的および定性的調査

Introduction

原子間力顕微鏡（AFM）は、定性的および定量的画像化を可能にし、材料表面のプロービング技術である^。4-6伝統的に、AFMは、多相材料の表面形状、形態および構造の評価のために使用される。 AFMは、定量的な空気と液体媒体の両方に特異的なプローブと基板との間の電荷、アトラクション、反発や接着力などのナノスケールの相互作用を評価する機能を備えています^。7,8もともとビニング、クエートおよびガーバー⁹用途が開発した原子間力顕微鏡決定された/既知の感度および接近および/または試料を走査するバネ定数のプローブ。 、プローブと試料との間の物理的相互作用に、カンチレバーが接触又は近接中に偏向され、動作モードに応じて、このたわみは、プローブと試料との間に存在する試料または測定力のトポグラフィを取得するために翻訳することができる。 AFMテクニへの変更QUE、コロイドプローブナノスなど^、10の科学者が直接関心のコロイド系に存在する2つの材料間のナノ力の相互作用を評価することができました。

コロイドプローブナノスでは、選択球状粒子は、従来の円錐形及びピラミッド状の先端を交換する、カンチレバーの頂部に取り付けられている。球状粒子は、ジョンソン、ケンダル、ロバーツ^（JKR）11とDerjaguin、ランダウ、Vervwey、オーバービーク^{（DLVO）12月14日}の理論と測定の表面粗さの影響を最小限に抑えるために理論モデルとの比較を可能にするために理想的です。 ¹⁵これらの理論は、コロイド系の中に予想される接触機構と粒子間の力を定義するために使用される。 JながらDLVO理論は、定量的に水性コロイド系の凝集挙動を説明するために魅力的なファンデルワールス力と反発静電力（起因電気二重層への）を組み合わせたKR理論は、2つの構成要素間の弾性接触をモデル化するための接触圧力および接着の効果を組み込む。適当なプローブが生成されると、2つのコンポーネント間の力を評価するために、任意の他の材料/粒子に接近するために使用される。標準製造されたチップ1を使用すると、その先端と、選択した材料との間の相互作用力を測定することができるが、カスタムメイドのコロイドプローブを使用する利点を検討し、システム内に存在する物質との間に存在する力の測定を可能にします。測定可能な相互作用としては、接着剤、魅力的で、反発性、電荷、粒子間に存在しても、静電力を¹⁶加えて、コロイドプローブ技術は粒子材料の弾力性との間に存在する接線方向の力を探求するために使用することができる^17,18。

様々なメディアでの測定を行う能力は、コロイドプローブナノスの主な利点の一つである。周囲条件、液体mをEDIA、又は湿度制御された条件は、すべて検討し、システムの環境条件を模倣するために使用することができる。液体環境での測定を行う能力は、それが自然に発生する環境でのコロイド系の研究を可能にします。このようにして、定量的にその天然の状態でシステムに直接並進可能であるデータを取得することができる。例えば、定量噴霧式吸入器（MDI）内に存在する粒子の相互作用は、MDIのに用いられる推進剤と同様の特性を有するモデルの液体推進剤を使用して研究することができる。空気中で測定し、同一の相互作用は、吸入器のシステム存在の代表ではないでしょう。さらに、液体媒体は、湿気の侵入、二次界面活性剤、又はMDI中の粒子の相互作用に及ぼす温度の影響を評価するために修飾することができる。温度を制御する能力は、どのように温度の製造において又はいずれか評価するために、コロイド系の製造における特定のステップを模倣するために使用することができるコロイド系のストレージは、粒子の相互作用に影響を与えることができる。

コロイドプローブを用いて得ることができる測定が挙げられる;トポグラフィースキャン、個々の力 - 距離曲線、力 - 距離接着マップ、および力 - 距離測定ドエル。本論文で提示コロイド状プローブナノス法を用いて測定している主要なパラメータは、スナップイン、マックス負荷、分離エネルギー値が含まれています。スナップインが引力の測定値で、maxは最大の接着力の値をロードし、分離エネルギーが接触から粒子を引き出すために必要なエネルギーを伝達する。これらの値は、瞬時の又はドエル力の測定を介して測定することができる。ドエルの測定の2つの異なるタイプのたわみやインデントなどがあります。測定ドエルの長さおよび種類は特に関心のあるシステム内に存在する特異的相互作用を模倣するように選択することができる。例では、偏向滞留を使用している - 保持する希望の偏向値で接触サンプル - 分散液中で形成された凝集体に発展接着結合性を評価する。形成された接着結合は、時間の関数として測定することができ、長期保存後の凝集体を再分散するために必要とされる力への洞察を提供することができる。この方法を用いて得ることができるデータの過多は、本方法の汎用性を証明するものである。

Protocol

1。コロイドプローブとAFM基板を準備

1. コロイド状プローブを製造するために、筆者らが以前に開発された方法を使用します^。19
   1. 簡単に説明すると、45°（ 図1A）の特定の角度でチップレスカンチレバーを固定するために45°の角度ホルダーを使用しています。
   2. 顕微鏡スライド上にエポキシの薄い層を塗りつけによってエポキシスライドを準備します。顕微鏡のスライドに追加し、エポキシの層は、最小限の高さであることを保証するために、クリーンヘラや窒素のゆっくりした流れを使用してください。
   3. カスタムデザインのホルダー（ 図1B）を使用して、40X光学ズーム顕微鏡レンズにエポキシスライドを貼り付けます。その後、エポキシスライドに近づき、カンチレバーにエポキシ少量を取得するためにカンチレバーを使用しています。
   4. また、カンチレバー（ 図1C）の頂点に興味のある単一の粒子を添付し、これらの手順を繰り返します。
2. コロイド状パーを貼り付けることにより、AFM基板を準備します熱可塑性ファスナー、接着剤を使用した原​​子間力顕微鏡のカバーガラス上にticles。
   1. 120℃に35ミリメートルラウンドカバーガラスを加熱して、カバーグラスに少量の接着剤を適用します。高温では、アプリケーションのための熱可塑性接着剤を溶融させる必要がある。
   2. 次いで冷却、のりの上にコロイド粒子を散布する前に、40℃のカバーガラス。注：40℃で接着剤が十分に粒子が接着剤に埋め込まならないよう設定されますが、接着剤は、粒子が基板に付着することを確実にするのに十分な粘着性です。
   3. さらにRTにカバーガラスを冷却し、余分な付着していない粒子を吹き飛ばすために、窒素の穏やかな流れを使用しています。
   4. すべての未結合粒子が基板から除去されることを保証するために、コロイド状プローブ測定のために使用される液体媒体で基板を数回洗浄する。注：これは、測定中の自由流動性粒子の影響を低減することが重要であることができインターカンチレバーを持って行動し、結果に誤差を導入する。

2。コロイドプローブ、整列レーザー、平衡化システムのマウント

1. Oリングは、任意の漏れを防ぐために適切に装着されていることを確認して、液晶セルの下半分にコロイド粒子とカバースリップをマウントします。
2. 特に唯一の測定のための液体セルの下半分を使用している場合は、実験中に漏れる可能性のある液体を防ぐ、及び顕微鏡ステージ上に液体セルを配置するために顕微鏡のステージ上に疎水性の透明なシートを置きます。注：簡単にするために1は、システムが適切に平衡化することができることを考えると、液晶セルの下半分のみを使用することができます。ヒント - 蒸発は、測定と影響結果/読書の条件を変更する。
3. 原子間力顕微鏡の走査ヘッドにコロイド状のプローブを接続して、AFMに組み立てる。上のAFM測定器ソフトウェアを使用すると、上のノブを使っ焦点にカンチレバー先端を持って頭をスキャンする。注：すべての処理手順や測定はアサイラムリサーチ·ソフトウェアとMFP-3D-バイオAFMを用いて完了した。
4. 強度を最大化するために、走査ヘッドに対する適切な調整ノブを使用して、カンチレバーの先端にレーザーの位置を合わせます。
5. システムは5〜10分間、または偏向値が安定するまで平衡化することができます。ゼロまたはわずかに負に振れをもたらすために偏向調整ノブを使用してください。
6. システムは、空気中で平衡化した後、熱InvOLS（感度）を計算し、コロイド状プローブのばね定数を原子間力顕微鏡のソフトウェア（マスターパネル]ウィンドウで熱パネル）を使用します。注：真の感度は、測定が完了した時点で測定されるまでこの感度は（ステップ4を参照）を一時的に使用されます。
   1. どちらの「CALばね定数」や「カルInvOLS」を選択し、「熱データのキャプチャ」をクリックしてください。
   2. 一度顕著なピークが明らかで、データのキャプチャを停止し、メインピークの上に拡大します。
   3. 自動的に計算されたバネ定数やInvOLS値を取得する」、熱データに合わせて "続く"の初期フィット」をクリックします。
7. ゆっくりと注射器を用いて液体セルに液体培地2mlを加え、気泡がカンチレバーの周囲に存在しないことを確認。媒質の屈折率は、現在変更され、再び偏向値がゼロにたわみを調整する前に安定させることができ、システムを平衡化しているため、レーザーを再調整。注：大きな温度差は、環境と液体の間に存在する場合、平衡は時間がかかります。

3。イメージングとデータ収集

1. 1 Hzの、90°、スキャン角度、0.2 Vに設定ポイントに金利をスキャンし、20μmの初期スキャンサイズを設定し、サンプルのスキャンを得る。重複したトレースを取得するために、必要に応じてゲインを調整や曲線をたどる。
2. 関心対象の粒子が検出されると、直ちに強制容積測定値を得る前に、基板を有する拡張プローブ相互作用を制限するために、その粒子上にズームイン。
3. ズームインすると、単一の粒子の単一粒子または部分の十分な画像を取得する。次に、ソフトウェアの力パネルに切り替えます。 、最も高い位置に赤いポジションバーを持って来る5ミクロン、スキャン速度0.1 Hzで、[なし]にトリガチャンネルに力の距離を設定し、単一力測定を実施しています。プローブが基板に接触しないことを確認してください。
4. 得られた単一の測定グラフから、グラフウィンドウを右クリックし、仮想偏向ラインを計算し、「仮想デフラインの計算」オプションを選択する。これは自動的に仮想たわみを計算し、ソフトウェア内で、必要に応じて値を更新します。
5. 20 nmのトリガ点を偏向し、設定するトリガチャンネルを変更します。力DISTを設定1μmでANCE、目的の測定された力に応じて、必要に応じて、走査速度を調整します。
6. 手動で2月3日の連続した​​予備的な単一の力の測定を行った後レビューフォースパネルの偏向逆光てこ感度（InvOLS）の値を調整します。
   1. シングル力測定を実施し、マスターフォースパネルを開きフォースパネルの「レビュー」ボタンをクリックしてください。
   2. 最後に完了した力の測定値を強調表示します。 「軸」は、見出しの下にのみ「DeflV」がチェックされていることを確認してください。 「9月」ドロップダウンメニューを使用してをクリックし、「グラフを作成する」「X軸」の入力フィールドを変更する
   3. マスターフォースパネルの「するparm」タブをクリックし、グラフの接触領域が完全に垂直になるまで、「InvOLS」の値を調整します。その後、カルの下にある「DEFL InvOLS」フィールドにこの値を移入60、メインマスターパネルウィンドウ上にあるフォース]タブでサブタブ。
   4. InvOLS値が大きく変化しないことを確認するには、この2〜3回繰り返します。
7. これで、すべてのパラメータが設定されていることを、液体培地のレベルがまだ十分であり、たわみがまだ安定していることことを確認してください。注：この時点で、単一の力または力曲線マップを得ることができる。ドエル力の測定が必要な場合は、滞留オプションが強制パネルにアクセスすることができる。

分析のための感度の4。ポストチューニング

1. 測定データの集録が完了した後、コロイド状プローブの真の感度を測定します。これを行うには、雲母などの「無限」のハード面に同じ液体培地中のコロイドプローブを用いて、比較的大きなたわみ/力を利用した力の測定を行っています。注：大きな偏向/力がコロを損傷する可能性があるため、感度は、実験が終了した後に得られた多孔性または脆弱なコロイドを用いて調製idalプローブ。
2. 接触領域の傾きは自動的に感度（ 図2）を計算するためにソフトウェアによって使用される。その特定のコロイド状プローブを使用して得られた全ての曲線のデータ分析中の感度は、この真の値を使用してください。

Representative Results

液体コロイド系は、いくつかの薬学的薬物送達システムのために使用される。吸入薬物送達のための、共通のコロイド系は、サスペンション加圧式定量吸入器（pMDI）である。のpMDI内に存在する粒子の相互作用は、製剤の物理的安定性、貯蔵、および薬剤送達の均一性に重要な役割を果たしている。本稿では、モデル噴射剤（2H、3H-ペルフルオロペンタン）多孔質脂質ベースの粒子間の粒子間力（〜2μmの光平均粒径）の機能および提示に関連付けられた可能性のあるエラーを伝えるためにRTで評価した手順。

図3は、2つの代表的なコロイド状のプローブコロイドプローブナノスのために使用することができる脂質ベースの吸入可能な粒子を用いて調製を示す。これは、単一のコロイド粒子は、それが最も顕著な特徴であり、第一の点となるように、カンチレバーの頂部に固定されていることが重要である測定時にお問い合わせください。これは測定された相互作用はコロイド粒子のみに起因していることを保証します。複数の粒子または粒子凝集を取り付けることにより、両方の粒子による複数のカンチレバーの偏向を同時に基板上に存在する同じ単一の粒子を検出し、誤った結果（ 図4）を生成することができます。適切に調製されたコロイド状のプローブを用いて、例えば図5に示すような粒子の基板のトポグラフィ画像は、液体媒体中で達成することができる。

コロイドプローブを用いてトポグラフィースキャンは、鋭利な円錐形の先端を使用して得られたものよりも少ない規定されたであろう;しかしながら、CPNで、地形走査の主な目的は、粒子間の相互作用を評価するために使用することができる基板上に粒子を配置することである。 図6は、いくつかの力曲線を搬送する液体媒体中のコロイドプローブ測定を行う際つが発生する可能性があります。液体の測定測定中に誤差の複数のソースが含まれていると1を適切に測定（ 図6A）の精度への影響を最小限に抑えるために、すべてのソースに注意する必要があります。

図6Bの力曲線において明らかで迅速かつシャープなピークが、測定中のシステムに突発的な外乱の指標である。これは、AFM器具の動き又は瞬間的かつ急速な不安定化短時間で生じるバックグラウンド（例：ドアスラミング、くしゃみ）の突然の騒音に起因し得る。 図6Cに、カンチレバーのアプローチと後退のベースラインの変動は、液体媒体に問題があることを示唆している。液体セルが適切に媒体の蒸発は、システムおよび測定の安定性に大きな影響を与えることを可能満たされていない場合に発生し得る。この不安定性の代替源は、液体石鹸、カンチレバーの不適切な平衡であることができる分析の前にIDの媒体。カンチレバーは、温度の変化に敏感であり、そのような液体セルを「オフトッピング」などのアクションは、適切な再平衡化時間を必要とする。 図6Dは、アプローチと後退サイクルの間のベースラインシフトを示している。このきれいなシフトは、瞬発力測定の間、存在しないであるが、ドエル力の測定においてより明らかである。このドリフトはを含むいくつかの理由で発生する可能性のカンチレバーの熱ドリフトの影響、である：、媒体の温度の変化につながる液体培地をゆっくり蒸発させ、まだ周囲の温度に平衡化されたメディアを使用して、または導電性理想的に制御されていない環境下で測定。測定中の液体培地の温度が最小の安定したシフトは、このようなドリフトを生み出す。測定ドリフトのこのタイプは、閉じた液体セルは、測定中に使用されない限り、高い蒸発液体用制御することが困難である; howeverは、ほとんどのAFM解析ソフトウェアは、このようなドリフトを補正することができる。

エラーのすべての制御可能な供給源が緩和され、システムが適切に平衡化された後、接着マッピングが決定された試料の大きさにわたって大量のデータの統計的体を得るために使用することができる。力マッピングは、粒子の接着力（ 図7）上の地形の影響を評価するために、独立して又は地形走査と組み合わせて使用することができる。のカンチレバーコンタクト基板（ 図7A）と、個々の力曲線（ 図7B）の最大引張力を伝達接着マップの高さに基づいて、試料の地形図：フォースマッピングは、対象となる二つの主要なグラフを提供します。 図7Bのグラフはまた、接着性の数値的平均と標準偏差を取得し、スナップインの力、並びに試料全体を横切るエネルギー分離するために使用することができる。これらの生データgrapをhsが試料（ 図7C / D）を横切る接着測定のトポグラフィ又は広がりの三次元表現として見ることができ、それらを重ね合わせること（トポグラフィの関数としての接着力の分布の三次元図を生成する図7E）。この種のデータは、コロイドおよび方法コロイドの表面がさらなる効果の相互作用の間に存在する力の重要な理解を提供します。

さらに滞留力の測定は、接触力学との接着力に接触長さの効果を評価するために使用することができる。固体脂質粒子は、測定された接着力（ 図8）上のドウェルの効果を伝えるために使用した。それらが偏向ドエルを使用してプラトーながら、 図8は 、押込みドエルを使用して、時間の関数としてその付着力の増加を示す。この傾向は、より長い滞留時間（180秒）で、より明白になる。

。（B）エポキシ/粒子スライド上にスライドされる二ホルダに固定され、カスタムに取り付けられた図1のコロイドプローブナノスのためのコロイドプローブを生成するために使用される方法の描写（A）AFMカンチレバーは、45°カンチレバーホルダを設計し顕微鏡レンズ、（C）エポキシカンチレバーをゆっくりと粒子を取得するために上昇される。

図2カンチレバーの感度は、z距離曲線対たわみの接触領域の傾きである。

図3コロイドプローブ測定を行うために使用することができる適切に調製されたコロイドプローブ。

図4は、固定された複数の粒子を持つコロイド状プローブの使用は、基板の地形スキャン中に基板上の単粒子存在の誤重複する可能性があります。

適切に準備コロイド状のプローブを使用して得られた図5。地形をスキャンします。（A）大関心のある複数の粒子を明らかにスキャンし、（B）は 、対象の1の主要な粒子を明らかにし、より集中スキャン、（C）は 、単一の粒子の表面に焦点を当ててスキャン。

。。良い力曲線の図6 1は、認識しておく必要があり、様々な制限を用いて得られたフォースカーブ（A）の例; AFMの移動によって、または測定中に存在するノイズのいずれかによって擾乱を示す（B）のフォースカーブ（Cなぜなら、媒体の冷却または不安定な環境制御につながる遅い蒸発、測定中に、（D）熱ドリフトの存在、存在する。）は 、非平衡化したカンチレバーの変動が不安定なアプローチ/後退させる可能性があります。

図7コロイドプローブナノスを用いて得ることができる接着力マッピング試料表面の（A）地形分布;。試料を横切る最大接着力の（B）分布（C / D）に示すグラフの3次元表現。それぞれaとb（E）地形の関数としての接着力の単3次元図を生成する地形との密着力のオーバーレイ。

図8は二つ変化する滞留測定値を用いて滞留時間の関数として測定された接着力た（n = 30）、（◊）インドールentation（□）たわみ; * 95％信頼（P <0.05）を用いて両側T検定を用いて、特定の時点における値間の有意差を示す。

Discussion

液体のコロイドプローブナノスの間に存在し、システムの不安定性のいくつかのソースは、簡単に適切な平衡化手続きを緩和することができる。前述のように不安定性を客観的に分析するのがより困難であり、誤った結果と力曲線をもたらす。不安定性のすべてのソースが傾向にされており、 図4に示したものと同様のグラフがまだ存在する場合、他の測定パラメータが理由であってもよい。コロイド状プローブナノス時に考慮することが重要である他の測定パラメータは、カンチレバーが係と試料から退避される速度と力測定のトリガ·ポイントが含まれています。加えて、コロイドプローブの中心の位置が従来のAFMチップ異なってもよいことに留意すべきである。したがって、それは測定精度を最大化するために直接プロービング粒子の中心より上にレーザスポットを配置することをお勧めします。

私tが1で測定し、液体培地での使用に適している1に興味を持っている力に十分な速度を選択することが重要です。粒子間に存在接着力のみに関心があれば、アプローチの速度は重要ではない。しかし、粒子間の引力と反発力の測定のために、アプローチを選択し、十分に遅い速度を撤回することは重要です。接近速度は相互作用しないと速度は、カンチレバーの偏向を支配するように選択されるべきである。液体培地では非常に遅いアプローチは、図6Cと同様に不安定なベースラインを生成する一方、高速なアプローチは、魅力的な相互作用が形成するための時間を確保曇らせるとしません。カンチレバーに液体浮力カンチレバーのアプローチで使用される力に似ているので、ゆっくりとアプローチに起因する不安定性がある。

従来のデータに考慮すべき別の測定パラメータ買収は、最終的なトリガー力である。大きすぎるトリガー力が測定時に大きな変形を生じることができ、さらには材料特性に応じて、プローブまたは試料を粉砕してもよい。探針と試料の間の液体の層が十分粒子間から押し出されない可能性がある代わりに、力が小さすぎるが、不正確な結果が生成され、このようにして測定の相互作用は、粒子間ではありません。この方法の最適化は、適切にスクリーニングし、得られたデータは表現可能かつ正確であることを保証するために様々な測定パラメータをテストすることが重要である。

力が大きく容易に得られるデータセットを提供することができ、図7に示すようにマッピングする。地形図の解像度、続いて三次元表現が行わ測定値の数に直接関連しているオーバーレイ。しかしながら、データ点の数が多いほどより高い解像度の画像を生成するのに、スキャン時間を大幅に増加させることができる。力マッピング全体で安定した液体の測定システムを維持することは、液体培地および環境制御に応じて挑戦することができます。最大の懸念の一つであり、液体を蒸発させて、定期的に追加の液体を使用してシステムの「オフトッピング」によって制限することができます。しかしながら、スキャンが一時停止され、十分な時間が測定前の再開にシステムの再平衡化のために与えられていることが不可欠である。適切な走査時間は、システムが測定の精度を保証するために安定に保つことができることを確実にするように選択されるべきである。

、瞬発力曲線を実施フォースカーブ滞留し、力マップの大規模なデータセットする機能は、天然に存在する模倣環境におけるコロイド系に存在する相互作用を評価する上でのコロイドプローブナノスの汎用性を伝える。ここで詳述する方法を用いて得られた実験データはコロイド安定性に重要な洞察、静電相互作用を提供することができるND凝固速度論。この情報は、スクリーニングし、又は種々の産業全体に存在するコロイド系を改良するために使用することができる。さらにこの方法は、細胞相互作用および機能に関する特定の薬剤または物質（コロイダルプローブ上に調製した）の効果を評価するために、生物学的細胞株を用いて使用することができる。これは、小分子、薬物発見および製剤設計に大きな洞察を提供することができる。さらに、サブミクロン、さらにはナノコロイド状プローブを生産する能力の最近の進歩と、1にもナノコロイド系を研究するため、ここで提示された方法を使用することができます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Double-Bubble Epoxy	Hardman	4004
Veeco Tipless Probes	Veeco	NP-O10
Porous Particles	Pearl Therapeutics
Atomic Force Microscope (MFP)	Asylum	MFP-3D
SPIP Scanning Probe Image Processor Software	NanoScience  Instruments
35 mm Coverslips	Asylum	504.003
Tempfix	Ted Pella. Inc.	16030