Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Bestilling enkelte celler og Single Embryoner i 3D Indespærring: En ny enhed for High Content Screening

Published: September 18, 2016 doi: 10.3791/51880
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Laboratory of Cell Physics, Institut de Science et d'Ingénierie Supramoléculaires (ISIS), CNRS and Université de Strasbourg, 2Development and Stem Cells Program, Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire (IGBMC), CNRS and Université de Strasbourg

Summary

Vi rapporterer en indretning og en ny metode til at studere celler og embryoner. Enkelte celler er præcist bestilles i microcavity arrays. Deres 3D indespærring er et skridt i retning 3D-miljøer er stødt på i fysiologiske forhold og tillader organel orientering. Ved at styre celleform, denne opsætning minimerer variation rapporteret i standard assays.

Abstract

Biologiske celler er sædvanligvis observeres på flade (2D) overflader. Denne betingelse er ikke fysiologisk, og fænotyper og former er meget varierende. Screening baseret på celler i sådanne miljøer har derfor alvorlige begrænsninger: celle organeller viser ekstreme fænotyper, celle morfologier og størrelser er heterogene og / eller specifikke celle organeller kan ikke sigtes ordentligt. Desuden er celler in vivo beliggende i et 3D-miljø; i denne situation, celler udviser forskellige fænotyper primært på grund af deres interaktion med det omgivende ekstracellulære matrix af vævet. For at standardisere og generere orden af enkelte celler i en fysiologisk relevant 3D-miljø for cellebaserede assays, rapporterer vi her den mikrofabrikation og applikationer af en anordning til in vitro-3D cellekultur. Denne anordning består af en 2D array af mikrohulrum (typisk 10 5 kaviteter / cm2), hver fyldt med enkelte celler eller embryoner. Cell position, form, polaritet og intern celle organisation bliver derefter normaliseret viser en 3D arkitektur. Vi brugte replika støbning til mønster en række mikrokaviteter, 'æggebægre', på en tynd polydimethylsiloxan (PDMS) lag klæbet på et dækglas. Hulrum var dækket med fibronectin til lette adhæsion. Celler blev indsat ved centrifugering. Påfyldning procentdel blev optimeret til hvert system giver mulighed for op til 80%. Celler og embryoner levedygtighed blev bekræftet. Vi anvendte denne metode til visualisering af cellulære organeller, såsom nucleus og Golgi apparatet, og til at studere aktive processer, såsom lukningen af ​​cytokinetic ring under cellemitose. Denne enhed tillod identifikation af nye funktioner, såsom periodiske ophobninger og inhomogeniteter af myosin og actin under cytokinetic ring lukning og komprimerede fænotyper for Golgi og nucleus tilpasning. Vi kendetegnet metoden for pattedyrceller, fission gær, spirende gær, C. elegans wed specifikke tilpasning i hvert enkelt tilfælde. Endelig karakteristika denne enhed gør det særligt interessant for lægemiddelscreeningsassays og personlig medicin.

Introduction

Nuværende in vitro cellebaserede assays er todimensionale (2D). Denne konfiguration er ikke naturligt for pattedyrsceller og er derfor ikke fysiologisk relevant 1; celler udviser en mangfoldighed af former, størrelser og heterogene fænotyper. De præsenterer yderligere alvorlige begrænsninger ved påføring på screening applikationer, såsom en uordnet fordeling inden for planet og ekstreme fænotyper af cellulære organeller (stress fibre, i særdeleshed). Dette er særlig vigtigt i kliniske forsøg for narkotika testning, hvor høje budgetter hvert år bruges. De fleste af disse lægemidler imidlertid mislykkes, når anvendt på dyremodeller på grund af den kunstige 2D dyrkningsbetingelser i tidlige stadier af lægemiddelscreening. Ved at bruge denne fremgangsmåde, specifikke celleorganeller kan ikke sigtes ordentligt, såsom cytokinetic actomyosin ring under cellemitose, og generelt strukturer, der udvikles på planet vinkelret på planet for observation. Noglenye 2D assays er blevet foreslået for at overvinde de ovennævnte ulemper og vigtige indsigt på cytoskeleton organisation er observeret 2,3. Men disse assays stadig findes en alvorlig begrænsning,: celler viser en meget spredt fænotype i modsætning til hvad der observeres in vivo, hvor cellerne udgør en 3D arkitektur. Disse artefakter forbundet med kulturen metoden kan udløse ikke-fysiologiske funktioner såsom forbedrede stress fibre 1,4,5.

Tredimensionale celledyrkningsassays giver flere fordele i sammenligning med 2D miljøer 6,7. De er fysiologisk mere relevant, og resultaterne er derfor meningsfuldt. Som et eksempel, celler indlejret i hydrogeler viser 3D-lignende strukturer, men deres morfologier forskellige fra én celle til en anden 8,9. Men deres morfologier forskellige fra én celle til en anden, hvilket komplicerer screening applikationer. En alternativ strategi er at indlejre enkeltceller i mikrofabrikerede hulrum 10,11. Cell position, form, polaritet og intern celle organisation kan så blive normaliseret. Ud over at give 3D-lignende arkitektur til celler, mikrokaviteter giver også mulighed for høj-indhold screeningsundersøgelser 10,12-14; enkeltceller kan bestilles i microarrays og cellulære organeller og kan iagttages deres udviklingstendenser parallelt. Denne regelmæssighed giver god statistik med lavt antal celler og bedre tidsmæssige / rumlige opløsninger. Anvendelige forbindelser er nemmere at identificere pålideligt.

I denne undersøgelse, viser vi fremstilling og anvendelse af en ny 3D-lignende enkelt celler kultur for højt indhold-screening applikationer 10,12,13. Enheden består af en vifte af elastomere mikrokaviteter (10 5 hulrum / cm2), opfundet 'Æggebægre «(EF). Dimensioner og samlede volumen af ​​EF i dette arbejde er optimeret til den typiske mængde af individuelle NIH3T3 og HeLa-cellerunder celledeling. Morfologi af hulrummene - cylindriske - er valgt til korrekt orientere celleform til visualisering af aktive processer. Replika støbning anvendes til pattern et array af EF på en tynd polydimethylsiloxan (PDMS) lag klæbet på et dækglas 15,16. Celler indført i EF ved centrifugering. Vi rapporterer her observation og normalisering af cellulære organeller (actin stress fibre, Golgi apparater og nucleus) i 3D (EF) sammenlignet med de samme celler på 2D (flad) overflader. Vi rapporterer også observation af aktive dynamiske processer, såsom lukning af cytokinetic actomyosin ring under celle mitose 17. Endelig viser vi resultaterne af denne metode på andre systemer med stive vægge, såsom knopskydende gær, fission gær og C. elegans-embryoer hvilket bekræfter anvendeligheden af vores metodologi til en lang række modelsystemer.

Vi næste fremlægge en detaljeret og udtømmende protokol for at fremstille og anvende 'æggebægre' til 3D mikrofabrikation. Vores tilgang er enkel og behøver ikke et rent lokale. Vi forventer, at denne nye metode vil være særlig interessant for lægemiddelscreeningsassays og personlig medicin, i stedet for petriskåle. Endelig vil vores enhed være nyttige til undersøgelse af fordelinger af celler reaktioner på eksterne stimuli, for eksempel i cancer 18 eller i grundforskning 19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. mikrofabrikation af 'Æggebægre'

  1. Fabrikation af Master: mikrohulrum Array
    1. Varm en 3 '' siliciumwafer op til 200 ° C for at fordampe enhver forekomst af fugt.
    2. Spin-coat et tyndt lag af SU-8 fotoresist. Justere lydstyrken af ​​harpiks og spinding hastighed afhængigt af den ønskede tykkelse og fotoresist type. Denne tykkelse vil diktere dybden af ​​'æggebægre "(EF). For en 30 um tykt lag og SU-8 2025, spin-coat på 2800 rpm.
    3. Pre-bage skiven ved 65 ° C i 1 min (trin 1 af 2) for en 30 um tyk SU-8 2025 lag. Tilpas tid, afhængigt af fotoresist type og tykkelse ønskes. Kig på producentens datablad for detaljer.
    4. Pre-bage skiven ved 95 ° C i 3 minutter (trin 2 af 2) for en 30 um tyk SU-8 2025 lag. Tilpas tid, afhængigt af fotoresist type og tykkelse ønskes. Kig på producentens datablad for detaljer.
    5. Lægwafer på masken aligner for UV eksponering. Placer fotolitografi maske på det. Masken viser et mønster af cirkulære funktioner (diske) på 20 um i diameter. Sikre en perfekt kontakt mellem hinanden.
      BEMÆRK: Forskellige producenter tilbyder fotolitografiske masker. Den rumlige opløsning vil bestemme de endelige omkostninger. Acetat masker tilvejebringe acceptabel opløsning (≈10 um) til en lav pris. Chrom masker giver bedre opløsning, men er dyrere. Tilpas diametre diske (fra fotolitografi maske) til mængden af ​​celler. Dimensioner af diske på masken vil bestemme diameteren af ​​hulrum i indretningen. Små diametre vil føre til en lav fyldning; for stor diameter vil ikke begrænse cellerne. For HeLa og NIH3T3-celler, er foreslået diametre på 20 um til 25 um.
    6. Kontroller magt UV-lampen før redegørelsen og optimere eksponeringen tid i overensstemmelse hermed. Bestråle (bølgelængde = 365 nm) i 41,5 sekunder (eller det optimerede eksponeringstid) ved250 mJ / cm2.
      BEMÆRK: SU-8 2025 er en negativ fotoresist, hvilket betyder, at eksponerede områder til UV vil blive helbredt. I dette tilfælde er de cirkulære funktioner var sort og resten gennemsigtig. Positiv fotoresist arbejde i den modsatte måde: ikke-eksponerede områder er helbredt. Vælg fotoresist overensstemmelse hermed, afhængigt af udformningen og foto-maske.
      BEMÆRK: Beskyt øjnene mod UV-lys med passende sikkerhedsbriller.
    7. Fjern forsigtigt masken fra fotoresist lag.
    8. Post-bage skiven ved 65 ° C i 1 min (trin 1 af 2) for en 30 um tyk SU-8 2025 lag. Post-bage skiven ved 95 ° C i 3 minutter (trin 2 af 2) for en 30 um tyk SU-8 2025 lag. Tilpas tid, afhængigt af fotoresist type og tykkelse ønskes. Kig på producentens datablad for detaljer. Efter post-bagning afkøles waferen til stuetemperatur på bænken for omkring 1 min.
    9. Placer wafer i spin-coater og slip par mm af SU-8 udvikler til at dækkehele wafer området. Develop i 2 min og derefter spinde-coat ved 1.000 rpm i 30 sek. Gentag proceduren tre gange.
    10. Skyl med 2-propanol for at sikre fuldstændig fjernelse af ubebyggede SU-8. Udseende af hvide områder er en indikation af ufuldstændig udvikling. Hvis det er tilfældet, gentages udvikle trin en ekstra gang.
    11. Hard-bage skiven ved 200 ° C for at sikre pålideligheden af ​​de fabrikerede mikrostrukturer. Dette trin er valgfrit.
    12. Opbevar 3 '' wafer med mikrostrukturer inde i en 94 mm x 15 mm polystyren petriskål.
      BEMÆRK: Der er ikke behov for overfladebehandling, især silanisering, for de næste skridt.
  2. Fabrikation af Polydimethylsiloxan (PDMS) Replica: Pillars Array
    1. Blandes grundigt i en 1:10 ratio (w / w) tværbindingsmidlet og pre-polymer for i alt 30 g inde i et 50 ml rør.
      BEMÆRK: Brug af en 01:10 (v / v) forholdet arbejder også.
    2. Centrifugeres røret ved 1800 xg i 5 min tilfjerne luftbobler.
    3. Drop forsigtigt PDMS oven mikrostrukturerne.
      BEMÆRK: Hvis luftbobler vises under dette trin, afgasses prøven ved hjælp af en vakuumpumpe til 15-20 min.
    4. Prøven anbringes i en ovn ved 65 ° C i 4 timer.
      BEMÆRK: Hærdetiden varierer mellem brugere og sammen med tværbinderen: præpolymer andel. Denne gang vil diktere stivheden af ​​PDMS. Det anbefales at helbrede mere end 2 timer, og at holde sig til en fast hærdetid.
    5. Brug en skalpel til forsigtigt skære interesseområdet (stempel) på ca. 1 cm 2, som omfatter omkring 10 5 mikrokaviteter eller "æggebægre '.
      BEMÆRK: Klip først de PDMS og derefter, flå det forsigtigt. Kontroller kvaliteten af ​​PDMS replika med et optisk mikroskop.
  3. Fabrikation af 'æggebægre' ved replika støbning. I det følgende er to alternative strategier for fremstilling af 'æggebægre' beskrevet. Begge protokoller er similar og give identiske resultater:
    1. strategi 1
      1. Aktivere fabrikerede PDMS stempel med oxygen plasmabehandling i 30 sek. midlertidig lagring de aktiverede stempler i en lukket petriskål at forhindre aflejring af støv.
        BEMÆRK: Juster redegørelsen tid, hvis der anvendes andre gasser til plasmaet.
      2. Placer de aktiverede PDMS stemple hovedet op (siden med de strukturer) i en petriskål ved siden af ​​en 15 ml rør cap. Fyld cap med 200 pi trimethylchlorsilan (TMCS). Luk petriskålen og lad stempel silanize i 7 min.
        BEMÆRK: Nogle midlertidige deformation på frimærket og / eller ændring i farve (hvid) kan observeres. Stemplet vil genvinde sin oprindelige form på kort tid, og de strukturer, vil ikke blive berørt.
        BEMÆRK: TMCS producerer akut indånding og dermal toksicitet, og er meget brandfarligt (med tænding flashback i stand til at optræde på store afstande). Følgelig bør det anvendes i stinkskab væk fra kildens for antændelse.
      3. Placer PDMS stempel på spin-coater med strukturerne på hovedet op. Sætte en lille dråbe få mikroliter (ca. 20 ul) af flydende PDMS (1:10 vægt / vægt tværbinder: pre-polymer) oven på strukturerne. Spin-coat ved 1500 rpm i 30 sek for at deponere et tyndt lag af PDMS oven af ​​strukturerne.
        BEMÆRK: Hvis stemplet ikke passer spin-coater Chuck sted stempel på toppen af ​​en petriskål låg med et lille hul i midten.
      4. Placer stempel i ovnen ved 65 ° C i 4 timer for at helbrede den deponerede spin-belagt PDMS lag.
      5. Aktivere tynde PDMS lag ved at placere PDMS stempel hovedet op, sammen med et dækglas # 0 af 25 mm i diameter, ved anvendelse af oxygenplasma renere for 30 sek. Hurtigt videre til næste trin.
        BEMÆRK: Dækglas med andre tykkelser, former og dimensioner kan anvendes. Imidlertid kunne nogle cellulære strukturer være vanskeligt at visualisere afhængigt af den valgte dækglasset tykkelse og objektivforstørrelse og / eller NA og / eller arbejder afstand. Kontrollér målet datablad.
      6. Placer i kontakt stempel (siden med den tynde spin-belagt lag) med dækglas. Tryk forsigtigt rundt omkring overfladen af ​​stemplet med en pincet til at gøre "bonding". Endelig holde et konstant tryk på toppen af ​​stemplet for omkring 10 sek.
      7. Efter 30 minutter forsigtigt »skind« stempel ud af dækglasset for at 'befri' 'æggebægre' (se figur 1). Skyl grundigt med ethanol og tør. Hvis PDMS 'æggebægre' ikke er godt klæbet på dækglas (dvs. de frigøre under "unpeeling 'trin), overveje at justere indstillingerne for plasma renere og genstart ved trin 1.3.1.5.
        BEMÆRK: Dette trin er delikat. Vær opmærksom for at undgå brud på dækglasset og / eller løsning af tynde PDMS lag.
      8. Lim et lille stykke (håndtag) af hærdede PDMS på 1 mm x 1mm x 3 mm i volumen på kanten af ​​dækglasset med en lille dråbe flydende PDMS og helbrede de PDMS som før. Dette vil lette manipulering af prøven bagefter (se figur 1). Dette trin er valgfrit.
    2. strategi 2
      1. Hydrofilisere de fabrikerede PDMS frimærker af oxygen plasmabehandling i 30 sek. midlertidig lagring de aktiverede stempler i en lukket petriskål at forhindre aflejring af støv.
        BEMÆRK: Juster redegørelsen tid, hvis der anvendes andre gasser til plasmaet.
      2. Hydrofilisere 25 mm glas diameter dækglas # 0 oxygen plasmabehandling ved 15 W i 30 sek. Hurtigt videre til næste trin.
        BEMÆRK: Dækglas med andre tykkelser, former og dimensioner kan anvendes. Dog vil cellulære strukturer være svært at visualisere afhængigt af den valgte dækglasset tykkelse og objektive karakteristika (se note ovenfor).
      3. Spin-coat en lille dråbe PDMS (1:10 vægt / vægt tværbinder: pre-polYmer) af få mikroliter onto dækglas. Spin-coat ved 1500 rpm i 30 sekunder ved en endelig tykkelse på omkring 50 um.
      4. Lim et lille stykke (håndtag) af hærdede PDMS på 1 mm x 1 mm x 3 mm i volumen ved kanten af ​​dækglasset med en lille dråbe flydende PDMS og hærde PDMS som før. Dette vil lette manipulering af prøven bagefter (se figur 1). Dette trin er valgfrit.
      5. midlertidigt Opbevar PDMS-overtrukne dækglas på en ren tørre inde i en petriskål til at beskytte mod støv deposition.
      6. Sæt en dråbe silanizing reagens oven på hvert frimærke og lad det fordampe i 1-2 min. Derefter tørres under en strøm af N2.
        BEMÆRK: I dette trin kan der observeres en midlertidig deformation af stemplet under fordampning. Stemplet vil genvinde sin oprindelige form efter tørring med N2 uden nogen permanent deformation af mikrostrukturer.
      7. Drop meget forsigtigt silaniserede stempel på toppen afPDMS-spin-coated dækglas lagret i petriskålen. Sørg for, at begge parter er fuldstændig parallelle i kontakten. Undgå at trykke eller flytte stemplet efter at placere det på PDMS-coatede dækglas.
      8. Anbring petriskålen med prøver i vakuum i 1-2 timer for at fjerne luftbobler.
        BEMÆRK: Sørg for, at prøverne er helt vandret for at undgå stempel forskydning. Undgå også vibrationer potentielt forårsaget af vakuumpumpen.
      9. Placer prøverne i ovnen ved 65 ° C i 4 timer.
      10. Forsigtigt, skrælle stempel til at afsløre "æggebægre '. Skyl grundigt med ethanol og tør.
        BEMÆRK: Øv på dette punkt er nødvendig. Vær opmærksom på at undgå brud på dækglasset og / eller frigørelse af det tynde PDMS lag.

2. Introduktion Celler i 'Æggebægre'

For at indføre pattedyrsceller inde 'æggebægre «, PDMS overflade needs at være funktionaliseret med adhæsionsproteiner af den ekstracellulære matrix. Dette eksempel bruger fibronectin men andre proteiner af interesse, såsom collagen, kan anvendes.

  1. Hydrofilisere de »eggcups 'i oxygenplasma renere for 30 sek.
    BEMÆRK: Optimer parametrene, hvis nødvendigt.
  2. Forbered en løsning i PBS 1x 20 pg ml -1 fibronectin fra Kvæg kilder.
  3. Sterilisere 'æggebægre' med UV i 5 min. Deponere en lille dråbe (ca. 20-50 pi) af fibronectin løsning til at dække hele »eggcups" område og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur. Beskytte prøven fra tørring.
  4. Skyl forsigtigt de "æggebægre 'med PBS 1x. Gentages 3 gange.
    BEMÆRK: Prøven er klar til brug straks eller opbevaret ved 4 ° C i mørke i adskillige uger.
  5. Indføre en cylindrisk skræddersyet plast stykke 63 mm i højden, 26 mm af ekstern radius og 7 mm af interne radius dimensioner i et 50 ml rør (seFigur 2) 20
    ADVARSEL: Brug UV-steriliserede emner eller sterilisere dem tidligere brug.
    BEMÆRK: Dette stykke kan let fremstilles i laboratoriet. eller ved enhver tilgængelig maskinværksted.
  6. Sætte 13 ml cellekulturmedium inde i røret (se tabel 1). Mediet skal fylde mindst 2 cm over det cylindriske stykke for at sikre fuldstændig nedsænkning af prøven.
    BEMÆRK: Yderligere oplysninger om specifikke celletyper og andre modelsystemer såsom gær eller C. elegans embryoner, og de ​​tilsvarende medie, der anvendes, se afsnit 5 og tabel 1. Den beskrevne protokol blev optimeret til HeLa, NIH3T3 celler, og andre cellelinjer (se tabel 1).
  7. Indføre meget forsigtigt de »eggcups 'Inde i røret og parallelt med den øvre side af plaststykket. Brug skarpe pincet til at holde prøven ved hjælp af PDMS håndtaget. Tryk forsigtigt dækglasset indtil det ligger oven på den øvre side af plaststykket, uninto det er fuldt nedsænket (se figur 2).
    BEMÆRK: Det anbefales at bruge skarpe og lige pincet. Med buede pincet, manipulation af prøven er vanskeligt og kan forårsage brud.
  8. Kultur celler indtil 80-100% sammenløb i en P60 petriskål og indsamle dem ved trypsinisering.
    BEMÆRK: Celler kan være vildtype, transficeret eller behandlet med helst lægemiddel af interesse.
    BEMÆRK: Undgå dannelsen af ​​celle aggregater, som vil undgå enkelte celler til at indtaste "æggebægre '. For at optimere dette trin, pipette op og ned grundigt efter trypsinisering.
  9. Re-suspendere celler i 5 ml dyrkningsmedium. Pipette 200 pi celler oven på de "æggebægre«.
    BEMÆRK: Drop celler som centreret som muligt på toppen af ​​'æggebægre', men undgå fysisk kontakt. Dette vil forhindre brud og / eller beskadigelse af prøven.
  10. Centrifuger ved 1.800 xg i 2 min.
    BEMÆRK: Efter den første centrifugering, tjekke en mikrofonroscope fyldet procentdel af de 'æggebægre'.
  11. Pipette igen 200 ul celler på toppen af ​​'æggebægre' og centrifugeres ved 1800 xg i 2 min. Gentag for i alt tre gange for at optimere den procentvise påfyldning.
    BEMÆRK: Efter den sidste centrifugering, check med et mikroskop påfyldning procentdel af 'æggebægre'. Gentag om nødvendigt trin fyldnings- + centrifugering, indtil den når den ønskede fyldning procent.
  12. Fjern prøven fra røret ved hjælp af de skarpe pincet holder PDMS håndtaget. Sørg for at være forsigtig i ikke 'foruroligende' celler, som holdes i »æggebægre '(se figur 2).
  13. Prøven anbringes i en petriskål med medium. Skyl for at fjerne overskuddet af celler, som ikke i de eggcups 'ved pipettering op og ned tre gange forsigtigt ud for hver side (total 4 sider) af mikrostrukturen array.
    BEMÆRK: Pipetting for stærkt kan frigivenogle celler ud fra 'æggebægre «.
  14. Udskift mediet med frisk medium for at fjerne nonattached celler.
    BEMÆRK: I dette trin kan der tilsættes et stof af interesse.
  15. Fix celler eller forberede dem til time-lapse imaging.See trin 4.1.

3. Observation af Aktive Cellular Dynamics i 'Æggebægre': Cytokinetic ringslutning

BEMÆRK: Dette eksempel bruger HeLa celler, der er transficeret med MYH10-GFP og Lifeact-mcherry for myosin og actin henholdsvis centrale aktive molekyler involveret i cytokinetic ringslutning under celle mitose. Indretningen fremstilles med mikrohulrum på 25 um i diameter. For deres observation blev en epifluorescens omvendt mikroskop anvendes, udstyret med en 60X olie mål (1,40 NA, DIC, Plan Apo) og GFP (myosin) og TxRed (actin) filtre. Alternativt en opretstående konfokal mikroskop blev anvendt, udstyret med en 25X eller 63X HCX IR APO L vand mål (0,95 NA). Til dette EXAmple, er det stærkt anbefales at synkronisere celler ved hjælp af dobbelt thymidin blok, mitotisk blok eller mitotisk ryste-off metode 21-24.
BEMÆRK: Tykkelsen af ​​PDMS anvendes til de "æggebægre 'tillader brugen af ​​en række mål i både inverterede og oprejst placerede mikroskoper.

  1. Place 'æggebægre' i et mikroskop holder og fyld den med 1 ml 10% FCS L-15 observation medium. For at undgå fordampning, placere en glas låg på toppen af ​​holderen eller anvende et tyndt lag af mineralsk olie på toppen af ​​60X olie mål medium.Select den.
    BEMÆRK: L-15 medium er passende for ikke-CO 2 atmosfærer. Bemærk også, at nogle forbindelser med DMEM er auto-fluorescerende. Ved brug dette medium, anbefales det at photobleach de fluorescerende forbindelser ved at belyse den med en højintensitetslampe i 1-2 timer.
    BEMÆRK: Undgå at bruge plastlåg når du arbejder med DIC billeddannelse.
  2. Anbring holderen med 'æggebægre' og observation medium i mikroskopet. Fokusere forsigtigt med lysfelt lys, indtil de "eggcups«, og cellerne er i det samme plan for observation.
  3. Åbn softwaren og justere parametrene. Vælg filtrene TxRed og GFP til actin og myosin; justere eksponeringstid for hver kanal. En typisk erhvervelse sats er 5 sek for begge kanaler.
    BEMÆRK: Redegørelsen tid skal muligvis justeres afhængigt opspændingssituationen, farvestof eller andre cellulære organeller af interesse.
  4. Vælg den region af interesse og søge for en cytokinetic ring ved hjælp af enten GFP eller TxRed kanal. Fokusere nøjagtigt.
    BEMÆRK: Ringen er skarpere i myosin og lettere at genkende.
  5. Kør den automatiske erhvervelse i begge kanaler, indtil ringen er helt lukket.
    BEMÆRK: Der kan observeres nogle fotoblegning. Juster mikroskop parametre for at reducere den.

4. Observation af Fixed Cellular organeller i 'Æggebægre'

Dette trin kan udføres før eller efter trin 3. Celler kan direkte fikseret centrifugeringstrin og farvet for organel af interesse eller efter observation i mikroskop. Dette eksempel viser farvningen af ​​Golgi-apparatet, nucleus og aktin fibre på NIH3T3 fibroblaster i 'æggebægre «.

  1. Fiksering af cellerne i det "Æggebægre '
    1. Forbered 3% paraformaldehyd (PFA) og varm ved 37 ° C. Fjern 'æggebægre' prøve fra 50 ml rør (eller indehaveren af ​​mikroskop), og læg den i en P35 petriskål. Skyl gang med PBS 1x.
      BEMÆRK: Protokoller til fremstilling af 3% paraformaldehyd er bredt tilgængelige andre steder.
      ADVARSEL: Brug nitrilhandsker og øjenbeskyttelse under forberedelsen af ​​PFA.
    2. Fjern helt PBS og slip 1 ml 3% PFA og inkuberes i 17 min. Fjern PFA og skyl to gange med 1 ml PBS 1X. Permeabilisere celler ved anvendelse af 1 ml 0,5% tritpå i 3 min og vask to gange med PBS 1x i 5 minutter.
  2. Farvning af celler i 'Æggebægre'
    1. Inkuber celler til Golgi-apparatet farvning med det primære antistof kanin polyklonalt anti-Giantin i en 1: 500 fortynding i PBS. Placer en 100 pi dråbe antistofopløsning på en plastfilm plader og inkuber cellerne inde i »eggcups 'hovedet i 45 minutter.
      BEMÆRK: Beskyt prøven med et dække for at forhindre udtørring.
    2. Slip forsigtigt de "Æggebægre 'og placere dem i en P35 petriskål. Skyl 3 gange, 5 min hver med PBS 1x.
    3. Forbered en cocktail i PBS med det sekundære antistof Cy3 gede-anti-kanin (1: 1.000) og med Phalloidin Alexa Fluor 488 (1: 200) til farvning actin stress fibre.
    4. Cellerne inkuberes med et 100 pi dråbe antistofopløsning på en plastfilm plader og inkuber cellerne inde i »eggcups 'hovedet i 45 minutter.
    5. Slip forsigtigt 'eggcups 'og placere dem i en P35 petriskål. Skyl 3 gange, 5 min hver med PBS 1x.
    6. Inkuber celler til nucleus farvning placere en 100 pi dråbe af 1 ug ml -1 DAPI i PBS på en plastfilm plader og inkuber cellerne inde i »eggcups 'hovedet i 45 minutter. Dette trin kan udføres med trin 4.2.3.
    7. Slip forsigtigt de "æggebægre 'og placere dem i en P35 petriskål. Skyl 3 gange, 5 min hver med PBS 1x.
    8. Mount celler under anvendelse af en 15 pi Glycerol: PBS (1: 1 v / v) på en standard mikroskop objektglas og forsegle prøven med neglelak for at undgå udtørring.
      BEMÆRK: Afhængigt af 'æggebægre' tykkelse, kan montering være svært. Det anbefales at lagre så prøven i en P35 petriskål i PBS, beskyttet mod udtørring.
  3. Mikroskop Observation
    BEMÆRK: I dette eksempel bruges en opretstående konfokal mikroskop, er udstyret med PMT og Hybrid detektorer. En 25X eller 63 X HCX IR APO L vand mål (0,95 NA) blev udvalgt til at give et bredt felt af prøven og vise anvendeligheden af ​​enheden for high-indhold-screening applikationer.
    1. Vælg den 25X eller 63X vand målsætning.
      BEMÆRK: Der kan anvendes forskellige mål afhængig af anvendelsen og signalet. Men brugen af ​​høje numeriske apertur mål anbefales.
    2. Placer den faste prøve med 'æggebægre' og fokusere omhyggeligt bruge lysfelt lys (fasekontrast eller DIC), indtil de "æggebægre 'og celler er i flyet af observation.
    3. Åbn softwaren og justere parametrene. Vælg filtrene GFP, Cy3 og DAPI til actin, Golgi og nucleus observation, henholdsvis; justere eksponeringstid for alle kanaler.
      BEMÆRK: Redegørelsen tid skal muligvis justeres afhængigt af opsætningen.
    4. Vælg og fokusere området af interesse; starte billedoptagelse (se figur 3).
tle "> 5. Tilpasning til Observation af gærceller og C. elegans Embryo

  1. Fission og spirende Gærceller
    BEMÆRK: Dette eksempel bruger fission gærceller, som er mærket med RLC1-mcherry og CHD-GFP for myosin og actin, hhv. De spirende gærceller ikke fluorescensmærket her. For fission gær observation en omvendt roterende skive konfokalt mikroskop blev anvendt. En 100X HCX PL APO CS olie mål (1,4 NA) blev anvendt til alle overtagelser. Alternativt blev cellerne også observeret ved anvendelse af en inverteret fasekontrastmikroskop udstyret med en 20X fasekontrast luft mål LCPlanFl (0,4 NA). I dette eksempel protokollen er identisk for begge celletyper.
    1. Forbered 'æggebægre' overflade som beskrevet ovenfor. For fission og spirende gærceller, forberede hulrum af 5 um i diameter (se tabel 1). I dette tilfælde har overfladen ikke at være funktionaliseret med adhæsionsproteiner.
      BEMÆRK: Fyldet can optimeres ved hjælp af koniske 'æggebægre «. Denne form fanger og tilbageholder cellerne undgå frigivelse under skylning trin efter centrifugering. Påfyldning procentdel er optimal ved ca. 80%. Disse koniske 'eggcups' kan fremstilles ved hjælp af Deep Reactive Ion Etching 13.
    2. Kultur gærceller i egentlig dyrkningsmedier (se tabel 1), indtil man en optisk densitet (OD) i området fra 0,2 og 0,8. Sonikeres kulturen af ​​gærceller til fjernelse aggregater.
    3. Sæt gærceller i 'æggebægre' ved centrifugering. For centrifugering, tilsættes 4 ml dyrkede celler i passende OD på røret med 'æggebægre «. Efter den første centrifugering, ryst forsigtigt røret til at re-suspendere celler som ikke er i de "æggebægre«, mens celler i de "æggebægre 'ikke forstyrres. Uden at åbne røret centrifugeres igen og gentage dette trin to gange. Dette sikrer aflejringenaf celler fra kulturen i de tomme mikrokaviteter og vil øge andelen påfyldning.
      BEMÆRK: Når du arbejder med gær, anbefales det at forvarme centrifugen til arbejdstemperatur under forsøg
      BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her og fortsatte op til 12 timer senere. I dette tilfælde skal opbevare prøven ved arbejdstemperaturen og dække det for at forhindre fordampning.
    4. Placer 'æggebægre' i et mikroskop holder og fylde holderen med filter steriliseret medium til billeddannelse. Nu skylles cellerne med de samme medier, indtil de flydende gærceller fjernes effektivt. Pas på ikke at forstyrre celler i 'æggebægre' under skylningen processen.
    5. Vælg 100X olie objektiv og fokusere omhyggeligt. Åbn softwaren og justere parametrene. For fission gær, skal du vælge filtre GFP og TxRed for actin og myosin og justere redegørelsen tid for begge kanaler. En typisk erhvervelse sats er 3 sek.
      BEMÆRK: Afhængigt affluoroforen, typen af ​​kodning og opsætning, eksponeringstid varierer for andre systemer.
  2. C. elegans Embryo
    BEMÆRK: Dette eksempel bruger C. elegans-embryoner 25-30 um brede og 50-55 um lang. Embryoer blev dyrket som angivet i 25. En simpel visuel protokol af hvordan man kan manipulere C. elegans kan findes i 26. Observationen blev udført ved anvendelse af en inverteret fasekontrastmikroskop udstyret med en 40X luft mål 0,55 NA.
    1. Forbered »eggcups 'overflade som beskrevet ovenfor og 25 um i diameter (se tabel 1). I dette tilfælde har overfladen ikke at være funktionaliseret med adhæsionsproteiner.
    2. Kultur C. elegans-embryoner i den korrekte dyrkningsmedier (se tabel 1).
    3. Indsæt embryoner i »eggcups« ved centrifugering som beskrevet ovenfor (se afsnit 2.6 til 2.12) under anvendelse ultrarent vand som dyrkningsmedium.
      BEMÆRK: Embryoer 'opfører »normalt i ultrarent vand under hele eksperimentet. Alternativt kan en fysiologisk M9 buffer for langsigtede eksperimenter.
    4. Skyl prøven som beskrevet ovenfor (se afsnit 2.14). Placer 'æggebægre' i et mikroskop holder. Vælg 40X luft objektiv og fokusere omhyggeligt. Åbn softwaren og justere parametrene. Vælg en overtagelse på 3 sek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De "eggcups" (EF) er en roman højt indhold-screening metode, der tillader visualisering af orienterede celler og embryoner i et 3D-miljø. Derudover nogle cellulære processer, som er vanskelige at observere i standard 2D (flade) -kulturer, kan observeres ved denne nye fremgangsmåde. Figur 1 a viser et sammendrag af proceduren for EF mikrofabrikation (se også afsnit 1 i den ovenfor beskrevne protokol ). Fremgangsmåden er simpel, hurtig, effektiv og uden krav om særligt udstyr. Figur 1b og 1c viser et storstilet billede og et forstørret scanningselektronmikroskop foto af 'eggcups «henholdsvis. Som det kan ses, deres form og størrelse er meget regelmæssigt. Denne metode er meget fleksibel; forskellige former og størrelser kan let fremstilles og tilpasses til forskellige modelsystemer. Dimensionerne af'eggcups' blev udvalgt på følgende måde: dimensioneraf celler, som undergår deling blev målt på 2D overflader: de har en sfærisk form og deres diameter blev taget som en god indikation for EF diameter. Celler i'eggcups' aflang og orientere langs deres længdeakse under celledeling for eksempel. Denne dimension afhænger af systemet - celler og embryoner - så dette dimension skal vurderes i hvert enkelt tilfælde.

Figur 2 viser den nødvendige materiale (figur 2a) og en trin-for-trin-protokol (figur 2b) om, hvordan man bruger 'æggebægre' (se også afsnit 2 i den ovenfor beskrevne protokol). Fyldet i EF med celler af interesse (eller andre modelsystemer) er meget enkel og hurtig. Det tager typisk mindre end 20-30 min, som også omfatter tiden til celle trypsinisering. Efter fyldningen kan prøver anvendes til at studere aktive processer (levende billeddannelse) eller kan fikseres og farves til visualisering af organeller of interest (se også afsnit 3 og 4 i protokollen beskrevet ovenfor).

På flade overflader, celler viser heterogene reaktioner og ekstreme fænotyper af cellulære organeller. Faktisk er det blevet foreslået, at actin stress fibre (og andre cellulære organeller) er artefakter af dyrkningsbetingelserne 1. For at bevise denne hypotese, vi dyrkede NIH3T3 celler både på 3D 'æggebægre "og på flade overflader og sammenlignede de fænotyper af forskellige cellulære organeller, nemlig actin stress fibre, Golgi-apparatet og kerner. Figur 3 viser et eksempel på, hvordan celler er organiseret på begge konfigurationer. I EF cellerne fordelt i en ordnet array der viser en homogen sfærisk-lignende fænotype (figur 3a). På flade overflader, celler viser den typiske uordnede, spredning og heterogen morfologi (figur 3b). Der er også betydelige forskelle i cytoskeleton strukturer. Især celler på R16, æggebægre 'viser en reduktion i antallet af stress-fibre sammenlignet med plane overflader. Dette bekræftes yderligere i 3D rekonstruerede billeder, hvor ingen klare stress fibre er synlige (se figur 3c - d). Dette bekræfter, at nogle cellulære strukturer er forstørret i 2D kulturer. Dette er også i overensstemmelse med observationer udføres in vivo, hvor ikke kan identificeres stress fibre.

Golgi-apparatet viser også betydelig variation i deres fænotype afhængig af dyrkningsbetingelser (se figur 4). Den Golgi apparatet på 2D kulturer viser typisk en udvidet fænotype "omfavne" kernen periferien mens det i 'æggebægre' det viser en mere komprimeret fænotype (se figur 4a - b). For at simulere et lægemiddel screening manipulation, vurderede vi også virkningen af ​​lægemidler på celler dyrket på begge miljøer. Vi valgte Blebbistatin mainly, fordi det forstyrrer de aktin stress fibre og kunne have en effekt på Golgi morfologi (se figur 3c - d). Da Golgi er placeret ud til cellekernen, kunne dette stof også have en effekt på dens arkitektur. Vi først observeret, at celler behandlet med dette lægemiddel viste en mindre regelmæssig og ensartet morfologi sammenlignet med vildtype (WT) -celler (se figur 3c - d). Vi derefter sammenlignet og kvantificeret Golgi fænotype observeret på 'æggebægre' og på plane flader (se figur 4c). Vi bemærkede, at på 2D overflader celler viste det meste en udvidet fænotype henviser til 'Æggebægre' celler viste en mere komprimeret fænotype. Vi har ikke observere selv en slående forskel mellem WT og Blebbistatin-behandlede celler.

Endelig vedrørende 2D overflader cellekernen er tilfældigt orienteret henviser til celler i EF den er ortogonalt orienteret i forhold til XY-planet i bådeWT og Blebbistatin behandlede celler (se figur 5a - c). Dette understreger styrken af indretningen at orientere cellulære organeller, der ligner en tidligere anvendelse af fremgangsmåden til orientering af planet for observation af cytokinetic ring i gær og mammale celler 10,12,13. Vi endelig undersøgt, hvordan kernen kugleform (defineret som ψ = [π 1/3 6V n2 / 3] / A n, hvor V n er rumfanget af kernen og A n dens overfladeareal) er påvirket afhængigt af dyrkning tilstand og ved behandling af celler med Blebbistatin. Figur 5d viser de tilsvarende fordelinger af ψ. Vi har ikke observere en forskel for WT flad vs WT EF, som afslører, at EF ikke påvirker den normale kugleform af celler. Men vi observeret enforskel, når man sammenligner WT EF Blebb EF antyder, at EF afslører en reel virkning af lægemidlet, der er maskeret i 2D.

Levende celler studier med anvendelse af 'æggebægre' tillader også identifikation af nye aktive processer som ikke er synlige i standard kulturer. Vi belagte celler i EF og visualiseret celledeling. Figur 6 viser en sekvens af billeder af cytokinetic ringslutning under cellemitose. Den "æggebægre 'enhed giver en komplet visualisering af ringen, hvorimod standard 2D kulturer viser kun to områder, der svarer til en enkelt plan 10. Rekonstruktion af ringen fra en sekvens af z-stack billeder ved hjælp 2D kulturer kan gøres 27, men vigtige informationer går tabt. Kvaliteten er formindsket på grund af lav z opløsning og dynamiske processer kan ikke løses. Actin og myosin er de vigtigste proteiner i kraft generation af celledeling. Deres dynamik kan ikke be afbildet og studeret i 2D kultur (figur 6a), hvorimod med 'æggebægre' det straks afsløret. Vi har identificeret nye strukturer og processer: i HeLa-celler finder vi periodiske ophobninger af myosin 17. Disse ophobninger bevæges radialt som ringen afsluttes (figur 6b). I fission gær vi også finde inhomogeniteter i myosin og actin (figur 6c, højre) 17. I modsætning til hvad vi ser i HeLa-celler, de roterer på ringen under lukningen. Hastigheden er i området um min -1 og ville ikke være løses ved z rekonstruktion med standard mikroskoper. Endelig cytokinetic ring kan yderligere undersøgt ved farvning for dets komponenter. Vi finder, at der er en akkumulering af phosphotyrosin i nærheden af ringen (fig 6d). Vi kan også vise, at anillin er colocalizing i ringen (fig 6e). Ved farvning af cellerne i denne orientering, we afslører, at anillin viser også en uhomogen fordeling.

De "eggcups" blev også anvendt til forskellige modelsystemer: Vi rapporterede pattedyrceller, fission gær, men vi også testet spirende gær og C. elegans (se figur 7a - e). I dette tilfælde blev protokollen tilpasset til hvert enkelt system med hensyn til dyrkningsmedier, hulrum størrelse og morfologi (se tabel 1). Som et eksempel, konisk V -formede »eggcups« var den optimale morfologi til immobilisering fission gær effektivt 12, i stedet for helt cylindrisk (eller U-formet) Former anvendes til mammale celler 13. Dette tillod at teste effekten af ​​forskellige cytoskeleton lægemidler med potentiel anvendelse i Life Science forskning. Dette demonstrerer fleksibilitet og pålidelighed af den udviklede metode.

Endvidere stærkt ordnet arrangement af celler tillader enlet, automatiseret udlæsning af fluorescensen af ​​enkeltceller. Vi illustrerer dette ved at indsætte NIH3T3 celler, der udtrykker GFP i »eggcups '(figur 8a). Cellen position kan let genkendes, og den tilsvarende ekspressionsniveau måles. Figur 8b viser fordelingen af fluorescenssignaler. Dette kan anvendes på enhver udlæsning (immunfluorescens, fluorescerende reportere i celler for eksempel).

figur 1
Figur 1: Fremstilling af 'æggebægre' (a) Skematisk beskrivelse af proceduren fabrikation af 'æggebægre' ved replica støbning:. (I) Hæld flydende PDMS på SU-8 mug og helbrede den. (Ii) Klip stempel og fjern det forsigtigt fra overfladen, så plasma aktivere den for at silanize det. (Iii) Hæld flydende PDMS på silaniseret stempel end centrifugeres det at opnå et tyndt PDMS lag. (Iv) Efter hærdning PDMS lag, plasma aktivere begge, dækkede PDMS stempel og et dækglas. (V) Plasma binder både ved at anvende en blid, homogen tryk. (Vi) Efter plasma bonding, fjern forsigtigt stemplet at afdække den "æggebægre 'overflade. (Vii) For at forenkle håndteringen i de næste skridt, tilsættes en lille PDMS håndtag stykke. Bind PDMS brik til dækglasset ved at lime det med flydende PDMS og (viii) helbrede det derefter i ovnen. (B) Billede af en 25 mm dækglas med PDMS 'æggebægre' og et håndtag. (C) Scanning elektronmikroskop billeder af PDMS 'æggebægre'. Afstanden mellem centre 'æggebægre' er 30 um, og deres diameter omkring 25 um. (Venstre) Set ovenfra. (Højre) "Æggebægre" skæres til billedet den indre del. Klik her for at vie wa større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: (a) har behov for til EF påfyldning. (1) 50 ml rør; (2) cylindriske stykke (top og side view); (3) cellekulturmedium; (4) "æggebægre"; (5) skarpe pincet. (B) Skematisk for EF fyldet. (I) En cylindrisk stykke er først indført i et 50 ml rør og fyldes med 13 ml cellekulturmedium. Næste, (ii) de "eggcups« forsigtigt aflejres på toppen af ​​det cylindriske stykke ved hjælp skarpe pincet til at manipulere EF med den lille PDMS stykke. (Iii) celler ved den korrekte densitet pipetteres på toppen af ​​EF. (Iv) Celler indført i de "æggebægre 'af centrifugering. (V) Endelig er prøven forsigtigt frigjort ud fra røret, og det er klar til brug. m / filer / ftp_upload / 51880 / 51880fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: Sammenligning af celle fænotyper på 3D 'æggebægre' og 2D flade overflader. Konfokal mikroskopi (25X vand mål, 0,95 NA, Leica) billede af NIH3T3 celler på (a), EF udgør et ordnet array, og viser en homogen sfærisk fænotype, og på (b) standard 2D flad kultur, tilfældigt fordelt med heterogene fænotyper. Celler blev farvet for actin (i grønt), Golgi (i orange) og kerne (i blåt). Scale barer = 100 um. (C) 3D rekonstruktion af celler på EF og (d) på flade overflader for WT og Blebbistatin-behandlede celler. Scale barer = 20 pm.880 / 51880fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4: Undersøgelse af NIH3T3 Golgi apparatet fænotype Skematisk og prøve billede af Golgi fænotype klassificering for celler på (a) flad og (b), EF.. Celler blev klassificeret som komprimeret, forlænget eller fragmenterede afhængig af α-værdi. (C) Kvantificering af Golgi fænotyper. Scale barer = 10 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5: (a) (Venstre) Konfokal mikroskopi billede af en NIH3T3 celle inde i en EF og farves til actin (i grønt), Golgi (i orange) og kerne (i blåt). (Højre) Ordning af kerner orientering inde EF. (B) vinkelfordeling af kerner inde EF for WT og (c) Blebbistatin-behandlede celler. (D) Nucleus kugleform værdier for WT og Blebbistatin-behandlede celler for både EF og flade overflader (P [WT EF -Blebb EF] <0,001, P [Blebb flad -Blebb EF] <000,1, n WT flad = 47, n WT EF = 94, n Blebb flad = 59, n Blebb EF = 141 celler). Scale bar = 10 um. Klik her for at se en større version af dette tal.


Figur 6: Detaljeret undersøgelse af cytokinetic ring i levende og faste prøver og i to systemer, der anvender "æggebægre '(a) Time sekvens af cytokinetic ring ved hjælp af standard 2D in vitro kultur.. Kun to lyspunkter i actin (Lifeact-mcherry, rød) og myosin (GFP tagged, grøn) er synlige i spaltningen fure af HeLa-celler (Scale bar = 10 um). (B) Tid sekvens af lukningen for cytokinetic ring i HeLa celler under mitose hjælp "æggebægre '. Billederne viser actin (i rødt) og myosin (grøn). 'Æggebægre' muliggøre identifikation af stadig myosin ophobninger. Et eksempel er fremhævet med en pilespids. (Scale bar = 5 um). (C) cytokinetic ring kan også visualiseres i fission gær. (Venstre) Celler ligge på en flad overflade, den cyto kinetisk ring er kun synlig som to prikker (højre) Celler i 'æggebægre':. hele lukning kan optages. Actin er mærket med CHD-GFP (Scale barer = 2 um). Tid i min: sek. (D - e) Eksempler på farvede cytokinetic ringe. (D) Actin-GFP udtrykkende HeLa-celler farvet for phosphotyrosin (PY), som også viser signalet i ringen (Scale bar = 5 um). (E) HeLa celler, der udtrykker GFP tagged myosin og Lifeact-mcherry (actin) er farvet for anillin. Anillin er afsløret at lokalisere i cytokinetic ring og mindre koncentreret i cortex. Den viser co-lokalisering med actin og myosin (Scale bar = 5 um). Klik her for at se en større version af dette tal.

80 / 51880fig7.jpg "/>
Figur 7:. Anvendelse af 'æggebægre' til andre celletyper og modelsystemer (a) U2OS (human osteosarkom). Det indsatte viser en skillelinje celle. (Scale bar = 20 um). (B) NIH3T3-celler, der udtrykker GFP. Forskel i ekspressionsniveauerne let kan udlæses (Scale bar = 20 pm). (C) SW480 celler (Scale bar = 20 pm). (D) knopskydende gær; deres cyklustid er uændret. (Scale bar = 10 um). (E) C. elegans orme,. (Venstre) på en flad overflade (højre) I 'Æggebægre «, er embryo set fra en ellers skjult perspektiv. (Scale barer = 10 um). Tid i min:. Sec Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 8 Figur 8: Organisationen i en vifte af 'æggebægre' giver en automatiseret analyse af celle population (a) NIH3T3 celler i EF (Skala bar = 20 pm).. De har forskellige ekspressionsniveauer af GFP. (B) Automatiseret anerkendelse af celle stilling tillader en individuel analyse af ekspressionsniveauet. Det er sammenfattet i histogrammet af GFP udtryk for cellepopulationen. Klik her for at se en større version af dette tal.

model System Type dyrkningsmedium Observation Medium 'Æggebægre' diameter (μM) Kommentarer / Beskrivelse
pattedyrceller NIH3T3 10% BCS high-glucose DMEM 10% BCS L-15 20 Andre stabile cellelinier, såsom REF52 eller MDCK samt primære cellelinier, cancerceller og / eller stamceller kan også indsættes i de æggebægre «.
HeLa 10% FCS high-glucose DMEM 10% FCS L-15 25 Tilgængelig fra mange forskellige kilder.
U2OS 10% FCS high-glucose DMEM 10% FCS L-15 20-25 Tilgængelig fra mange forskellige kilder.
SW480 10% FCS high-glucose DMEM 10% FCS L-15 17-20 Tilgængelig fra mange forskellige kilder.
Gær fission Gær Agarplade (YE5S) og flydende medier (YE5S og EMM5S) Filter steriliseret EMM medier (se listen af ​​materialer) 5 Overfladen behøver ikke at være funktionaliseret med adhæsive proteiner.
knopskydende gær Agarplade (YPD) og flydende medier (YEPD og SD) SD media 5 Overfladen behøver ikke at være funktionaliseret med adhæsive proteiner.
Foster C. elegans NGM plade ultrarent vand 25 Alternativt M9 medium kan bruges til langsigtede eksperimenter. Opskriften af ​​denne saltet løsning kan findes her: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2009/5/pdb.rec11798.full?text_only=true

Tabel 1: Kultur forhold i 'æggebægre' til forskellige modelsystemer. Den ovenfor relaterede protokol kan let tilpassesved blot at erstatte de beskrevne dyrkningsbetingelser og størrelsen af ​​'æggebægre «.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Replika støbning blev anvendt for at fremstille de »æggebægre«. Fremstillingsprocessen behøver ikke et rent værelse; det er let og enkelt, selv om der kan være behov nogle praksis. Især frigiver PDMS stempel er den mest kritiske trin for at frembringe et stort område af høj kvalitet 'æggebægre «. Af denne grund, særlig pleje skal tages i dette trin. Hvis dette trin gentagne gange ikke, overveje at optimere plasma renere parametre forud for silaniseringen og plasmabinding. Utilstrækkelig silanisering vil føre til kraftig stikning af stempel til PDMS filmen. Hvis dette observeres, kan inkubationstiden med silanizing reagens forøges. Bemærk, at der kan anvendes andre teknikker og materialer til at fremstille de »eggcups", som kan funktionaliseres med et stort udvalg af ligander (fibronectin, gelatine, collagen, etc.). Især kan mikrokaviteter i polystyren let fremstilles ved custom-gjort hot-prægning teknik. Dette sikrer biokompatibilitet og direkte sammenligning med resultater opnået i standard dyrkningsskåle. Tilsvarende er særlig omsorg og der kræves for at optimere den procentvise påfyldning. Især skylletrin er kritisk for at sikre en passende fyldning uden overskud af celler, der bidrager til støj og baggrund i signalet. Hvis celler fjernes let fra hulrum, overveje at ændre størrelsen eller dybden af ​​hulrum.

»Æggebægre 'provide 3D-lignende arkitektur til celler og højinformativ screeningsassays hjælp af en simpel protokol. Cellulære organeller og aktive processer ukendte anvendelse af standard kultur assays kan let visualiseres ved hjælp af indsættelse af enkelte celler på individuelle mikrohulrum ( 'æggebægre'). Afhængig af modellen systemet, kan den størrelse, form og deres dimensioner let tilpasses. På denne måde pattedyrceller, fission gær, knopskydende gær og C. elegans cen manipuleres og studeret, samt eventuelle embryoner såsom Drosophila, mus eller menneskelige embryoner til in vitro-befrugtning, eller stamceller for eksempel.

I denne opsætning enkeltceller fanges. Dette er i modsætning til epitelvæv stødt in vivo. Imidlertid kunne dette miljø gengives i vores 'æggebægre' ved belægning sidevæggene med cadheriner at efterligne celle-celle-kontakter ved hjælp af mere fleksible elastomerer. Focal kontakter vil blive fremmet af aflejring af fibronektin i bunden af ​​brønde. Disse respektive fordelinger af adhæsionsmolekyler bør tillade at reproducere de cellulære miljøer stødt in vivo. Ved denne fremgangsmåde ville man nærme de fysiologiske betingelser.

Mediumudskiftning i vores assay er sikret. Celler i EF ikke viser nogen forringelse, når du udfører både kort- og langsigtede eksperimenter på grund af manglende medium udveksling. Bemærk også, at celler i EF can dyrkes indtil sammenløb selvom hovedinteresse er når enkelte celler eller embryoer isoleres inde i hulrummene.

Orientering af organeller eller hele organismer er afslørende nye oplysninger. Vi viser forskellige dynamik actin og myosin i cytokinetic ring. Selvom den cytokinetic ring i fission gær og mammale celler er sammensat af lignende nøglekomponenter, viser vi med dette setup, at deres specifikke dynamik er anderledes 17. Dette støtter det resultat, at lukkemekanismen i de to systemer er forskellige. At udvikle og undersøge sådan hypotese, at orienteringen af ​​cellen er uundværlig. I fremtidige studier, kan denne enhed også bruges til at undersøge andre begivenheder relateret til organel organisation i celler.

Ud over, at kan denne teknik være til stor nytte i udviklingsmæssige biologi. Aflange embryoner kan let orienteres, observeres eller behandles yderligere i en defineret orientering.Sandsynligvis vores assay ville ikke pålægge polaritet af embryoner, men den høje påfyldning procentdel ville tillade at ekstrahere det ønskede udlæsning på en pålidelig måde. Helt »eggcups 'kunne være en god indretning til højinformativ screeninger.

Der er foreslået andre kultur assays. Disse metoder spænder fra flere celler i 2D dimensioner i flerbrøndsplader, til enkelte celler deponeret i mikromønstrede klæbende motiver med identisk form. Men ingen af dem er hensigtsmæssigt at overvinde de begrænsninger, der er beskrevet ovenfor, på observation af cellulære organeller og dynamiske processer 1.

Fremtidige forbedringer af vores system vil gøre det muligt anvendeligheden af ​​'æggebægre' to industri-orienterede formål. Som et eksempel, lægemiddelscreening applikationer i farmaceutiske virksomheder kræver anvendelse af flerbrøndsplader 14,28; gennemføre 'æggebægre' i sådanne platforme vil potentielt forbedre pålideligheden aftest og resultater. Som sådan høje indhold-screening-assays vil blive udført ved hjælp af de almindeligt anvendte automatiserede processer medicinalfirmaer (og akademiske forskningslaboratorier) ved hjælp af robotter. Dette vil sikre repeterbarhed og pålidelighed med lav variabilitet. Nogle kommercielle produkter baseret på 3D-celle dyrkede analyser har allerede optrådt i markedet at fremhæve betydningen af ​​denne slags analyser. Endelig disse enheder åbne nye perspektiver for skræddersyet medicin: celler fra patient kunne placeres i 'æggebægre ", og behandling cocktails kunne testes i et fysiologisk miljø; biomarkøren udlæsning vil tillade at foregribe en optimal behandling, der skal gives til patienten 29. Alt i alt den fysiske form af celler og embryoner vejledende arkitekturen af ​​hulrummene, og vi håber, at enheden og denne metode vil blive udbredt i fremtiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi anerkender L. Brino (IGBMC High Content Screening facilitet, Illkirch, Frankrig) for at give os den anti-Giantin antistof, M. Labouesse Lab. for C. elegans (IGBMC) og B. Seraphin Lab. til spirende gær (IGBMC), E. Paluch og A. Hyman for fluorescerende HeLa-celler (MPI-CBG, Dresden), J. Moseley (Dartmouth Medical School) og JQ Wu (Ohio State University) for fission gærceller; A. Hoel og F. Evenou til eksperimentel hjælp, C. Rick (IBMC, Strasbourg, Frankrig) for teknisk hjælp, og JC Jeannot (Femto-st, Frankrig) om hjælp til mikrofabrikation. Dette arbejde blev støttet af midler fra CNRS, University of Strasbourg, Conectus, La Fondation pour la Recherche Médicale og ci-FRC Strasbourg.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ddH20 (ultrapure) Millipore - Use always fresh water.
Parafilm (plastic film) Bemis PM-999 Adhere Parafilm to the lab bench using some water droplets and ensure a perfect surface flatness.
Photo-mask Selba - http://www.selba.ch
Silicon wafer Siltronix - http://www.siltronix.com/
SU-8 photoresist MicroChem 2000 series http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm 
working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information.
SU-8 developer MicroChem - http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm 
working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information
2-propanol Sigma-Aldrich 19030 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en&region=CA
Available from multiple companies.
Sigmacote (siliconizing reagent ) Sigma-Aldrich SL2-25ML http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr&region=FR 
harmful, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. 
Chlorotrimethylsilane (TMCS) Sigma-Aldrich 386529-100ML http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr&region=FR  
TMCS produces acute inhalation and dermal toxicity, and is highly flammable (with ignition flashback able to occur across considerable distances), consequently it should be used in a fume cupboard away from sources of ignition
Nitrile gloves Kleenguard 57372 http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m
Available from multiple companies.
Glass coverslips #0 Knittel glass KN00010022593 http://www.knittelglass.com/index_e.htm
Very fragile. Manipulate gently.
Sharp straight tweezers SPI 0WSSS-XD http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7
50 ml tube BD Falcon 352070 http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp
Available from multiple companies.
PDMS Dow Corning Sylgard 184 kit http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx?R=131EN 
The package contains both PDMS base and curing agent. Similar elastomers are available from multiple companies.
Microscope glass slides Dutscher 100001 http://www.dutscher.com/frontoffice/search
Available from multiple companies.
DMEM high-glucose medium Fisher Scientific 41965-039 http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?LBCID=12301479&keyWord=41965-039&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
Bovine calf serum Sigma-Aldrich C8056-500ML http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en&region=CA
0.25% Trypsin-EDTA Fisher Scientific 25200-072 http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
PBS 1x Fisher Scientific 14200-067 http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
PBS is at 10x and should be diluted to 1x using ddH2O
L-15 medium Fisher Scientific 21083-027 http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
Medium for atmospheres without CO2 control
Fibronectin  Sigma-Aldrich F1141-5MG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=F1141-5MG&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Penicillin & Streptomycin Fisher Scientific 15140-122 http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=CHEM
Petri dish P35 Greiner 627102 http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/
Petri dish P60 Greiner 628163 http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/
Petri dish P94 Greiner 633179 http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/
Paraformaldehyde 3 % Sigma-Aldrich P6148-500G http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr&region=FR 
Harmful in-particular for the eyes, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information.
Triton 0.5 % Sigma-Aldrich 93443-100ML http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=93443-100ML&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Phallodin-Green Fluorescent Alexa Fluor 488 InVitrogen A12379 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379?CID=search-a12379 
dissolve powder in 1.5 ml methanol
Alexa Fluor 647 InVitrogen A21245 1:200 dilution in PBS 1x
rabbit polyclonal anti-Giantin Abcam ab24586 1:500 dilution in PBS 1x
http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html 
rabbit anti-anillin Courtesy of M. Glotzer, Published in Piekny, A. J. & Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin, and myosin during cytokinesis. Current biology 18, 30–6 (2008). 1:500 dilution in PBS 1x
Anti-phosphotyrosine Transduction Lab 610000 http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000
Cy3 goat anti-rabbit  Jackson Immunoresearch 111-166-047 http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp 
1:1,000 dilution in PBS 1x
DAPI Sigma-Aldrich D8417  http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr&region=FR 
1 mg/ml for 1 min
Glycerol Sigma-Aldrich G2025 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=G2025&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Mineral oil Sigma-Aldrich M8410-500ML http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=M8410-500ML&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
HeLa cells - - Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1
NIH3T3 cells ATCC - Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1
Fission yeast  - - For details on strains, contact the corresponding author.  See also Table 1
C. elegans worms - - For details, contact the corresponding author.  See also Table 1
YES (Agar) + 5 Supplements included MP Biomedicals 4101-732 http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&s=Search 
For preparation: follow  instructions as given on the box
YES (Media) + 5 Supplements included MP Biomedicals 4101-522 http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&s=Search 
For preparation: follow the instructions as given on the box
EMM (Media) MP Biomedicals 4110-012 http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&s=Search 
For preparation: follow  instructions as given on the box
Filter sterilized EMM (Media) - Only for imaging MP Biomedicals 4110-012 For preparation: follow instructions as given on the box. Filter sterilize the media using a 0.22 µm filter instead of autoclaving. This gives transparency to the media and reduces the autofluorescence.
Supplements (for EMM) MP Biomedicals 4104-012 http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&s=Search
 (Add 225 mg/L into the EMM media before autoclaving or filtering)
Stericup and Steritop Vaccum driven sterile filters Millipore - http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&tab1=2&tab2=1#tab2=1:tab1=2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
  2. Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Thery, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab Chip. 9, 1640-1642 (2009).
  3. Mandal, K., Balland, M., Bureau, L. Thermoresponsive Micropatterned Substrates for Single Cell Studies. PLoS ONE. 7, e37548 (2012).
  4. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
  5. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J Cell Sci. , (2012).
  6. Ghibaudo, M., Di Meglio, J. M., Hersen, P., Ladoux, B. Mechanics of cell spreading within 3D-micropatterned environments. Lab Chip. 11, 805-812 (2010).
  7. Greiner, A. M., Richter, B., Bastmeyer, M. Micro-Engineered 3D Scaffolds for Cell Culture Studies. Macromol Biosci. 12, 1301-1314 (2012).
  8. Khetan, S., et al. Degradation-mediated cellular traction directs stem cell fate in covalently crosslinked three-dimensional hydrogels. Nat Mater. 12, 458-465 (2013).
  9. Legant, W. R., et al. Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices. Nat Meth. 7, 969-971 (2010).
  10. Devices and methods for observing the cell division. Riveline, D., Buguin, A. , WO/2010/092116 (2010).
  11. Ochsner, M., et al. Micro-well arrays for 3D shape control and high resolution analysis of single cells. Lab Chip. 7, 1074-1077 (2007).
  12. Devices and methods for observing cells with cell wall or invertebrate embryos with oblong eggshell . Riveline, D. , WO2013144302 (2012).
  13. Devices and methods for observing eukaryotic cells without cell wall. Riveline, D., Wollrab, V. , WO2013135809 (2012).
  14. Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotech. 28, 237-245 (2010).
  15. Wolfe, D., Qin, D., Whitesides, G. Microengineering in Biotechnology, Ch 3. Methods in Molecular Biology. Hughes, M. P., Hoettges, K. F. 583, Humana Press. 81-107 (2010).
  16. Mehling, M., Tay, S. Microfluidic cell culture. Curr Op Biotech. 25, 95-102 (2014).
  17. Wollrab, V., Thiagarajan, R., Wald, A., Kruse, K., Riveline, D. Still and rotating myosin clusters determine cytokinetic ring constriction. Nat Commun. 7, 11860-11869 (2016).
  18. Yao, X., et al. Functional analysis of single cells identifies a rare subset of circulating tumor cells with malignant traits. Integr Biol. 6, 388-398 (2014).
  19. Eberwine, J., Sul, J. Y., Bartfai, T., Kim, J. The promise of single-cell sequencing. Nat Meth. 11, 25-27 (2014).
  20. Allen, T. D., et al. Generation of cell-free extracts of Xenopus eggs and demembranated sperm chromatin for the assembly and isolation of in vitro-formed nuclei for Western blotting and scanning electron microscopy (SEM). Nat. Protocols. 2, 1173-1179 (2007).
  21. Robbins, E., Marcus, P. I. Mitotically Synchronized Mammalian Cells: a Simple Method for Obtaining Large Populations. Science. 144, (1964).
  22. Whitfield, M. L., et al. Stem-loop binding protein, the protein that binds the 3" end of histone mRNA, is cell cycle regulated by both translational and posttranslational mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 20, (2000).
  23. Straight, A. F., et al. Dissecting Temporal and Spatial Control of Cytokinesis with a Myosin II Inhibitor. Science. 299, 1743-1747 (2003).
  24. Tang, J., Erikson, R. L., Liu, X. Checkpoint kinase 1 (Chk1) is required for mitotic progression through negative regulation of polo-like kinase 1 (Plk1). Proc Natl Acad Sci. 103, 11964-11969 (2006).
  25. Zahreddine, H., Zhang, H., Diogon, M., Nagamatsu, Y., Labouesse, M. CRT-1/Calreticulin and the E3 Ligase EEL-1/HUWE1 Control Hemidesmosome Maturation in C. elegans Development. Curr Biol. 20, 322-327 (2010).
  26. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. JoVE. , e4019 (2012).
  27. Saha, S., Pollard, T. D. Anillin-related protein Mid1p coordinates the assembly of the cytokinetic contractile ring in fission yeast. Mol Biol Cell. 23, 3982-3992 (2012).
  28. Prestwich, G. D. Evaluating Drug Efficacy and Toxicology in Three Dimensions: Using Synthetic Extracellular Matrices in Drug Discovery. Acc Chem Res. 41, 139-148 (2007).
  29. Futamura, Y., et al. Morphobase, an Encyclopedic Cell Morphology Database, and Its Use for Drug Target Identification. Chem Biol. 19, 1620-1630 (2012).

Tags

Bioengineering mikrokaviteter Replica Molding mikrofabrikation High-indhold screening 3-dimensioner enkelte celler Nucleus Golgi Cytokinetic Ring.
Bestilling enkelte celler og Single Embryoner i 3D Indespærring: En ny enhed for High Content Screening
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wollrab, V., Caballero, D.,… More

Wollrab, V., Caballero, D., Thiagarajan, R., Riveline, D. Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening. J. Vis. Exp. (115), e51880, doi:10.3791/51880 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter