Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

הזמנת תאים בודדים עוברים יחיד מאסר 3D: התקן חדש עבור הקרנת תוכן גבוהה

Published: September 18, 2016 doi: 10.3791/51880
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Laboratory of Cell Physics, Institut de Science et d'Ingénierie Supramoléculaires (ISIS), CNRS and Université de Strasbourg, 2Development and Stem Cells Program, Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire (IGBMC), CNRS and Université de Strasbourg

Summary

אנו מדווחים על מכשיר שיטה חדשה ללמוד תאי עוברים. תאים בודדים מסודרים דווקא מערכי microcavity. כליאת 3D שלהם היא צעד לקראת סביבות 3D נתקלו בתנאים פיסיולוגיים מאפשרת התמצאות אברון. על ידי שליטת צורת תא, התקנה זו ממזערת השתנות שדווחה מבחני תקן.

Abstract

תאים ביולוגיים בדרך כלל הם נצפו על משטחים שטוחים (2D). מצב זה אינו פיסיולוגי, פנוטיפים וצורות הם משתנים מאוד. הקרנה מבוססת על תאי בסביבות כאלה ולכן יש מגבלות חמורות: אברונים בתא להראות פנוטיפים קיצוניים, מורפולוגיה תא וגדלים הם אברונים בתא הטרוגנית ו / או ספציפיים לא ניתן מדמיינים כמו שצריכים. בנוסף, תאים in vivo ממוקמים בסביבת 3D; במצב זה, תאי להראות פנוטיפים שונים בעיקר בשל האינטראקציה שלהם עם מטריקס שמסביב של הרקמה. על מנת לתקנן וליצור סדר תאים בודדים בסביבת 3D-רלוונטי מבחינה פיזיולוגית עבור מבחני מבוססי תאים, אנו מדווחים כאן את microfabrication ויישומים של מכשיר תרבית תאים במבחנה 3D. מכשיר זה מורכב מערך 2D של microcavities (בדרך כלל 10 5 חללים / 2 סנטימטר), כל אחת מהן מלא עם תאים או עובר יחידים. posi הניידtion, צורה, קוטביות וארגון תא פנימי להיות אז מנורמל מראה ארכיטקטורה 3D. השתמשנו העתק דפוס דפוס מערך של microcavities, 'eggcups', על גבי polydimethylsiloxane דק (PDMS) שכבת דבק על coverslip. חללים היו מכוסים פיברונקטין כדי להקל הידבקות. תאים הוכנסו על ידי צנטריפוגה. אחוז המילוי היה מותאם עבור כל מערכת המאפשרת עד 80%. הכדאיות תאים ועוברים אושרה. יישמנו מתודולוגיה זו ההדמיה של אברונים הסלולר, כגון מכשירים בגרעין Golgi, וכדי ללמוד תהליכים פעילים, כגון סגירת טבעת cytokinetic במהלך מיטוזה תא. מכשיר זה אפשר זיהוי של תכונות חדשות, כגון הצטברויות תקופתיות inhomogeneities של שרירן יקטין במהלך סגר טבעת cytokinetic פנוטיפים דחוסים עבור Golgi ויישור גרעין. אנחנו שאפיינו את השיטה עבור בתאי יונקים, שמרים ביקוע, שמרים ניצנים, ג elegans wההסתגלות הספציפית ה- i בכל מקרה. לבסוף, המאפיינים של המכשיר הזה ולהפוך אותו המעניין במיוחד עבור מבחני הקרנת סמים ותרופות אישיות.

Introduction

נוכח מבחנים במבחנה מבוסס תאים הם דו ממדים (2D). תצורה זו אינה טבעית עבור בתאי יונקים ולכן הוא לא רלוונטי מבחינה פיזיולוגית 1; תאים להראות מגוון של צורות, גדלים פנוטיפים הטרוגנית. הם מציגים מגבלות חמורות נוספות כשהוא מיושם על אפליקציות הקרנה, כגון חלוקת סדר בתוך המטוס פנוטיפים הקיצוני של אברונים הסלולר (סיב מתח, בפרט). הדבר חשוב במיוחד בניסויים קליניים עבור בדיקות סמים, שם תקציבים גבוהים מושקעים מדי שנה. רוב התרופות האלה נכשלים אף כאשר מוחלים על מודלים של בעלי חיים, בשל מצבו תרבות 2D המלאכותי בשלבים מוקדמים של הקרנת סמים. בנוסף, על ידי שימוש בגישה זו, אברונים תאים ספציפיים לא ניתן דמיינו כמו שצריך, כמו טבעת actomyosin cytokinetic במהלך מיטוזה התא, ובאופן כללי מבנים מתפתחים במישור הניצב למישור של התבוננות. כמהמבחני 2D חדשות הוצעו על מנת להתגבר על החסרונות הנ"ל תובנות חשובות על ארגון cytoskeleton נצפו 2,3. עם זאת, מבחנים אלה עדיין קיימים מגבלה רצינית אחת: תאים מראים פנוטיפ מאוד התפשטות בניגוד למה שרואה in vivo, שבו תאים להציג ארכיטקטורת 3D. ממצאים אלה הקשורים שיטת התרבות עשויים לגרום לתכונות הלא פיסיולוגיות כגון סיבי מתח משופרים 1,4,5.

תלת ממד תא מבחני תרבות לספק יתרונות מרובים בהשוואת 2D סביבות 6,7. הם פיסיולוגיים רלוונטיים יותר, ותוצאות הן אפוא משמעות. כדוגמא, תאים המוטבעים הידרוג להראות מבני 3D דמוי אבל המורפולוגיות שלהם שונות מתא אחד 8,9 אחר. עם זאת, מורפולוגיות שלהם שונה מתא אחד למשנהו, אשר מסבך יישומים ההקרנה. אסטרטגיה חלופית היא להטביע יחידתאי חללי microfabricated 10,11. בעמדה תא, צורה, קוטביות וארגון תא פנימי אז יכול להיות מנורמל. מלבד מתן ארכיטקטורה דמוי 3D לתאים, microcavities גם מאפשר ללימודים גבוהים הקרנת תוכן 10,12-14; תאים בודדים ניתן להזמין אל microarrays האברונים הסלולר ההתפתחויות שלהם ניתן לצפות במקביל. סדירות זה מספקת נתונים סטטיסטיים טובים עם מספר נמוך של תאים והחלטות זמניות / מרחבית טובות יותר. תרכובות שימושיות קלות יותר לזיהוי באופן מהימן.

במחקר זה, אנו מציגים את ייצור ויישום של מערכת התרבות תאים בודדים 3D-כמו חדש עבור יישומים עתירי תוכן ההקרנה 10,12,13. המכשיר מורכב מערך של microcavities אלסטומרי (10 5 חללים / 2 ס"מ), שטבע "eggcups '(EC). מידות נפח כולל של EC בעבודה זו מותאמות להיקף הטיפוסי של תאי NIH3T3 והלה פרטבעת חלוקת התא. מורפולוגיה של החללים - גלילי - נבחרה לכוון תא צורה כראוי ההדמיה של תהליכים פעילים. דפוס העתק משמש תבנית מערך של EC גבי polydimethylsiloxane דק (PDMS) שכבת דבק על כוס coverslip 15,16. תאים הם הציגו את EC על ידי צנטריפוגה. אנו מדווחים כאן תצפית ונורמליזציה של אברונים הסלולר (סיבי אקטין מתח, מערכת גולג'י והגרעין) ב -3 D (EC) בהשוואה אותם תאים על 2D (שטוח) משטחים. כמו כן, אנו מדווחים על התצפיות של תהליכים דינמיים פעילים כגון סגירת טבעת actomyosin cytokinetic במהלך התא מיטוזה 17. לבסוף, אנו מציגים תוצאות של מתודולוגיה זו על מערכות אחרות עם קירות נוקשים, כגון שמרים ניצנים, שמרים ביקוע ו- C. עובר elegans אשר מאשרת את תחולתה של המתודולוגיה שלנו מגוון רחב של מערכות מודל.

בשלב הבא אנו מציגים p מפורט וממצהrotocol כדי לפברק ולהחיל את 'eggcups' עבור microfabrication 3D. הגישה שלנו היא פשוטה ואינו זקוק לחדר נקי. אנו צופים כי מתודולוגיה חדשה זו תהיה מעניינת במיוחד עבור מבחני הקרנת סמים ותרופות אישית, החלפה של צלחות פטרי. לבסוף, המכשיר שלנו יהיה שימושי לחקר ההפצות של תגובות תאים לגירויים חיצוניים, למשל סרטן 18 או במחקר בסיסי 19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. microfabrication של 'Eggcups'

  1. המצאה של המאסטר: Array microcavities
    1. מחממים פרוסות סיליקון '3' עד 200 מעלות צלזיוס להתאדות כל נוכחות של לחות.
    2. ספין-מעיל שכבה דקה של photoresist SU-8. כוון את עוצמת הקול של מהירות שרף ספינינג בהתאם לסוג עובי photoresist הרצוי. עובי זה יכתיב את העומק של 'eggcups' (EC). עבור שכבה 30 מיקרומטר עבה SU-8 2025, ספין-מעיל 2,800 סל"ד.
    3. טרום לאפות את פרוסות סיליקון ב 65 מעלות צלזיוס למשך 1 דקה (שלב 1 מתוך 2) עבור 30 מיקרומטר שכבה עבה SU-8 2025. התאם את הזמן בהתאם לסוג photoresist ו לעובי הרצוי. בדוק את הנתונים של היצרן לפרטים נוספים.
    4. טרום לאפות את פרוסות סיליקון ב 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות (שלב 2 מתוך 2) עבור 30 מיקרומטר שכבה עבה SU-8 2025. התאם את הזמן בהתאם לסוג photoresist ו לעובי הרצוי. בדוק את הנתונים של היצרן לפרטים נוספים.
    5. טענת אתרקיק על aligner מסכה לחשיפת UV. מניח את מסכת photolithography עליו. המסכה מציגה דפוס של תכונות עגולות (דיסקים) של 20 מיקרומטר קוטר. הבטח מגע מושלם בין אחד לשני.
      הערה: יצרנים שונים מציעים מסכות photolithography. הרזולוציה המרחבית תקבע את העלות הסופית. מסכות Acetate לספק רזולוציה מקובלת (≈10 מיקרומטר) ובעלות נמוכה. מסכות כרום לספק רזולוציה טובה יותר אך הן יקרות יותר. להתאים את בקטרים ​​של דיסקים (מתוך מסכת photolithography) להיקף של תאים. מידות של דיסקים על המסכה תקבענה את בקוטר של חללים בתוך המכשיר. בקטרים ​​קטנים יובילו מילוי נמוך; מדי בקוטר גדול לא להגביל את התאים. עבור תאי הלה NIH3T3, בקטרים ​​של 20 מיקרומטר עד 25 מיקרומטר הם הציעו.
    6. בדוק את הכוח של אקספוזיציה לפני מנורת UV לייעל את זמן החשיפה בהתאם. מקרינים (אורך גל = 365 ננומטר) עבור 41.5 שניות (או את זמן החשיפה מותאם) ב250 mJ / 2 ס"מ.
      הערה: SU-8 2025 photoresist שלילי, כלומר אזורים חשופים UV יבריאו. במקרה זה, התכונות העגולות היו שחורות שקופות שאר. עבודת photoresist חיובי בצורה ההפוכה: אזורים שאינם חשופים נרפאים. בחר את photoresist בהתאם, בהתאם לעיצוב ואת-המסכה התמונה.
      הערה: להגן על העיניים מפני אור UV עם משקפי בטיחות מתאימים.
    7. הסר בעדינות את המסכה מעל שכבת photoresist.
    8. הודעה לאפות את פרוסות סיליקון ב 65 מעלות צלזיוס למשך 1 דקה (שלב 1 מתוך 2) עבור 30 מיקרומטר שכבה עבה SU-8 2025. הודעה לאפות את פרוסות סיליקון ב 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות (שלב 2 מתוך 2) עבור 30 מיקרומטר שכבה עבה SU-8 2025. התאם את הזמן בהתאם לסוג photoresist ו לעובי הרצוי. בדוק את הנתונים של היצרן לפרטים נוספים. לאחר אפיית פוסט, לקרר את פרוסות לטמפרטורת החדר על הספסל במשך כ 1 דקות.
    9. מניחים את פרוסות על coater ספין ושחרר כמה מ"מ של היזם SU-8 כדי לכסותבאזור רקיק כולו. ולפתח 2 דקות ולאחר מכן ספין מעיל ב 1000 סל"ד למשך 30 שניות. חזור על התהליך שלוש פעמים.
    10. לשטוף עם 2-פרופנול כדי להבטיח הסרה מלאה של SU-8 מפותח. מראה של אזורים הלבנים הוא אינדיקצית פיתוח שלם. אם כן, לחזור על השלב בפיתוח פעם נוספת.
    11. קשה לאפות את פרוסות סיליקון ב 200 מעלות צלזיוס כדי להבטיח יציבות של microstructures מפוברק. שלב זה הוא אופציונלי.
    12. אחסן את פרוסות 3 '' עם microstructures בתוך צלחת 94 מ"מ x 15 מ"מ קלקר פטרי.
      הערה: אין צורך לחיפוי, ב silanization בפרט, לקראת השלבים הבאים.
  2. המצאה של Replica polydimethylsiloxane (PDMS): מערך עמודים
    1. לערבב ביסודיות ב 1:10 יחס (w / w) the-מקשר הצלב ואת מראש פולימר עבור סכום כולל של 30 גרם בתוך שפופרת 50 מ"ל.
      הערה: שימוש 1:10 (V / V) יחס עובדת גם.
    2. צנטריפוגה הצינור 1,800 XG במשך 5 דקות כדילהסיר בועות אוויר.
    3. זרוק בעדינות את PDMS על גבי microstructures.
      הערה: אם בועות אוויר להופיע במהלך שלב זה, דגה המדגם באמצעות משאבת ואקום במשך 15-20 דקות.
    4. הנח את הדוגמה בתנור על 65 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות.
      הערה: בפעם הריפוי משתנית בין המשתמשים, יחד עם מקשר הצלב: שיעור מראש פולימר. הפעם יכתיבו את הנוקשות של PDMS. מומלץ לרפא יותר מ -2 שעות ו לדבוק זמן ריפוי קבוע.
    5. השתמש אזמל לחתוך את האזור בעדינות עניין (חותמת) של כ -1 ס"מ 2 הכולל כ -10 5 microcavities או 'eggcups'.
      הערה: חותכים הראשון PDMS ולאחר מכן, לקלף אותו בעדינות. בדוק את איכות העתק PDMS עם מיקרוסקופ אופטי.
  3. המצאה של 'eggcups' על ידי דפוס העתק. בחלק הבא, שתי אסטרטגיות חלופיות עבור הייצור של 'eggcups' מתוארות. שני הפרוטוקולים הם מסיימיםLar ולספק תוצאות זהות:
    1. אסטרטגיה 1
      1. הפעל את חותמת PDMS מפוברק על ידי טיפול פלזמה חמצן למשך 30 שניות. אחסנו באופן זמני את הבולים מופעלים לתוך צלחת פטרי סגורה כדי למנוע בתצהיר של אבק.
        הערה: כוונן את זמן האקספוזיציה אם וגזים אחרים עבור הפלזמה משמשים.
      2. מניחים את PDMS מופעל להחתים למעלה הפוך (בצד עם מבנים) בצלחת פטרי ליד כובע צינור 15 מ"ל. מלא את הכובע עם 200 μl של Trimethylchlorosilane (TMCS). סגור את צלחת פטרי ולתת silanize חותמת במשך 7 דקות.
        הערה: חלק העיוות זמנית על החותמת ו / או שינוי צבע (לבן) אפשר לראות. הבול יתאושש לצורתו המקורית בזמן קצר ואת המבנים לא יושפעו.
        הערה: TMCS מייצרת רעילות שאיפת עורי חריפות, והוא מאוד דליק (עם פלאשבק הצתה מסוגל להתרחש על פני מרחקים ניכרים). כתוצאה מכך, יש להשתמש בו בתוך ארון קטר מן המקורים של ההצתה.
      3. מניחים את החותמת PDMS על coater ספין עם מבנים הפוך למעלה. שים טיפה קטנה של כמה מיקרוליטר (סביב 20 μl) של PDMS נוזלי (01:10 w / w מקשר צלב: פולימר-מראש) על גבי מבנים. ספין מעיל ב 1500 סל"ד למשך 30 שניות להפקיד שכבה דקה של PDMS על גבי מבנים.
        הערה: אם את החותמת אינה תואמת את המקום צ'אק ספין coater את החותמת על גבי מכסה צלחת פטרי עם חור קטן במרכזו.
      4. מניחים את החותמת בתנור על 65 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות כדי לרפא את שכבת PDMS שהופקדו מצופה ספין.
      5. הפעל את שכבת PDMS הדקה ידי צבת חותמת PDMS עד הפוך, יחד עם coverslip זכוכית # 0 של 25 מ"מ קוטר, באמצעות שואב פלזמת חמצן למשך 30 שניות. המשך במהירות לשלב הבא.
        הערה: coverslips עם עוביים אחרים, צורות, וניתן להשתמש בו ממדים גם כן. עם זאת, כמה מבנים הסלולר יכול להיות קשה לדמיין בהתאם לעובי coverslip שנבחרו ואובייקטיביהגדלה ו / או NA ו / או ומרחק עבודה. בדוק את גיליון נתונים אובייקטיביים.
      6. מניח במגע החותם (הצד עם השכבה הדקה צופה-ספין) עם coverslip הזכוכית. לחצו בעדינות בכל רחבי השטח של הבול עם פינצטה כדי להפוך את 'מליטה'. לבסוף, לשמור על לחץ קבוע על גבי החותמת עבור כ -10 שניות.
      7. לאחר 30 דקות בעדינות 'לקלף' חותמת מתוך coverslip כדי "לשחרר" את "eggcups '(ראה איור 1). לשטוף ביסודיות עם אתנול יבש. אם 'eggcups' PDMS לא ימולאו גם על coverslip זכוכית (כלומר הם לנתק במהלך השלב 'בקילוף'), שקול לשנות את הגדרות של שואב פלזמה מחדש בשלב 1.3.1.5.
        הערה: שלב זה הוא עדין. שים לב על מנת למנוע שבירה של coverslip ו / או ניתוק של שכבת PDMS הדקה.
      8. מדביקים חתיכה קטנה (ידית) של PDMS נרפא של 1 מ"מ x 1מ"מ x 3 מ"מ נפח בקצה coverslip עם טיפה קטנה של PDMS נוזל ולרפא את PDMS כמו קודם. זה יקל על המניפולציה של המדגם לאחר מכן (ראה איור 1). שלב זה הוא אופציונלי.
    2. אסטרטגיה 2
      1. Hydrophilize הבולים PDMS מפוברק על ידי טיפול פלזמה חמצן למשך 30 שניות. אחסנו באופן זמני את הבולים מופעלים בצלחת פטרי סגורה כדי למנוע בתצהיר של אבק.
        הערה: כוונן את זמן האקספוזיציה אם וגזים אחרים עבור הפלזמה משמשים.
      2. Hydrophilize הטיפול פלזמה חמצן # 0 coverslips זכוכית בקוטר 25 מ"מ ב 15 וואט במשך 30 שניות. המשך במהירות לשלב הבא.
        הערה: coverslips עם עוביים אחרים, צורות, וניתן להשתמש בו ממדים גם כן. עם זאת, מבנים הסלולר יהיו קשים לדמיין בהתאם לעובי coverslip הנבחר מאפיינים אובייקטיביים (ראה הערה לעיל).
      3. ספין-מעיל טיפה קטנה של PDMS (01:10 w / w מקשר צלב: קדם-PolYmer) של כמה מיקרוליטר על coverslips זכוכית. ספין מעיל ב 1500 סל"ד למשך 30 שניות עבור עובי סופי של כ -50 מיקרומטר.
      4. מדביקים חתיכה קטנה (ידית) של PDMS נרפא של 1 מ"מ x 1 מ"מ x 3 מ"מ נפח בקצה coverslip עם טיפה קטנה של PDMS נוזל ולרפא את PDMS כמו קודם. זה יקל על המניפולציה של המדגם לאחר מכן (ראה איור 1). שלב זה הוא אופציונלי.
      5. אחסן באופן זמני את coverslips PDMS מצופה על גבי נקי לנגב בתוך צלחת פטרי כדי להגן מפני בתצהיר אבק.
      6. שים טיפת מגיב silanizing זו על גבי זו חותמת ולתת להתאדות זה במשך 1-2 דקות. לאחר מכן, לייבש אותם תחת זרם של N 2.
        הערה: בשלב זה, עיוות זמנית של הבול ניתן לצפות במהלך אידוי. הבול יתאושש לצורתו המקורית לאחר ייבוש עם N 2 ללא כל עיוות קבועה של microstructures.
      7. זרוק מאוד בעדינות את החותמת silanized על גביPDMS-ספין מצופה coverslip זכוכית מאוחסנת בצלחת פטרי. ודא כי שני הצדדים במקביל לחלוטין במהלך הקשר. הימנע לחיצה או הזזת חותמת לאחר הצבתו על coverslip PDMS מצופה.
      8. מניחים את צלחת פטרי עם דגימות בריק במשך 1-2 שעות כדי להסיר בועות אוויר.
        הערה: ודא כי דגימות הן אופקיות לחלוטין, כדי למנוע תזוזה חותמת. הימנעו גם רעידות שנגרמו פוטנציאלי על ידי משאבת ואקום.
      9. מניח את הדגימות בתנור על 65 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות.
      10. בעדינות, לקלף את החותמת לחשוף 'eggcups'. לשטוף ביסודיות עם אתנול יבש.
        הערה: עיסוק בשלב זה נחוץ. שים לב למניעת שבירה של coverslip ו / או ניתוק של שכבת PDMS הדקה.

2. היכרות עם תאים לתוך 'Eggcups'

כדי להציג בתאי יונקים בתוך 'eggcups', ne השטח PDMSעורכים כדי להיות פונקציונליים עם חלבונים דבקים של תאי מטריקס. דוגמה זו משתמשת פיברונקטין אך חלבונים אחרים בעלי עניין, כגון קולגן, יוכל לשמש.

  1. Hydrophilize את 'eggcups' את שואב פלזמה חמצן למשך 30 שניות.
    הערה: לייעל את הפרמטרים במידת הצורך.
  2. הכן פתרון ב PBS 1x של 20 מיקרוגרם מ"ל -1 פיברונקטין ממקורות שור.
  3. לעקר את 'eggcups' עם UV למשך 5 דקות. להפקיד טיפה קטנה (בסביבות 20-50 μl) של פתרון פיברונקטין כדי לכסות את האזור "eggcups 'השלם דגירה במשך שעה 1 ב RT. הגנה על המדגם מפני התייבשות.
  4. לשטוף בעדינות את 'eggcups' עם PBS 1x. חזור 3 פעמים.
    הערה: המדגם הוא מוכן לשימוש באופן מיידי או מאוחסנים 4 ° C בחושך במשך כמה שבועות.
  5. הצג חתיכת פלסטיק מחוייט גלילית של 63 מ"מ גובה, 26 מ"מ של רדיוס חיצוני ו -7 מ"מ ממדי רדיוס פנימיים לתוך צינור 50 מיליליטר (ראהאיור 2) 20
    זהירות: השתמש UV עיקור פריטים או לעקר אותם לשימוש קודם.
    הערה: קטע זה יכול להיות מפוברק בקלות במעבדה. או בכל חנות מכונית זמינה.
  6. שים 13 מ"ל של מדיום תרבית תאים בתוך הצינור (ראה טבלה 1). המדיום צריך למלא לפחות 2 סנטימטרים מעל הפיסה הגלילית כדי להבטיח טבילה מלאה של המדגם.
    הערה: לפרטים של סוגי תאים מסוימים, ומערכות מודל אחרות כגון שמרים או C. elegans עובר, והמדיום המקביל בשימוש, ראו סעיף 5 ולוח 1. הפרוטוקול המתואר הוטב הלה, תאי NIH3T3, שורות תאים אחרות (ראה טבלה 1).
  7. הציגו מאוד בעדינות את 'eggcups' בתוך הצינור ובמקביל בצד העליון של חתיכת פלסטיק. להשתמש בפינצטה חדה להחזיק המדגם באמצעות ידית PDMS. לחץ בעדינות את coverslip עד שהוא שקרים על גבי הצד העליון של חתיכת פלסטיק, until הוא שקוע לחלוטין (ראה איור 2).
    הערה: מומלץ להשתמש בפינצטה חדה וישרה. עם פינצטה מעוקל, המניפולציה של המדגם קשה ועלולה לגרום שבירה.
  8. התרבות תאים עד מפגש 80-100% בצלחת פטרי P60 ולאסוף אותם על ידי trypsinization.
    הערה: תאים יכולים להיות wild-type, transfected או מטופלים עם כל תרופה של עניין.
    הערה: למנוע היווצרות של אגרגטים התא אשר ימנע תאים בודדים להיכנס 'eggcups'. כדי לייעל את זה צעד, פיפטה למעלה ולמטה ביסודיות לאחר trypsinization.
  9. מחדש להשעות תאים לתוך מדיום תרבות 5 מיליליטר. פיפטה 200 μl של תאים על גבי 'eggcups'.
    הערה: זרוק תאים כמו מרוכז ככל האפשר על גבי 'eggcups' אבל הימנעות ממגע פיזי. פעולה זו תמנע שבירה ו / או נזק של המדגם.
  10. צנטריפוגות ב 1,800 XG למשך 2 דקות.
    הערה: לאחר צנטריפוגה הראשון, צ'ק-אין מיקרופוןroscope אחוז המילוי של 'eggcups'.
  11. פיפטה שוב 200 μl של תאים על גבי 'eggcups' צנטריפוגות ב 1,800 XG למשך 2 דקות. חזור עבור סכום כולל של שלוש פעמים על מנת לייעל את אחוז המילוי.
    הערה: לאחר צנטריפוגה האחרון, לבדוק עם מיקרוסקופ מילוי אחוז 'eggcups'. במידת הצורך, חזור על השלבים מילוי + צנטריפוגה עד שמגיעים אחוז המילוי הרצוי.
  12. הסר את המדגם מהצינור באמצעות פינצטה חדה מחזיק בידית PDMS. הקפד להיזהר לא 'מטריד' תאים אשר מתקיימים 'eggcups' (ראה איור 2).
  13. מניחים את המדגם בצלחת פטרי עם המדיום. יש לשטוף כדי להסיר את עודף התאים שאינם ב 'eggcups' על ידי pipetting למעלה ולמטה שלוש פעמים בעדינות ליד כל צד (סה"כ 4 צדדים) של מערך מייקרו.
    הערה: Pipetting חזק מדי עלול לשחררכמה תאים מתוך 'eggcups'.
  14. החלף בינוני עם בינוני טרי כדי להסיר תאים nonattached.
    הערה: בשלב זה תרופה של עניין ניתן להוסיף.
  15. תקן תאים או להכין אותם צעד imaging.See זמן לשגות 4.1.

3. תצפית של דינמיקת הסלולר פעילה 'Eggcups': סגירת טבעת Cytokinetic

הערה: בדוגמה זו נעשה שימוש בתאי הלה אשר טרנספקציה עם MYH10-GFP ו Lifeact-mCherry עבור שרירן אקטין, בהתאמה, מולקולות פעילות המפתח הכרוכות בסגירת טבעת cytokinetic במהלך מיטוזה התא. המכשיר מוכן עם microcavities של 25 מיקרומטר קוטר. לצורך ההשגחה שלהם, מיקרוסקופ epifluorescence הפוך שמש, מצויד מטרת שמן 60X (1.40 NA, דסק"ש, תכנית Apo) ו- GFP (שרירן) ו TxRed (תקטין) מסננים. לחלופין מיקרוסקופ confocal זקוף שמש, מצויד מטרת מי L 25x או 63X HCX IR APO (0.95 NA). עבור EXA זהmple, מומלץ מאוד לסנכרן תאים באמצעות בלוק thymidine כפול, לחסום mitotic או שיטה שייק פעמי mitotic 21-24.
הערה: העובי של PDMS המשמש 'eggcups' מאפשרת את השימוש של מגוון רחב של מטרות הם מיקרוסקופים הפוכים וזקוף מיקומו.

  1. מקום 'eggcups' לתוך מחזיק מיקרוסקופ ולמלא אותו עם 1 מ"ל של 10% FCS בינוני תצפית L-15. כדי למנוע אידוי, להציב מכסה זכוכית על גבי המחזיק או למרוח שכבה דקה של שמן מינרלים על גבי המטרה השמנה medium.Select 60X.
    הערה: בינוני L-15 הוא נאות עבור 2 אטמוספרות הלא-CO. שים לב גם כי כמה תרכובות של DMEM הן פלורסנט אוטומטי. בעת שימוש במדיום זה, מומלץ photobleach תרכובות פלורסנט תוך הארתו עם מנורה בעוצמה גבוהה במשך 1-2 שעות.
    הערה: הימנע משימוש מכסי פלסטיק כשעובד עם הדמית דסק"ש.
  2. מניח את הבעל עם 'eggcups' ו obserבינוני vation במיקרוסקופ. פוקוס באמצעות brightfield אור בזהירות עד 'eggcups', ותאים הם באותו המישור של התבוננות.
  3. פתח את התוכנה ולהתאים את הפרמטרים. בחר במסנן TxRed ו- GFP עבור אקטין שרירן; להתאים את זמן אקספוזיציה לכל ערוץ. רכישה בשיעור טיפוסי הוא 5 שניות שני הערוצים.
    שימו לב: בפעם האקספוזיציה עשויה להיות מותאמת, ובהתאם להגדרות בשימוש, צבע או אברונים תאיים אחרים של עניין.
  4. בחר את האזור של עניין ולחפש טבעת cytokinetic או באמצעות ערוץ ה- GFP או TxRed. פוקוס מדויק.
    הערה: הטבעת היא חדה יותר שרירן קל יותר לזיהוי.
  5. הפעל את הרכישה האוטומטית בשני הערוצים עד הטבעת סגורה לחלוטין.
    שימו לב: חלק photobleaching אפשר לראות. כוונו את הפרמטרים מיקרוסקופ כדי לצמצמו.

4. תצפית של אברונים סלולארי קבוע לתוך 'Eggcups'

שלב זה יכול להתבצע לפני או אחרי שלב # 3. תאים ניתן לתקן מיד לאחר השלב צנטריפוגה ומוכתמת עבור אברון עניין או לאחר התבוננות במיקרוסקופ. דוגמה זו מראה את הכתמה של מערכת גולג'י, סיבים בגרעין אקטין על פיברובלסטים NIH3T3 ב 'eggcups'.

  1. קיבוע של תאים 'Eggcups'
    1. כן 3 paraformaldehyde% (PFA) וחם על 37 מעלות צלזיוס. הסר את המדגם "eggcups 'מהצינור 50 מ"ל (או בעל מיקרוסקופ) ולמקם אותו בתוך צלחת פטרי P35. יש לשטוף מיד עם PBS 1x.
      הערה: פרוטוקולים לעריכת paraformaldehyde 3% זמינים באופן נרחב במקומות אחרים.
      זהירות: יש להשתמש בכפפות ניטריל ומשקפי מגן במהלך תקופת ההכנה של PFA.
    2. הסר לחלוטין את PBS ושחרר 1 מ"ל של 3% PFA דגירה במשך 17 דקות. הסר את PFA ולשטוף פעמיים עם 1 מ"ל של PBS 1X. Permeabilize תאים באמצעות 1 מ"ל של 0.5% טריטעל 3 דקות ולשטוף פעמים עם PBS 1x למשך 5 דקות.
  2. צביעת תאים ב 'Eggcups'
    1. דגירה תאים עבור מכתים מערכת גולג'י עם אנטי Giantin ארנב polyclonal נוגדן ראשוני ב דילול 1: 500 ב PBS. מניחים ירידה 100 μl של פתרון נוגדן על גבי גיליון סרט פלסטי דגירה התאים בתוך 'eggcups' במהופך במשך 45 דקות.
      הערה: הגנה על המדגם עם כיסוי כדי למנוע התייבשות.
    2. שחרר בעיון את 'Eggcups' ולהכניס אותם לתוך צלחת פטרי P35. יש לשטוף 3 פעמים, 5 דקות כל אחד, עם PBS 1x.
    3. הכן קוקטייל PBS עם השעיר Cy3 נוגדנים משני ארנבת אנטי (1: 1,000) ועם Phalloidin אלקסה פלואוריד 488 (1: 200) מכתים סיבי אקטין מתח.
    4. דגירה תאים עם ירידה 100 μl של פתרון נוגדן על גבי גיליון סרט פלסטי דגירה תאים בתוך דקות "eggcups 'במהופך במשך 45.
    5. שחרור בעיון את 'eggcקופץ 'ולהכניס אותם לתוך צלחת פטרי P35. יש לשטוף 3 פעמים, 5 דקות כל אחד, עם PBS 1x.
    6. דגירה תאים עבור מכתים הגרעין הצבת ירידה 100 μl של 1 מיקרוגרם מ"ל -1 DAPI ב PBS על גבי גיליון סרט פלסטי דגירה תאים בתוך דקות "eggcups 'במהופך במשך 45. שלב זה יכול להתבצע עם צעד 4.2.3.
    7. שחרר בעיון את 'eggcups' ולהכניס אותם לתוך צלחת פטרי P35. יש לשטוף 3 פעמים, 5 דקות כל אחד, עם PBS 1x.
    8. תאי הר באמצעות גליצרול 15 μl: PBS (1: 1 v / v) בשקופית זכוכית מיקרוסקופ רגילה ולאטום המדגם עם לק כדי למנוע התייבשות.
      הערה: בהתאם לעובי 'eggcups' לתלייה עלולה להיות קשה. מומלץ לאחסן אז המדגם לתוך צלחת P35 פטרי PBS, מוגן מפני התייבשות.
  3. תצפית מיקרוסקופ
    הערה: בדוגמא זו מיקרוסקופ confocal זקופה משמשת, מצויד גלאי PMT היברידיים. 25x או 63 X HCX IR APO L מים אובייקטיבי (0.95 NA) נבחרה לספק שדה רחב של המדגם להראות את הישימות של המכשיר עבור יישומים ההקרנה גבוהה תוכן.
    1. בחר את מטרת המים 25x או 63X.
      הערה: מטרות שונות ניתן להשתמש בהתאם ליישום האות. אבל שימוש של מטרות צמצם מספריות גבוהות מומלץ.
    2. מניח את המדגם הקבוע עם 'eggcups' ולהתמקד באמצעות אור brightfield בזהירות (לעומת שלב או DIC) עד 'eggcups' והתאים הם במישור של התבוננות.
    3. פתח את התוכנה ולהתאים את הפרמטרים. בחר במסנן GFP, Cy3 ו DAPI עבור אקטין, גולגי תצפית גרעין, בהתאמה; להתאים את זמן חשיפה עבור כל הערוצים.
      שימו לב: בפעם האקספוזיציה עשויה להיות מותאמת בהתאם ההתקנה.
    4. בחר ולמקד את האזור של עניין; להתחיל לכידת תמונה (ראה איור 3).
tle "> 5. הסתגלות עבור התצפית של תאי שמרים ו- C. elegans עוברי

  1. תאי שמרים ביקוע הנצה
    הערה: בדוגמה זו נעשה שימוש ביקוע תאי שמרים אשר מתויגים עם RLC1-mCherry ו- CHD-GFP עבור שרירן אקטין, בהתאמה. התאים שמרימים הניצנים אינם שכותרתו fluorescently כאן. להסתכלות שמרים ביקוע מיקרוסקופ confocal דיסק מסתובב הפוך היה בשימוש. מטרת שמן 100X HCX PL APO CS (1.4 NA) שמשה עבור כל הרכישות. לחלופין, תאים נצפו גם באמצעות מיקרוסקופ שלב בניגוד הפוך מצויד מטרה אוויר 20X לעומת שלב LCPlanFl (0.4 NA). בדוגמא זו, הפרוטוקול הוא זהה לשני סוגי התאים.
    1. מכינים את השטח "eggcups 'כמתואר לעיל. לביקוע ותאי שמרים ניצני, להכין חללים של 5 מיקרומטר קוטר (ראה טבלה 1). במקרה זה, פני השטח לא צריך להיות פונקציונלי עם חלבוני הידבקות.
      הערה: ca המילויn להיות מותאם באמצעות 'eggcups' חרוטים. צורה זו לוכדת ושומרת תאי הימנעות השחרור במהלך שלב השטיפה לאחר צנטריפוגה. מילוי אחוז הוא אופטימלי בסביבות 80%. 'Eggcups' חרוטים אלה יכול להיות מפוברקת באמצעות עמוק תגובתי יון תחריט 13.
    2. תאי שמרי תרבות בתקשורת התרבות הראויה (ראו טבלה 1) עד שמגיע צפיפות אופטית (OD) בטווח של 0.2 ו -0.8. Sonicate התרבות של תאי שמרים כדי להסיר אגרגטים.
    3. הכנס תאי שמרים 'eggcups' על ידי צנטריפוגה. עבור צנטריפוגה, 4 מ"ל של תאים בתרבית OD המתאים מתווסף על צינור עם 'eggcups'. לאחר צנטריפוגה הראשונה, נער בעדינות את הצינור מחדש להשעות תאים שאינם ב 'eggcups', בעוד התאים 'eggcups' לא מופרעים. בלי לפתוח את הצינור, צנטריפוגות שוב וחזור על שלב זה פעמיים. זה מבטיח את בתצהירשל תאים מתרבים לתוך microcavities ריק ויגביר את אחוז המילוי.
      הערה: כשעובד עם שמרים, מומלץ מראש לחום בצנטריפוגה לטמפרטורת העבודה במהלך ניסויים
      הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן והמשיך עד 12 שעות מאוחר יותר. במקרה זה, לאחסן את המדגם על טמפרטורת העבודה ולכסות אותו על מנת למנוע אידוי.
    4. מניחים 'eggcups' בבעל מיקרוסקופ ולמלא למחזיק בינוני מעוקר מסנן הדמיה. עכשיו לשטוף את התאים עם אותה התקשורת עד בתאי השמרים צפים מוסרים ביעילות. תשמור על עצמך לא להפריע תאים 'eggcups' במהלך תהליך השטיפה.
    5. בחר את מטרת שמן 100X ולהתמקד בזהירות. פתח את התוכנה ולהתאים את הפרמטרים. בשמרים ביקוע, בחר GFP מסננים TxRed עבור אקטין שרירן ולהתאים את זמן חשיפה עבור שני הערוצים. רכישה בשיעור טיפוסי הוא 3 שניות.
      הערה: בהתאםfluorophore, הסוג של תיוג ואת ההגדרה, זמן חשיפה משתנה עבור מערכות אחרות.
  2. C. elegans עוברי
    הערה: בדוגמה זו נעשה שימוש ג elegans עובר 25-30 מיקרומטר רחב 50-55 מיקרומטר ארוך. עוברים היו בתרבית כמצוין 25. פרוטוקול ויזואלית פשוט של איך לתפעל ג elegans ניתן למצוא 26. התצפית בוצעה באמצעות מיקרוסקופ שלב בניגוד הפוך מצויד מטרת אוויר 40X 0.55 NA.
    1. מכינים את השטח "eggcups 'כמתואר לעיל ו -25 מיקרומטר קוטר (ראו טבלה 1). במקרה זה, פני השטח לא צריך להיות פונקציונלי עם חלבוני הידבקות.
    2. תרבות ג עוברת elegans בתקשורת התרבות הראויה (ראה טבלה 1).
    3. כנס עובר 'eggcups' על ידי צנטריפוגה כמתואר לעיל (ראה סעיף 2.6 כדי 2.12) באמצעות מי ultrapure כמדיום תרבות.
      הערה: עובר היו 'מתנהג' בדרך כלל במי ultrapure עבור תקופת הניסוי. לחלופין להשתמש חיץ M9 פיסיולוגי לניסויים ארוך טווח.
    4. יש לשטוף את המדגם כפי שתואר לעיל (ראה סעיף 2.14). מניחים את 'eggcups' לתוך מחזיק מיקרוסקופ. בחר את מטרת אוויר 40X ולהתמקד בזהירות. פתח את התוכנה ולהתאים את הפרמטרים. בחר רכישה בשיעור של 3 שניות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ה 'eggcups' (EC) היא מתודולוגיה הקרנה תכולה גבוהה רומן אשר מאפשרת ההדמיה של אורינטצית תאים העוברים בסביבת 3D. בנוסף, חלק תהליכים תאיים, אשר קשה להבחין ב 2D רגיל (שטוח) תרבויות, יכול להיות שנצפו על ידי השיטה החדשה. איור 1 א מציג סיכום של נוהל microfabrication EC (ראה גם סעיף 1 בפרוטוקול המתואר לעיל ). השיטה היא פשוטה, מהירה, יעילה, ללא כל דרישה של ציוד מיוחד. איור 1b ו 1c מראה תמונה בקנה מידה גדול תמונת מיקרוסקופ אלקטרונים סורק מוגדל של 'eggcups', בהתאמה. כפי שניתן לשים לב, צורתם וגודלם מאוד רגילים. שיטה זו היא מאוד גמישה; בצורות ובגדלים שונים יכולים להיות מפוברקות ומותאמות בקלות למערכות מודל אחרות. ממדי'eggcups' נבחרו באופן הבא: מימדיםשל תאים אשר עוברים חלוקה נמדדו על משטחי 2D: יש להם צורה כדורית בקוטר שלהם נלקח אינדיקציה טובה עבור בקוטר EC. התאים להאריך'eggcups' ו אוריינט לאורך הציר הארוך שלהם במהלך חלוקת התא למשל. ממד זה תלוי במערכת - תאי עוברים - כך בממד הזה יש להעריך בכל מקרה.

איור 2 מציג את החומר הדרוש (איור 2 א), צעד אחר צעד פרוטוקול (איור 2b) על אופן השימוש 'eggcups' (ראה גם סעיף 2 בפרוטוקול המתואר לעיל). המילוי של EC עם תאים בעלי עניין (או מערכות מודל אחרות) הוא פשוט מאוד ומהיר. בדרך כלל, זה לוקח פחות מ 20-30 דקות, אשר כוללת גם את הזמן עבור התא trypsinization. לאחר המילוי, ניתן להשתמש דגימות ללמוד תהליכים פעילים (הדמיה חיה) או ניתן לתקן ומוכתם עבור להדמיה של אברוני intereרח (ראה גם סעיפים 3 ו -4 בפרוטוקול כמתואר לעיל).

על משטחים שטוחים, תאים להראות תגובות הטרוגניות פנוטיפים קיצונית של אברונים הסלולר. למעשה, הוצע כי סיבי אקטין מתח (האברונים סלולריים אחרים) הם חפצים של התנאים תרבות 1. על מנת להוכיח השערה זו, אנו בתרבית תאים NIH3T3 הן על 'eggcups' 3D ועל משטחים שטוחים והשוו את פנוטיפים של אברונים תאיים שונים, כלומר סיבי אקטין מתח, מערכת גולג'י וגרעינים. איור 3 מראה דוגמה לאופן שבו תאים מאורגנים בשני תצורות. ב EC, תאים מופצים במערך מסודר מראה פנוטיפ כדורי דמוי הומוגנית (איור 3 א). על משטחים שטוחים, תאים להראות את הסדר, התפשטות הטיפוסית ומורפולוגיה הטרוגנית (איור 3 ב). ישנם גם הבדלים משמעותיים במבנים שלד התא. בפרט, תאים על R16; eggcups 'הראה ירידה במספר סיב מתח לעומת משטחים שטוחים. זה אושר נוסף 3D משוחזר תמונות בם לא סיבי מתח ברור גלויות (ראה איור 3 ג - ד). זו מאשרת כי כמה מבנים הסלולר מוגדלים בתרבויות 2D. זהו גם הסכם עם תצפיות שבוצעו vivo שבו סיבי מתח לא ניתן לזהות.

מנגנון Golgi גם מראה וריאציה משמעותית הפנוטיפ שלהם תלוי מצב התרבות (ראה איור 4). המנגנון Golgi על תרבויות 2D כלל מציג הפנוטיפ המורחב 'מחבק' בפריפריה גרעין ואילו 'eggcups' זה מראה פנוטיפ דחוסה יותר (ראו איור 4 א - ב). על מנת לדמות מניפולצית הקרנת סמים, אנחנו גם הערכנו את ההשפעה של תרופות על תאי בתרבית משני הסביבות. בחרנו Blebbistatin mainly כי זה משבש את הסיבים יקטינו מתח ויכול להיות השפעה על מורפולוגיה Golgi (ראה איור 3 ג - ד). מאז Golgi ממוקם בסמוך לגרעין התא, תרופה זו עשויה להיות גם השפעה על הארכיטקטורה שלה. צופים ראשון שתאים שטופל בתרופה זו הראתה מורפולוגיה קבועה ואחידה פחות לעומת תאי סוג בר (WT) (ראה איור 3 ג - ד). לאחר מכן, אנו לעומת לכמת את הפנוטיפ Golgi שנצפו על 'eggcups' ועל משטחים שטוחים (ראה איור 4C). הבחנו כי על 2D משטחי תאים הראו בעיקר פנוטיפ מורחבת ואילו על התאים 'eggcups' הראו פנוטיפ דחוסה יותר. אנו לא צופים כי הבדל בולט בין WT ותאי שטופלו Blebbistatin.

לבסוף, על 2D משטחים בגרעין התא מכוון באופן אקראי ואילו תאי EC הוא orthogonally אורינטציה ביחס למישור XY בשניWT ו Blebbistatin תאים שטופלו (ראה איור 5 א - ג). זה מדגיש את הכוח של המכשיר כדי האברונים הסלולר אוריינט, בדומה יישום לשעבר של שיטה המכוונת את המטוס של תצפית של הטבעת cytokinetic בשמרים בתאי יונקים 10,12,13. ולבסוף למדנו כיצד כדורי הגרעין (מוגדרות ψ = [π 1/3 6V n 2/3] / A n, כאשר V n הוא הנפח של הגרעין A n שטח הפנים שלה) הושפע תלוי במצבו culturing ועל הטיפול של תאים עם Blebbistatin. איור 5D מציג את ההפצות המקבילות ψ. אנחנו לא שמרנו את הבדל עבור WT שטוח לעומת WT EC, אשר מגלה כי EC אינו המשפיע על הכדוריות הנורמלית של תאים. עם זאת, צפינוהבדל כאשר משווים WT EC כדי Blebb EC טוען כי EC חושף השפעה אמיתית של התרופה כי מוסווה ב 2D.

מחקרי תא חיים באמצעות 'eggcups' לאפשר גם זיהוי של תהליכים פעילים רומן אשר אינם גלויות בתרבויות סטנדרטיות. אנו מצופים תאי EC ו מדמיינים תא חלוק. איור 6 מציג רצף של תמונות של סגירת טבעת cytokinetic במהלך מיטוזה תא. ההתקן 'eggcups' מאפשר הדמיה מלאה של הטבעת, ואילו תרבויות 2D רגילות מראה רק בשני תחומים אשר תואם אחד יחיד מטוס 10. שחזור של הטבעת מתוך רצף של Z- מחסנית תמונות בתרביות 2D ניתן לעשות 27, אבל מידע חשוב הולך לאיבוד. האיכות היא פחתה בשל רזולוצית z נמוכה תהליכים דינמיים לא ניתן לפתור. אקטין שרירן הם חלבונים מרכזיים בדור כוח של חלוקת התא. הדינמיקה שלהם לא יכולה בדואר צלם ולמד תרבות 2D (איור 6 א), ואילו עם 'eggcups' מתגלה מייד. זיהינו מבנים חדשים ותהליכים: בתאים הלה אנו מוצאים הצטברויות תקופתיות של שרירן 17. הצטברויות אלו להעביר רדיאלית כמו הטבעת סוגרת (6b איור). בשמרי ביקוע אנו מוצאים גם inhomogeneities ב שרירן יקטין (איור 6 ג, מימין) 17. בניגוד למה שאנו רואים תאי הלה, הם לסובב על הטבעת בעת הסגר. המהירות היא בטווח של מיקרומטר דקות -1 ולא הייתה להיפתר בעזרת שחזור z עם מיקרוסקופים סטנדרטיים. לבסוף הטבעת cytokinetic ניתן ללמוד יותר על ידי מכתים עבור מרכיביו. אנו מוצאים כי יש הצטברות של phosphotyrosine בקרבה של (6d האיור) הטבעת. אנחנו יכולים גם להראות כי anillin הוא colocalizing בטבעת (6E איור). על ידי מכתים את התאים בכיוון הזה, wדואר עולה כי anillin מראה גם חלוקה הומוגניות.

ה 'eggcups' יושמו גם למערכות מודל אחרות: דיווחנו בתאי יונקים, שמרים ביקוע, אלא גם בדקנו שמרי ניצנים ו- C. elegans (ראה איור 7 א - ה). במקרה זה, הפרוטוקול הותאם עבור כל מערכת ספציפית במונחים של תקשורת בתרבות, חללי גודל מורפולוגיה (ראה טבלה 1). כדוגמה, חרוטי V -shaped 'eggcups' היו מורפולוגיה אופטימלית עבור משתק שמרים ביקוע ביעילות 12, במקום גלילי לחלוטין (או בצורת U) הצורה משמש בתאי יונקים 13. זה איפשר לבדיקת ההשפעה של תרופות cytoskeleton שונים עם יישום הפוטנציאל במחקר מדעי החיים. זה מדגים את הגמישות והאמינות של המתודולוגיה שפותחה.

יתר על כן, הסדר ההורה מאוד של תאים מאפשרקל, לקריאה החוצה אוטומטי של הקרינה של תאים בודדים. אנחנו להמחיש זאת על ידי החדרת תאי NIH3T3 להביע GFP ב 'eggcups' (איור 8 א). עמדת התא ניתן להכיר בקלות את רמת הביטוי המקבילה נמדד. איור 8b מציגה את התפלגות אותות קרינה. זה יכול להיות מיושם על כל-אאוט לקרוא (immunofluorescence, כתבי ניאון בתאים למשל).

איור 1
איור 1: המצאה של 'eggcups' (א) תיאור סכמטי של הליך ייצור של 'eggcups' על ידי העתק דפוס:. (I) יוצקים PDMS נוזל על עובש SU-8 ולרפא אותו. (Ii) חותך את החותמת ולהסיר אותו בזהירות מפני השטח, ולאחר מכן פלזמה להפעיל אותו silanize זה. (Iii) יוצקים PDMS נוזל על חותמת silanizedd צנטריפוגות אותה כדי לקבל דיסק שכבת PDMS דק. (Iv) לאחר ריפוי שכבת PDMS, פלזמה להפעיל את שניהם, את PDMS חותמת מכוסה coverslip זכוכית. (נ) פלזמה להיקשר היא על ידי הפעלת לחץ עדין, הומוגנית. (Vi) לאחר מליטה פלזמה, להסיר בזהירות את הבול לחשוף את פני השטח 'eggcups'. (ז) כדי לפשט את הטיפול בשלבים הבאים, להוסיף חתיכת ידית PDMS קטנה. לחייב את פיסת PDMS אל coverslip ידי הדבקת אותו עם PDMS נוזלי (viii) לרפא אותה ואז בתנור. (ב) תמונה של coverslip 25 מ"מ עם 'eggcups' PDMS וידית. (ג) סריקת אלקטרוני תמונות מיקרוסקופ של 'eggcups' PDMS. המרחק בין המרכזים של 'eggcups' הוא 30 מיקרומטר, בקוטר שלהם כ -25 מיקרומטר. (שמאל) מבט מלמעלה. (ימין) 'Eggcups' נחתכת כדי שזה יקלוט את החלק הפנימי. נא ללחוץ כאן vie ווה גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: (א) אלמנטים הדרושים למילוי EC. (1) 50 מ"ל צינור; (2) קטע גלילי (העליון מבט מהצד); (3) תא בינוני תרבות; (4) "eggcups '; (5) פינצטה חדה. (ב) סכמטי של הליך מילוי EC. (I) חתיכת גלילי הוא הוצג לראשונה לתוך צינור 50 מ"ל ו מלא 13 מ"ל של מדיום תרבית תאים. לאחר מכן, (ii) "eggcups 'מופקד בעדינות על גבי הפיסה הגלילית באמצעות פינצטה חדה כדי לתפעל את EC באמצעות פיסת PDMS הקטנה. (Iii) תאים בצפיפות נכונה הם pipetted על גבי EC. (Iv) תאים הציג את 'eggcups' על ידי צנטריפוגה. (נ) לבסוף, המדגם הוא שוחרר החוצה בזהירות מהצינור וזה מוכן לשימוש. מ '/ קבצים / ftp_upload / 51,880 / 51880fig2large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: השוואה בין פנוטיפים תא על 'eggcups' 3D ומשטחי 2D שטוחים. מיקרוסקופיה Confocal (אובייקטיבי מי 25x, 0.95 NA, ליקה) תמונה של תאי NIH3T3 על (א) EC להרכיב במערך מסודר, ולהראות פנוטיפ כדורי הומוגנית, ועל (ב) תרבות שטוח 2D רגילה, המתפזרת באופן אקראי עם פנוטיפים הטרוגנית. תאים הוכתמו עבור אקטין (בירוק), Golgi (בכתום) ואת גרעין (בכחול). ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר. (ג) שחזור 3D של תאים על EC ו- (ד) על משטחים שטוחים עבור WT ותאי שטופלו Blebbistatin. ברי סולם = 20 מיקרומטר.880 / 51880fig3large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: לחקר פנוטיפ מנגנון NIH3T3 Golgi תמונה סכמטי מדגם של סיווג פנוטיפ Golgi עבור תאים על (א) שטוח (ב) EC.. תאים סווגו דחוס, להאריך או מקוטע תלוי-ערך α. (ג) כימות של פנוטיפים Golgi. ברי סולם = 10 מיקרומטר. לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5: טרונג> לחקר הגרעין פנוטיפ NIH3T3. (א) (משמאל) תמונת מיקרוסקופ Confocal של תא NIH3T3 בתוך EC מוכתם עבור אקטין (בירוק), Golgi (בכתום) ואת גרעין (בכחול). (מימין) תוכנית של אוריינטציה גרעינים בתוך EC. (ב) חלוקה זוויתית של גרעינים בתוך EC עבור WT ו (ג) תאים Blebbistatin שטופלו. (ד) ערכי הכדוריות Nucleus עבור WT ו שטופלו Blebbistatin תאים הן EC ומשטחים שטוחים (P [WT EC -Blebb EC] <0.001, P [Blebb שטוח -Blebb EC] <000,1; n WT שטוח = 47, n WT EC = 94, n Blebb שטוח = 59, n Blebb EC = 141 תאים). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

= "תמיד"> איור 6
איור 6: מחקר מפורט של טבעת cytokinetic בדגימות חיים קבועים בשתי מערכות באמצעות 'eggcups' (א) רצף זמן של טבעת cytokinetic באמצעות תרבות במבחנת 2D סטנדרטית.. רק שני כתמים בהירים ב תקטין (Lifeact-mCherry, אדום) ו שרירן (GFP מתויגים, ירוק) גלויי תלם המחשוף של תאי הלה (בר סולם = 10 מיקרומטר). (ב) רצף זמן הסגר עבור טבעת cytokinetic בתאים הלה במהלך מיטוזה באמצעות 'eggcups'. התמונות מראות יקטינו (באדום) ו שרירן (ירוק). 'Eggcups' תאפשר זיהוי של עדיין הצטברויות שרירן. דוגמא אחת מודגשת עם ראש חץ. (סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר). (ג) טבעת cytokinetic יכול גם להיות דמיינו בשמרים ביקוע. (משמאל) תאים לשכב על משטח שטוח, ציטומגלווירוס טבעת הקינטית גלוי רק שתי נקודות (מימין) תאים 'eggcups':. הסגר כולו יכול ליפול בפח. תקטין מתויג עם CHD-GFP (ברי סולם = 2 מיקרומטר). זמן בדקות: שניות. (ד - ה) דוגמאות של טבעות cytokinetic מוכתם. (ד) אקטין-GFP לבטא בתאי הלה הם מוכתם עבור phosphotyrosine (PY) אשר גם מראה אות בטבעת (סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר). (ה) תאים הלה להביע GFP מתויג שרירן Lifeact-mCherry (אקטין) מגואלות עבור anillin. Anillin מתגלה למקם בטבעת cytokinetic ופחות המרוכזת בקליפה. זה מראה שיתוף לוקליזציה עם אקטין שרירן (סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

80 / 51880fig7.jpg "/>
איור 7:. Application של 'eggcups' סוגי תאים אחרים ומערכות מודל (א) U2OS (אוסטאוסרקומה האדם). ההבלעה מראה תא מפריד. (סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר). (ב) תאי NIH3T3 להביע GFP. ההבדל ברמות הביטוי ניתן לקרוא בקלות (בר סולם = 20 מיקרומטר). (ג) תאי SW480 (סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר). (ד) שמרים ניצנים; זמן המחזור שלהם הוא ללא שינוי. (סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר). (ה) ג elegans תולעים;. (שמאל) על משטח שטוח (מימין) 'eggcups', עובר נתפסים מנקודת מבט חבוי אחר. (ברים בקנה מידה = 10 מיקרומטר). זמן בדקות:. שניות אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

הספרה 8 איור 8: הארגון במערך של 'eggcups' מאפשר ניתוח אוטומטי של אוכלוסיית תאים (א) תאי NIH3T3 ב EC (סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר).. יש להם רמות ביטוי שונות של GFP. (ב) הכרה אוטומטית על מצב תא מאפשרת ניתוח פרטני של רמת הביטוי. הוא סיכם בהיסטוגרמה של הביטוי GFP של האוכלוסייה התא. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

מערכת מודל סוּג מדיום התרבות תצפית בינונית 'eggcups' קוטר (μ;M) תגובות / תיאור
בתאי יונקים NIH3T3 10% DMEM גבוהה גלוקוז BCS 10% BCS L-15 20 שורות תאי יציבות אחרות, כגון REF52 או MDCK, וכן שורות תאים ראשוניים, תאים סרטניים ו / או תאי גזע יכולות להיות מוכנסות גם 'eggcups'.
הלה 10% DMEM גבוהה גלוקוז FCS 10% FCS L-15 25 זמין ממקורות רבים ושונים.
U2OS 10% DMEM גבוהה גלוקוז FCS 10% FCS L-15 20-25 זמין ממקורות רבים ושונים.
SW480 10% DMEM גבוהה גלוקוז FCS 10% FCS L-15 17-20 זמין ממקורות רבים ושונים.
שְׁמָרִים שמרים ביקוע אגרצלחת (YE5S) ומדיה נוזלית (YE5S ו EMM5S) סנן מעוקר תקשורת EMM (ראה רשימת חומרים) 5 המשטח אינו צריך להיות פונקציונלי עם חלבונים דבקים.
שמרים ניצנים צלחת אגרה (YPD) ומדיה נוזלית (YEPD ו SD) מדיה SD 5 המשטח אינו צריך להיות פונקציונלי עם חלבונים דבקים.
עוּבָּר סי אלגנס צלחת NGM מי ultrapure 25 לחלופין בינוני M9 יכול לשמש בניסויים ארוכי טווח. המתכון של פתרון מלוח זה ניתן למצוא כאן: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2009/5/pdb.rec11798.full?text_only=true

טבלה 1: תנאי תרבות 'eggcups' למערכות מודל אחרות. בפרוטוקול לעיל הקשורות ניתן להתאים בקלותרק על ידי החלפת תנאי התרבות תארו והגודל 'eggcups'.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

דפוס העתק שמש כדי לפברק את 'eggcups'. תהליך הייצור לא צריך חדר נקי; זה קל ופשוט, אם כי חלק באימון ייתכן שיידרש. בפרט, משחרר את חותמת PDMS הוא השלב הקריטי ביותר כדי לייצר שטח גדול של 'eggcups' באיכות גבוהה. מסיבה זו, טיפול מיוחד יש לנקוט צעד זה. אם שלב זה הוא נכשל שוב ושוב, שקול לייעל את פרמטרי הפלזמה נקיים לפני silanization והפלזמה מחייב. silanization מספיק יוביל דבק חזק של הבול לסרט PDMS. אם זה הוא ציין, זמן הדגירה עם מגיב silanizing יכול להיות מוגבר. שים לב טכניקות וחומרים אחרים ניתן ליישם לפברק את 'eggcups', אשר יכול להיות פונקציונליות עם מגוון גדול של ליגנדים (פיברונקטין, ג'לטין, קולגן, וכו '). בפרט, microcavities ב פוליסטירן יכול להיות מפוברק בקלות על ידי cusטום מתוצרת טכניקה חמות בלטות. הדבר מבטיח התאמה ביולוגית והשוואה ישירה עם תוצאות שהתקבלו במנות תרבות סטנדרטיות. באופן דומה, טיפול ותרגול מיוחדים נדרשים על מנת לייעל את אחוז המילוי. בפרט, צעד השטיפה הוא קריטי כדי להבטיח מילוי מתאים ללא עודף של תאים, תורם רעש רקע האות. אם תאים יוסרו בקלות חללים, שקלו לשנות את הגודל או עומק של חללים.

'Eggcups' לספק ארכיטקטורת 3D הדמוי לתאים גבוהים תוכן מבחני מיון באמצעות פרוטוקול פשוט. אברונים תאית תהליכים פעילים באמצעות מבחני תרבות סטנדרטיים ידועים ניתן מדמיינים בקלות באמצעות החדרת תאים בודדים על microcavities הפרט ( 'eggcups'). בהתאם למערכת המודל, את הגודל, הצורה והממדים שלהם ניתן להתאים בקלות. בדרך זו בתאי יונקים, שמרים ביקוע, שמרים ניצנים ו- C. ג elegansלטפל ולמד, וכן כל העוברים כגון התסיסנית, או עוברי אדם בהפריה חוץ-גופית, או תאי גזע למשל.

ב התקנה זה תאים בודדים נלכדים. זאת בניגוד לרקמות אפיתל נתקלו in vivo. עם זאת, סביבה זה יכול להיות מועתק 'eggcups' שלנו על ידי ציפוי הקירות הצדדיים עם cadherins לחקות קשר תאי תאים באמצעות אלסטומרים גמישים יותר. קשר מיקוד קודם על ידי בתצהיר של פיברונקטין בתחתית בארות. הפצות בהתאמה אלה של מולקולות הדבקה צריכות לאפשר בשעתוק הסביבות הסלולר נתקלו in vivo. לפי שיטה זו אפשר היה להתקרב מצבים פיזיולוגיים.

חילופי בינוני assay שלנו מובטחת. תאי EC לא מראים שום שפלה בעת ביצוע שני ניסויים קצרים וארוכי טווח בגלל חוסר חילופי בינוני. שימו לב גם כי תאי בע"א ECn להיות מתורבת עד מפגש למרות ההתעניינות העיקרית היא כאשר תאים או עובר בודדים מבודדים בתוך החללים.

כיווניות של אברונים או אורגניזמים שלמים חושפות מידע חדש. אנחנו מראים דינמיקה שונה של אקטין שרירן בטבעת cytokinetic. למרות טבעת cytokinetic בשמרי ביקוע ותאי יונקים מורכבת מרכיבים מרכזיים דומים, אנו מראים עם ההגדרה הזאת, כי הדינמיקה הספציפית שלהם שונה 17. זה תומך מכך, כי מנגנון הסגר שתי המערכות שונה גם כן. כדי לפתח ולחקור השערה כזו, את הכיוון של התא הוא הכרחי. במחקרים עתידיים, המכשיר הזה יכול לשמש גם כדי לחקור את האירועים אחרים הקשורים אברון ארגון בתאים.

מעבר לכך, טכניקה זו יכולה להיות תועלת רבה בביולוגיה התפתחותית. עוברים מוארך ניתן אורינטציה בקלות, ציינתי או מטופלים נוספים אורינטציה מוגדרת.כנראה assay שלנו לא יטיל קוטביות של עוברים, אך אחוז המילוי הגבוה יאפשר לחלץ את לקריאה החוצה הרצוי באופן אמין. בסך הכל 'eggcups' יכולה להיות מכשיר טוב להקרנות גבוהה תוכן.

מבחני תרבות אחרים הוצעו. שיטות אלה נעים בין מספר תאים בממדי 2D צלחות multiwell, תאים בודדים שהופקדו מוטיבי micropatterned דבקים עם צורה זהה. עם זאת, אף אחד מהם הוא מתאים להתגבר על המגבלות שפורטו לעיל על התצפית של אברונים הסלולר ותהליכים דינמיים 1.

שיפורים עתידיים במערכת שלנו יאפשר תחולת 'eggcups' למטרות מוכווני בתעשייה. כדוגמא, יישומי הקרנה בסמים בחברות תרופות דורשים שימוש צלחות multiwell 14,28; ביישום 'eggcups' לתוך פלטפורמות כאלה יהיו פוטנציאל לשפר את המהימנותבדיקות ותוצאות. כמו מבחני איתור-תוכן כזה, גבוהים יבוצעו באמצעות תהליכי automatized הנפוצים של חברות תרופות (ומעבדות מחקר אקדמיות) באמצעות רובוטים. פעולה זו תבטיח דירות ואמינות עם השתנות נמוכה. כמה מוצרים מסחריים המבוססים על מבחנים בתרבית תאי 3D כבר הופיעו בשוק המדגישים את החשיבות של סוג זה של מבחנים. לבסוף, מכשירים אלו לפתוח אופקים חדשים עבור רפואה אישית: תאי מחולה יכולים להיות ממוקמים בתוך 'eggcups', וקוקטיילי טיפול יכולים להיבדק בסביבה פיזיולוגית; לקריאה החוצה הסמן הביולוגי ייאפשרו לחזות טיפול אופטימלי להינתן למטופל 29. בסך הכל את הצורה הפיסית של תאי עוברים המנחה את הארכיטקטורה של החללים, ואנו מקווים כי המכשיר והשיטה ייפרסו נרחב בעתיד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש לנו מה למסור.

Acknowledgments

אנו מכירים L. Brino (מתקן הקרנת תכולה גבוהה IGBMC, Illkirch, צרפת) למתן אותנו עם נוגדן אנטי Giantin, M. Labouesse מעבדה. עבור ג elegans (IGBMC) ו- B. Séraphin מעבדה. עבור נבגי שמרים (IGBMC), א פאלוך וא היימן עבור תאים פלורסנט הלה (MPI-CBG, דרזדן), ג 'מוסלי (הספר לרפואה Dartmouth) ו JQ וו (אוהיו סטייט) עבור תאי שמרים ביקוע; א Hoel ופ Evenou לעזרה ניסיוני, ג ריק (IBMC, שטרסבורג, צרפת) לעזרה טכנית, ו JC ז'אנו (Femto-st, צרפת) לעזרה microfabrication. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מן CNRS, מאוניברסיטת שטרסבורג, Conectus, La Fondation לשפוך la משוכלל ונדיר Medicale ואת CI-FRC של שטרסבורג.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ddH20 (ultrapure) Millipore - Use always fresh water.
Parafilm (plastic film) Bemis PM-999 Adhere Parafilm to the lab bench using some water droplets and ensure a perfect surface flatness.
Photo-mask Selba - http://www.selba.ch
Silicon wafer Siltronix - http://www.siltronix.com/
SU-8 photoresist MicroChem 2000 series http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm 
working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information.
SU-8 developer MicroChem - http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm 
working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information
2-propanol Sigma-Aldrich 19030 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en&region=CA
Available from multiple companies.
Sigmacote (siliconizing reagent ) Sigma-Aldrich SL2-25ML http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr&region=FR 
harmful, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. 
Chlorotrimethylsilane (TMCS) Sigma-Aldrich 386529-100ML http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr&region=FR  
TMCS produces acute inhalation and dermal toxicity, and is highly flammable (with ignition flashback able to occur across considerable distances), consequently it should be used in a fume cupboard away from sources of ignition
Nitrile gloves Kleenguard 57372 http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m
Available from multiple companies.
Glass coverslips #0 Knittel glass KN00010022593 http://www.knittelglass.com/index_e.htm
Very fragile. Manipulate gently.
Sharp straight tweezers SPI 0WSSS-XD http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7
50 ml tube BD Falcon 352070 http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp
Available from multiple companies.
PDMS Dow Corning Sylgard 184 kit http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx?R=131EN 
The package contains both PDMS base and curing agent. Similar elastomers are available from multiple companies.
Microscope glass slides Dutscher 100001 http://www.dutscher.com/frontoffice/search
Available from multiple companies.
DMEM high-glucose medium Fisher Scientific 41965-039 http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?LBCID=12301479&keyWord=41965-039&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
Bovine calf serum Sigma-Aldrich C8056-500ML http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en&region=CA
0.25% Trypsin-EDTA Fisher Scientific 25200-072 http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
PBS 1x Fisher Scientific 14200-067 http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
PBS is at 10x and should be diluted to 1x using ddH2O
L-15 medium Fisher Scientific 21083-027 http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
Medium for atmospheres without CO2 control
Fibronectin  Sigma-Aldrich F1141-5MG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=F1141-5MG&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Penicillin & Streptomycin Fisher Scientific 15140-122 http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=CHEM
Petri dish P35 Greiner 627102 http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/
Petri dish P60 Greiner 628163 http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/
Petri dish P94 Greiner 633179 http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/
Paraformaldehyde 3 % Sigma-Aldrich P6148-500G http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr&region=FR 
Harmful in-particular for the eyes, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information.
Triton 0.5 % Sigma-Aldrich 93443-100ML http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=93443-100ML&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Phallodin-Green Fluorescent Alexa Fluor 488 InVitrogen A12379 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379?CID=search-a12379 
dissolve powder in 1.5 ml methanol
Alexa Fluor 647 InVitrogen A21245 1:200 dilution in PBS 1x
rabbit polyclonal anti-Giantin Abcam ab24586 1:500 dilution in PBS 1x
http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html 
rabbit anti-anillin Courtesy of M. Glotzer, Published in Piekny, A. J. & Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin, and myosin during cytokinesis. Current biology 18, 30–6 (2008). 1:500 dilution in PBS 1x
Anti-phosphotyrosine Transduction Lab 610000 http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000
Cy3 goat anti-rabbit  Jackson Immunoresearch 111-166-047 http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp 
1:1,000 dilution in PBS 1x
DAPI Sigma-Aldrich D8417  http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr&region=FR 
1 mg/ml for 1 min
Glycerol Sigma-Aldrich G2025 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=G2025&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Mineral oil Sigma-Aldrich M8410-500ML http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=M8410-500ML&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
HeLa cells - - Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1
NIH3T3 cells ATCC - Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1
Fission yeast  - - For details on strains, contact the corresponding author.  See also Table 1
C. elegans worms - - For details, contact the corresponding author.  See also Table 1
YES (Agar) + 5 Supplements included MP Biomedicals 4101-732 http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&s=Search 
For preparation: follow  instructions as given on the box
YES (Media) + 5 Supplements included MP Biomedicals 4101-522 http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&s=Search 
For preparation: follow the instructions as given on the box
EMM (Media) MP Biomedicals 4110-012 http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&s=Search 
For preparation: follow  instructions as given on the box
Filter sterilized EMM (Media) - Only for imaging MP Biomedicals 4110-012 For preparation: follow instructions as given on the box. Filter sterilize the media using a 0.22 µm filter instead of autoclaving. This gives transparency to the media and reduces the autofluorescence.
Supplements (for EMM) MP Biomedicals 4104-012 http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&s=Search
 (Add 225 mg/L into the EMM media before autoclaving or filtering)
Stericup and Steritop Vaccum driven sterile filters Millipore - http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&tab1=2&tab2=1#tab2=1:tab1=2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
  2. Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Thery, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab Chip. 9, 1640-1642 (2009).
  3. Mandal, K., Balland, M., Bureau, L. Thermoresponsive Micropatterned Substrates for Single Cell Studies. PLoS ONE. 7, e37548 (2012).
  4. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
  5. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J Cell Sci. , (2012).
  6. Ghibaudo, M., Di Meglio, J. M., Hersen, P., Ladoux, B. Mechanics of cell spreading within 3D-micropatterned environments. Lab Chip. 11, 805-812 (2010).
  7. Greiner, A. M., Richter, B., Bastmeyer, M. Micro-Engineered 3D Scaffolds for Cell Culture Studies. Macromol Biosci. 12, 1301-1314 (2012).
  8. Khetan, S., et al. Degradation-mediated cellular traction directs stem cell fate in covalently crosslinked three-dimensional hydrogels. Nat Mater. 12, 458-465 (2013).
  9. Legant, W. R., et al. Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices. Nat Meth. 7, 969-971 (2010).
  10. Devices and methods for observing the cell division. Riveline, D., Buguin, A. , WO/2010/092116 (2010).
  11. Ochsner, M., et al. Micro-well arrays for 3D shape control and high resolution analysis of single cells. Lab Chip. 7, 1074-1077 (2007).
  12. Devices and methods for observing cells with cell wall or invertebrate embryos with oblong eggshell . Riveline, D. , WO2013144302 (2012).
  13. Devices and methods for observing eukaryotic cells without cell wall. Riveline, D., Wollrab, V. , WO2013135809 (2012).
  14. Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotech. 28, 237-245 (2010).
  15. Wolfe, D., Qin, D., Whitesides, G. Microengineering in Biotechnology, Ch 3. Methods in Molecular Biology. Hughes, M. P., Hoettges, K. F. 583, Humana Press. 81-107 (2010).
  16. Mehling, M., Tay, S. Microfluidic cell culture. Curr Op Biotech. 25, 95-102 (2014).
  17. Wollrab, V., Thiagarajan, R., Wald, A., Kruse, K., Riveline, D. Still and rotating myosin clusters determine cytokinetic ring constriction. Nat Commun. 7, 11860-11869 (2016).
  18. Yao, X., et al. Functional analysis of single cells identifies a rare subset of circulating tumor cells with malignant traits. Integr Biol. 6, 388-398 (2014).
  19. Eberwine, J., Sul, J. Y., Bartfai, T., Kim, J. The promise of single-cell sequencing. Nat Meth. 11, 25-27 (2014).
  20. Allen, T. D., et al. Generation of cell-free extracts of Xenopus eggs and demembranated sperm chromatin for the assembly and isolation of in vitro-formed nuclei for Western blotting and scanning electron microscopy (SEM). Nat. Protocols. 2, 1173-1179 (2007).
  21. Robbins, E., Marcus, P. I. Mitotically Synchronized Mammalian Cells: a Simple Method for Obtaining Large Populations. Science. 144, (1964).
  22. Whitfield, M. L., et al. Stem-loop binding protein, the protein that binds the 3" end of histone mRNA, is cell cycle regulated by both translational and posttranslational mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 20, (2000).
  23. Straight, A. F., et al. Dissecting Temporal and Spatial Control of Cytokinesis with a Myosin II Inhibitor. Science. 299, 1743-1747 (2003).
  24. Tang, J., Erikson, R. L., Liu, X. Checkpoint kinase 1 (Chk1) is required for mitotic progression through negative regulation of polo-like kinase 1 (Plk1). Proc Natl Acad Sci. 103, 11964-11969 (2006).
  25. Zahreddine, H., Zhang, H., Diogon, M., Nagamatsu, Y., Labouesse, M. CRT-1/Calreticulin and the E3 Ligase EEL-1/HUWE1 Control Hemidesmosome Maturation in C. elegans Development. Curr Biol. 20, 322-327 (2010).
  26. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. JoVE. , e4019 (2012).
  27. Saha, S., Pollard, T. D. Anillin-related protein Mid1p coordinates the assembly of the cytokinetic contractile ring in fission yeast. Mol Biol Cell. 23, 3982-3992 (2012).
  28. Prestwich, G. D. Evaluating Drug Efficacy and Toxicology in Three Dimensions: Using Synthetic Extracellular Matrices in Drug Discovery. Acc Chem Res. 41, 139-148 (2007).
  29. Futamura, Y., et al. Morphobase, an Encyclopedic Cell Morphology Database, and Its Use for Drug Target Identification. Chem Biol. 19, 1620-1630 (2012).

Tags

Bioengineering גיליון 115 microcavities דפוס העתק microfabrication ההקרנה גבוהה תוכן 3-ממדים תאים בודדים גרעין Golgi Cytokinetic טבעת.
הזמנת תאים בודדים עוברים יחיד מאסר 3D: התקן חדש עבור הקרנת תוכן גבוהה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wollrab, V., Caballero, D.,… More

Wollrab, V., Caballero, D., Thiagarajan, R., Riveline, D. Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening. J. Vis. Exp. (115), e51880, doi:10.3791/51880 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter