Summary
Beskrivet här är en metod för att detektera och kvantifiera mitokondriella yttre membranproteiner genom immunmärkning av mitokondrier isolerade från gnagare vävnad och analys med flödescytometri. Denna metod kan utsträckas till att bedöma funktionella aspekter mitokondriella subpopulationer.
Abstract
Metoder för att upptäcka och övervaka mitokondrie yttre membranproteinkomponenter i djurvävnader är viktigt att studera mitokondrie fysiologi och patofysiologi. Detta protokoll beskriver en teknik där mitokondrier isolerade från gnagare vävnad immunolabeled och analyserades med flödescytometri. Mitokondrier är isolerade från gnagare ryggmärg och utsattes för ett snabbt steg anrikning för att avlägsna myelin, en stor förorening i mitokondriella fraktionerna från nervvävnad. Isolerade mitokondrier märks sedan med en antikropp av val och en fluorescens konjugerad sekundär antikropp. Analys genom flödes verifierar cytometri den relativa renheten hos mitokondriella preparat genom färgning med en mitokondriell specifika färgämnet, följt av detektion och kvantifiering av immunolabeled proteinet. Denna teknik är snabba, mätbara och hög genomströmning, vilket möjliggör analys av hundratusentals mitokondrier per prov. Det gäller att bedöma nya proteins vid mitokondriella ytan under normala fysiologiska förhållanden samt de proteiner som kan bli mislocalized till denna organell under patologi. Viktigt kan denna metod kopplas till fluorescerande indikatorfärgämnen att rapportera om vissa verksamheter av mitokondriella subpopulationer och är möjligt för mitokondrier från det centrala nervsystemet (hjärna och ryggmärg) och levern.
Introduction
Mitokondrierna är mycket dynamiska organeller som genomgår flera omgångar av fission och fusion, transporteras till platser med hög efterfrågan på energi och svara snabbt på fysiologiska stimuli 1. Eftersom det blir allt mer uppenbart att mitokondrierna inom olika vävnader, och med olika cellulära avdelningar, har olika funktionsprofiler, nya metoder behövs för att identifiera dessa olika mitokondriella undergrupper.
Mikroskopi tillhandahåller ett medel varigenom de enskilda mitokondrier kan visualiseras och närvaron av ett protein vid eller i mitokondrier kan bestämmas genom immunofluorescens 2. Emellertid är kvantitativ analys med denna metod är arbetsintensiv och är mer lämplig för experiment med användning av odödliggjorda eller primära cellinjer. Studiet av enskilda mitokondrier härrör från vävnad är betydligt svårare och de flesta metoder inte möjliggör enkel identifiering av mitokondriella delmängder samtidigt med utvärdeation av mitokondriefunktion 3.
För att åtgärda detta hinder, en ny metod för att immunolabel mitokondrier isolerade från gnagare vävnader och därefter analyseras med flödescytometri har utvecklats. Detta möjliggör snabb detektering och kvantifiering av proteiner lokaliserade till den mitokondriella yttre membran, som jämfört med analys genom mikroskopi, är mycket mindre arbetskrävande och medger analys av tusentals av mitokondrier i ett enda prov. Denna analys kan användas för att övervaka ödet och relativa mängden av mitokondriella yttre membranproteiner som är tänkt att vara konstitutivt närvarande vid mitokondrier, rekrytering av proteiner till den mitokondriella yta, eller detektion av proteiner mislocalized till mitokondrierna i patologiska tillstånd. Dessutom införlivandet av konventionella fluorescerande indikatorfärgämnen medger samtidig bedömning av vissa aspekter av mitokondriefunktion i distinkt mitokondriesubpopulationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djur som används i denna studie behandlades i strikt enlighet med ett protokoll (N08001CVsr) godkänd av Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM) Institutionell kommitté för skydd av djur som följer nationella standarder som anges av den kanadensiska rådet om Djurvård (CCAC).
Förbered alla reagenser som krävs för att utföra detta protokoll (tabell 1). Alla andra uppgifter om utrustning, förnödenheter och leverantörer finns i Lista över Materials.
Tabell 1 buffertkompositioner.
1. Samling Rat Spinal Cord
- Djupt söva råttan (Sprague Dawley) med 4% isoflorane. Verifiera narkos av bristande reflex vid klämmande the tassarna. Euthanize råttan genom halshuggning via giljotinen. Denna metod för eutanasi är att föredra framför andra, vilket kan snedvrida ryggmärgen.
- Skär huden på ryggen för att exponera ryggraden. Skär ryggraden med ben sax strax ovanför höftbenet. Visualisera öppnandet av ryggraden.
- Sätt i en 10 ml spruta, med en 200 l pipettspets (fäst via smältning drygt låga), fylld med fosfatbuffrad saltlösning (PBS), in i ryggraden.
- Spola ryggmärgen genom att applicera ett medium mängd tryck till kolven.
- Om något blod finns på ryggmärgen, skölj med PBS innan du fortsätter till nästa steg.
OBS: Denna metod har också validerats för hjärna och lever. Om även dessa vävnader, samla halva hjärnan från avlivades råttan och en bit av levern lika i vikt till ryggmärgen. Alla andra åtgärder förblir identiska.
2 Isolering av ryggmärgs Mitochondria (Från Vande Velde et al. 4)
- Samla hela intakta ryggmärgen och placera i 5 ml glashomogenisator med fem volymer (~ 3.25 ml) homogeniseringsbuffert (HB). För optimal återhämtning av isolerade mitokondrier, utföra alla steg på is eller i kylrum. Homogenisera vävnaden för hand tills inga stora bitar av vävnad kvar, cirka åtta slag. Placera homogenatet i två (2 ml) eller tre (1,7 ml) mikrocentrifugrör. Centrifugera 1300 xg under 10 min vid 4 ° C i en bänkmikrocentrifug.
- Åter supernatanten och lägg i en 5 ml ultracentrifugrör. Lägg 750 l (~ 0,5 volymer) HB till pelleten innehåller mikrocentrifugrör och försiktigt suspendera pelleten. Upprepa centrifugering och resuspension steg två gånger till. Pool alla supernatanter (S1A och S1B) i samma 5 ml ultracentrifugrör ovan. Detta steg syftar till att ta bort skräp.
- Centrifug poolade S1 med hjälp av en ultracentrifug utrustad med en svängig hink roteller och centrifugera vid 17.000 xg under 15 minuter vid 4 ° C.
- Håll supernatanten (S2) för vidare behandling om cytosolfraktionen är av intresse (t.ex. för Western blot-analys). Suspendera pelleten (P2), den råa mitokondriella fraktionen, i 4 ml HB + 50 mM KCl. Centrifugera 17.000 xg under 15 minuter vid 4 ° C i en svängrotor. Kasta bort supernatanten och försiktigt återsuspendera pelleten (P3) i 800 | il HB.
OBS: Mitokondrier tvättas med HB + 50 mM KCl för att avlägsna eventuella icke-specifika mitokondriellt-associerade föroreningar. - I en ny 5 ml ultracentrifugrör, tillsätt exakt 800 l av suspenderade pelleten (P3).
- Till detta rör tillfoga, 200 pl av Jodixanol (densitetsgradient-medium), och därigenom skapa en slutlig koncentration av 12% Jodixanol. Blanda innehållet i röret försiktigt men grundligt genom pipettering med en P1000. Tillsats av Jodixanol först, och sedan resuspenderas pelleten (P3) kan vara att föredra för att underlätta noggrann blandning. Centrifugera i en ultracentrifuge utrustad med en svängrotor vid 17.000 xg under 15 minuter vid 4 ° C.
- OBS: Lever inte innehåller myelin och därför detta steg är inte nödvändiga om bara levern behandlas. Men om levern är under behandling samtidigt med CNS-mitokondrier, rekommenderas att behandla alla vävnader lika.
- Aspirera skiktet av myelin i toppen av röret och försiktigt bort och kassera supernatanten. Pellets kan vara lös. Återsuspendera pelleten i 4 ml HB. Centrifugera igen vid 17.000 xg under 10 minuter vid 4 ° C. Kasta bort supernatanten och återsuspendera pelleten i 4 ml HB. Upprepa centrifugeringen och avlägsna supernatanten.
- Resuspendera slutliga pelleten (P7) i 100-200 l HB och överför till en 1,7 ml mikrocentrifugrör. Detta prov innehåller isolerade mitokondrier.
- Gå vidare till protein kvantifiering. Späd prover och standardkurvan i 2% natriumdodecylsulfat (SDS) för att säkerställa tillräcklig solubilisering av mitokondrier during protein kvantifiering.
3 immunomärkning av isolerat Mitokondrier för flödescytometri
- För varje färgningsblandning som skall testas pipetteras 25 | ig av isolerade mitokondrier i ett 1,7 ml mikrocentrifugrör. Inkludera en ofärgade prov i varje experiment; och för varje antikropp, se till att inkludera ett prov för lämplig isotypkontroll.
- Centrifugera vid 17.000 xg under 2 minuter vid 4 ° C i en bänkmikrocentrifug.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera isolerade mitokondrier i 50 pl Mitokondrier Buffer (M buffert) kompletterad med 10% fettsyra-fri BSA under 15 min vid 4 ° C (blockeringssteg).
OBS: Under märkning, utför inkubationer i kylskåp vid 4 ° C. - Lägg primära antikroppen (kanin anti-Mfn2, 20 ^ g per ml) till röret och inkubera under 30 min vid 4 ° C.
OBS: Bestäm optimala koncentrationen av varje antikropp empiriskt genom titrering. På grund av variationer i koncentration och / eller purity kan olika partier av samma antikropp från samma tillverkare leda till olika resultat; Därför behövs titrering för varje nytt parti antikroppar. - Skölj obundna primär antikropp: Centrifugera vid 17.000 xg under 2 minuter vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och försiktigt återsuspendera pelleten i 200 | il M-buffert. Centrifugera vid 17.000 xg under 2 minuter vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och suspendera pelleten i 50 l M buffert.
- Lägg sekundär antikropp (Donkey anti-kanin-IgG Phycoerythrin (PE), 0,5 mikrogram per ml) till röret och inkubera proverna under 30 minuter vid 4 ° C, skyddat från ljus.
- Skölj obunden sekundär antikropp: Centrifugera vid 17.000 xg under 2 minuter vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 200 | il M-buffert. Centrifugera vid 17.000 xg under 2 minuter vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och suspendera pelleten i 500 l M buffert.
- För att säkerställa händelser är faktiskt mitokondrier, fläck isolerade mitokondrier medmitokondrier specifik fluorescerande färg i 15 minuter vid rumstemperatur, skyddat mot ljus. Om färgning av andra funktionella parametrar (mitokondrie trans potentiella eller superoxid produktion) önskas, gå vidare till steg 4 Om inte, gå till steg 5 för förvärvet.
OBS: Det är viktigt att kontrollera att emissionsspektrum av den sekundära antikroppen är förenlig med de funktionella färgämnen. Till exempel, om verifiering mitokondriell renhet med ett kommersiellt färgämne med spektrala egenskaper som liknar FITC och transmembranpotentialen med tetrametylrodamin metylester (TMRM), en livskraftig sekundär antikropp skulle allofykocyanin (APC: Ex 650 nm / Em 660 nm). Lägg ersättningssystem kontroller, det vill säga, ett prov immunolabeled eller färgade med en enda fluorofor, när så är tillämpligt. - Överför till ett rör lämpligt för lastning flödescytometer. (För att underlätta små provmängder, en mikro-röret placeras innanför 3 ml flödescytometer rör.) Håll prover på is och omedelbart gå tillflödescytometer för förvärvet.
4 Testmetoder Mitochondrial transmembran Potential och Mitochondrial Superoxide Produktion med flödescytometri
- Kontrollera att isolerade mitokondrier har en intakt transpotential genom färgning med 100 nM TMRM (Ex 548 nm / Em 574 nm) 5, i steg 3,8, under 15 minuter vid rumstemperatur, skyddat mot ljus. För jämförelse av transmembranpotentialen mellan prover och befolkningar, användning av lägre / icke-släckkoncentrationer av TMRM (1 till 30 nM), kan vara lämpligare 6.
- Som en kontroll för TMRM färgning, bets isolerade mitokondrier med 100 nM TMRM i närvaro av 100 iM karbonylcyanid m-klor fenylhydrazin (CCCP), en mitokondriell frikopplare som depolarize mitokondrier. Koncentrationen av CCCP krävs för att depolarisera mitokondrierna kan vara mindre om lägre koncentrationer av färgämne används.
- Kontrollera att isolerade mitokondrier producerar mitokondriell superoxid från staining med en lämplig mitokondriell superoxid indikator 7, även vid steg 3.8, under 15 minuter vid rumstemperatur, skyddat mot ljus.
- Som en kontroll för mitokondriell superoxidproduktion, bets isolerade mitokondrier med färgämne i närvaro av 10 | iM Antimycin A, en hämmare av komplex III i andningskedjan som kommer augment mitokondriell superoxidproduktion.
5. Förvärv och analys av immunolabeled Isolerad Mitokondrier med flödescytometri
- Instrument inrättas: Switch spänningar från linjärt för att logga läget att underlätta analys av isolerade mitokondrier och som spänningar (FSC: 450; SSC: 250). Se till att händelser samlas i FSC-A (område) läge samt FSC-W (bredd) och FSC-H (höjd), för att kunna utesluta dubbletter (dvs två händelser, som går genom detektorn samtidigt ) i samlingen analys efter data. Ange antalet händelser som ska samlas till 100.000. Skaffa kontroller kompensations, Om tillämpligt.
- Datainsamling: Innan datainsamling, undvik vortexa prover. Istället blanda genom att försiktigt knacka röret. Initialt samlar händelser på ett lågt tryck, under grind. Gate på totalbefolkningen. Justera spänningar av histogram därmed oftast toppen av ofärgade provet kommer att motsvara det andra decenniet (10 2). När grindarna är etablerade, och proverna bearbetas, kan kopplas trycket för högt.
- Analys: Visualisera dubbletter genom att rita FSC-W kontra FSC. Identifiera singletter och dubletter. Gate på singletter. Välj den mitokondriella befolkningen genom gating på händelser som färgade positivt med en mitokondriell selektiv färgämne.
- Bestäm bakgrundsmärkning från isotypkontroll. Med hjälp av prov isotypkontroll, bestämmer den andel av den mitokondriella befolkningen märknings positivt för Mfn2 antikropp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mitokondrier härledda från rått ryggmärg kan immunolabeled med en antikropp riktad mot Mitofusin2 (Mfn2), ett protein inblandat i fusionen av det yttre membranet hos mitokondrier 8. Efter isolering och märkning med ett Mfn2 specifik antikropp och en fluorescent konjugerad sekundär antikropp, är mitokondrier bearbetas genom flödescytometri (figur 1). Efter datainsamling, prover analyseras med flödescytometri analysprogram, genom att först visualisera alla insamlade händelser ett punktdiagram (Figur 2A). Dubletter och sing differentieras när händelserna plottas i FSC, bredd (B) versus område (A) (Figur 2B). När sing väljs, grind mitokondrie befolkningen via FSC / SSC (figur 2C), och kontrollera antalet händelser som färgar positivt för mitokondrier specifikt färgämne genom samtidig plotta ett histogram över det ofärgade provet med ett prov färgades med mitokondrier-specifik färgämne. För att bestämma de mitokondriella händelser, placera en grind i skärningspunkten mellan de två topparna (figur 2D). För ryggmärgspreparat, vanligen> 90% av händelserna är positiva för mitokondrierna specifika färgämne. För andra vävnader, såsom lever, ~ 98% av händelserna kommer att märka med färgämnet (data ej visade). Efter bara välja händelser som märka positivt för mitokondrierna specifika färgämne, bestämma bakgrunds märkning med isotypkontroll genom att välja en grind (Mfn2 +) som innehåller 1% eller mindre isotyp märkning (Figur 2E, vänster). Applicera denna port enhetligt på alla prover märkta med antikroppar Mfn2 att bestämma andelen mitokondrier med Mfn2 närvarande på det yttre mitokondriemembranet (figur 2E, höger). I detta experiment, 30% av mitokondrier härledd från ryggmärgen etikett positivt för Mfn2. Det är viktigt att notera här, att Mfn2 även anses vara en ubiquitously uttryckt mitochondrial yttre membranprotein, har det inte tidigare kvantifierats. Dessutom visar en immuncytokemisk analys av Mfn2 i odlade celler en icke-homogen märkning av enskilda mitokondrier 9. Det är också möjligt att den Mfn2 epitopen var otillgänglig på grund av posttranslationell modifieringar eller på grund av interaktioner med sig själv eller andra bindningspartners. Notera, var antikroppen i denna studie genererade med användning av en syntetisk peptid till N-terminalen (aminosyrorna 38-55). Det finns en förutsagd skarv variant av Mfn2 saknar de första 302 aminosyrorna, även om denna variant har ännu inte bekräftats experimentellt (UniProt databasen). Således är denna analys inte upptäcka alternativt splitsad Mfn2 som saknar den N-terminala sekvensen, med tanke på den antikropp som används.
Mitochondrial transmembranpotentialen (ΔΨ m) och superoxidproduktion kan bedömas i denna analys. Tvärs det inre mitokondriemembranet, det finns en separation av laddning which driver ATP-produktion via oxidativ fosforylering. TMRM är ett katjoniskt färgämne som ackumuleras inom mitokondrierna i ett membranpotential-beroende sätt 5, och kan därför användas som en reporter av mitokondriell membranpotential. Majoriteten av mitokondrier (95%) är TMRM positiv efter färgning, jämfört med ofärgade kontroll (Figur 3A). Det finns dock när frikopplare CCCP sättes en signifikant minskning av antalet mitokondrier kunna behålla TMRM (figur 3A). CCCP tillåter fri passage av joner över det inre mitokondriemembranet, huvudsakligen förstöra separation fritt och depolariserande membranet.
Mitokondrier frigör superoxid som en normal biprodukt av oxidativ fosforylering från komplexa I och III i elektrontransportkedjan. Mitochondrial superoxid kan mätas via ett membran genomsläpp färgämne som är riktad till mitokondrier och blir fluorescerande FollOvinge en reaktion med superoxid 7. Funktionella mitokondrier producerar en basal mängd superoxid jämfört med ofärgade prover (Figur 3B). Tillsats av komplexet III hämmaren Antimycin A ger en ökning av superoxid, som sett av en högerförskjutning i blomningstid och ett ökat antal mitokondrier (typiskt ~ 10%) som är fluorescerande med denna mitokondriell superoxid indikator färgämne (Figur 3B).
Figur 1 Schematisk bild av isolering, immunomärkning och analys av mitokondrier. Steg 1: Samla vävnad och homogenisera. Steg 2: Den isoleringsförfarandet innehåller åtta centrifugeringssteg. Myelin är en stor inneslutning av centrala nervsystemet vävnad avlägsnas genom utspädning mitokondrier i Jodixanol (densitetsgradient medium) och centrifugefuging, vilket resulterar i myelinet flyter till toppen av röret, medan mitokondrierna pelleteras Steg 3:. Efter isolering och kvantifiering är mitokondrier blockerades, märkt med primär antikropp och tvättades. En sekundär antikropp konjugerad till en fluorofor sätts sedan. Obundet antikropp tvättas ut Steg 4:. Vid denna punkt fluorescerande färgämnen som rapporterar om mitokondriell renhet eller mitokondriefunktion kan läggas till Steg 5:. Mitokondrierna är nu redo att analyseras med flödescytometri.
Figur 2 Strategi för analys av isolerade mitokondrier med flödescytometri. The Forward Scatter (FSC) och sidospridning (SSC) spänningar måste justeras för små händelser, med båda parametrar i logaritmisk läge. FSC bredd uppgifter (FSC-W) skall varasamlas för att utesluta dubbletter. Obs, på de flesta flödescytometrar, är standardinställningen för FSC och SSC linjärt läge. (A) Visualisera alla insamlade händelser på ett punktdiagram. (B) Doublets, två mitokondrier passerar lasern samtidigt, kan skiljas från sing genom att rita FSC kontra FSC-W (linjärt läge). Händelser är uteslutna om FSC-W värdet är mer än dubbelt medelvärdet FSC-W värde för majoriteten av händelser, dvs de som är en del av den täta moln. Händelser under denna tröskel är gated som sing. (C) Återigen, visualisera händelserna i ett punktdiagram och grind på de kvarvarande händelserna. (D) Rita ett histogram över det ofärgade provet (fast, grått, fyllda) och prov färgades med en mitokondriell specifikt färgämne (MSD: fast, grön). Gate händelserna färgning positivt för MSD (MSD +). (E) Histogram av isotypkontroll, kanin-IgG (streckad, svart) och Mfn2 märkt prov (fast, rosa).Ställ in porten för att ge ≤ 1% Mfn2 + på isotypkontroll toppen och tillämpa samma port till experimentella prov för att fastställa andelen händelser märkning positivt för Mfn2 (Mfn2 +). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3 Testmetoder mitokondriell transmembranpotential (ΔΨ m) och superoxidproduktion i isolerade mitokondrier med flödescytometri. (A) under basala förhållanden alla aktiva mitokondrier kommer märka med TMRM (fast, svart), jämfört med ofärgade kontroll (fast, grått, fyllda) eftersom färgämnet ackumuleras i mitokondrierna med en transpotential. Addi ning av protonophore CCCP (streckad blå) avleder transmembranpotentialen orsakar mitokondrierna att depolarize och behålla mindre färgämne jämfört med basala förhållanden. Data rapporteras som delta betyda fluorescensintensitet (ΔMFI), vilket är den genomsnittliga fluorescensintensiteten av den ofärgade kontroll subtraheras från medelvärdet fluorescerande intensiteten av provet. (B) under basala förhållanden, mitokondrier producerar superoxid som en biprodukt av oxidativ fosforylering. Denna mitokondriell källa superoxid kan analyseras med en mitokondriell superoxid indikator, (MitoO 2: fast, svart) jämfört med ofärgade kontroll (fast, grått, fyllda). Tillsats av komplexet III-hämmare, Antimycin A (streckade, apelsin) resulterar i ökad superoxidproduktion, jämfört med basala nivåer. Data rapporteras som procent av celler som färgar positivt för MitoO 2-indikatorn.k "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det är allt mer uppenbart att mitokondrierna är viktiga aktörer för både normal fysiologi och sjukdomar. Medan immunoblottning kan avgöra vilka proteiner som finns inom mitokondrier eller på mitokondrieytan i ett visst villkor, denna metod rapporter om genomsnittet för hela befolkningen. Denna metod kan inte ge information om relativa förekomsten av mitokondriella subpopulationer eller undergrupper. Även om det har varit tidigare antagit att alla mitokondrier är skapade lika, är fältet i allt högre grad inser att mitokondrier i en cell har stor variation vad gäller morfologi och / eller funktion 10.
Fluorescerande mikroskopi metoder tar hänsyn till heterogenitet mitokondrier. Emellertid är kvantifiering av denna typ av data arbetsintensiv. Vidare är bättre lämpad för studier med odlade celler detta tillvägagångssätt, som märkning av mitokondrier in vivo / in situ är svår på grund av de excestande antal mitokondrier som finns, vilket gör differentiering av enskilda organeller sig svåra. I de flesta Immuncytokemi protokoll, är det heller inte möjligt att samtidigt märka yttre mitokondriemembranproteiner och bedöma mitokondriefunktion på grund av den cellulära permeabilization steg krävs för märkningen av antikroppar. Den nuvarande metoden fungerar med isolerad mitokondrier, och därför inte kräver ett permeabilization steg. Dessutom är endast möjligt visualisering av enskilda mitokondrier via elektronmikroskopi, vilket inte är mottaglig för analysen av mitokondriefunktion. Med detta sagt, vi inser att isolering av mitokondrier från vävnad leder till störningar av mitokondrie nätet och det kan påverka vissa delar av mitokondriefunktion. Men jämförelser av funktionella aspekter av isolerade mitokondrier från vävnader som behandlas på samma sätt fortfarande giltiga.
Denna metod för immunomärkning av vävnad som härrör isolatutgåva mitokondrier och efterföljande analys med flödescytometri möjliggör en snabb och kvantifierbar metod för att detektera och övervaka närvaron av ett protein som ligger på det yttre membranet. Upptäckt av en mycket riklig mitokondrieprotein (som Mfn2) är möjlig med denna teknik. På liknande sätt kan denna metod detektera låga abundans proteiner som endast deponeras på mitokondriemembranet i sjukdomen, liksom felveckade SOD1 i samband med amyotrofisk lateralskleros (ALS) 11. Dessutom kan denna metod vara användbar för att övervaka de proteiner som tillfälligt associerar med den mitokondriella yta som en del av deras normala funktion. Exempel innefattar Dynamin relaterat protein-1 (Drp1), ett cytosoliskt protein som rekryteras till mitokondrierna för att främja mitokondriell klyvning 12 och tumömekrosfaktor-receptor-associerad faktor 6 (TRAF6), som translokerar till mitokondrier att öka mitokondriella reaktiva syreföreningar som en del av en medfödd immunsvar 13.
För närvarande denna teknik är mottaglig endast till proteiner belägna vid mitokondrieytan, som standard permeabilization protokoll för intracellulär märkning kräver ett tvättmedel som stör den strukturella integriteten av mitokondrier. Även ett antal möjliga reagens har försökt (opublicerad), fortfarande behövs ytterligare optimering av immunomärkning protokollet för att göra detta protokoll mottaglig för detektering inom mitokondriella komponenter.
Denna teknik har breda användningsområden och kan användas för att detektera närvaron eller rekrytering av ett eller flera proteiner till mitokondrierna under olika experimentella paradigmer. Vidare mitokondrier kan vara co-märkt med två olika antikroppar, liksom med fluorescerande indikatorer 11. Andra fluorescerande prober kan också införlivas för att karakterisera ytterligare aspekter av mitokondriell funktion. Till exempel, för att kommersiellt tillgängliga färgämnen övervaka mitokondrie pH 14 15, och ATP-nivåerna 16 är möjliga.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi tackar Laurie Destroismaisons och Sarah Peyrard för enastående teknisk support och Dr.Alexandre Prat om tillgång till flödescytometern. Vi vill också tacka för Dr Timothy Miller för hans bidrag om avlägsnande av myelin från förberedelserna. Detta arbete stöddes av den kanadensiska Institutes of Health Research (CIHR) neuromuskulära Research Partnership, kanadensiska institutet för innovation, ALS Society of Canada, Frick stiftelse för ALS-forskning, CHUM Foundation och Fonds de la Recherche en Santé du Québec (CVV). Både CVV och NA är Forskning Forskare från Fonds de la Recherche en Santé du Québec och CIHR Nya utredare. SP stöds av Tim Noël STUDENT från ALS Society of Canada.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rats | Charles River | Strain code 400 | Adult (9 weeks to 18 weeks) male or female rats can be used for the isolation protocol. Weight of rats is dependent on gender and age (males between 300 to 500 g and females between 200 to 350 g) are typically used. |
| Dounce homogenizer | Kontes Glass Co. | 885450-0022 | Duall 22 |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend Micro 17 R | |
| Ultra-Clear Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344057 | Transparent, thin walled |
| Sorvall Ultracentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall WX UltraSeries | |
| AH-650 rotor and buckets | Thermo Scientific | ||
| Opti-prep | Axis-Shield | 1114542 | Iodixanol, density gradient medium |
| Fatty acid free Bovine Serum Albumin | Sigma | A8806 | Must be fatty acid free for mitochondria |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma | S9637 | |
| Rabbit anti-Mitofusin2 antibody | Sigma | M6319 | |
| Rabbit IgG | Jackson Immuno Research | 011-000-003 | |
| Anti-Rabbit IgG PE | eBioscience | 12-4739-81 | |
| Micro titer tube | Bio-Rad | 223-9391 | For sample acquisition by flow cytometry |
| MitoTrackerGreen (MTG) | Invitrogen | M7514 | 100 nM: Ex 490 nm/Em 516 nm |
| TMRM | Invitrogen | T668 | 100 nM: Ex 548 nm/Em 574 nm |
| CCCP | Sigma | C2759 | |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 | 5 µM: Ex 540 nm/Em 600 nm |
| Antimycin A | Sigma | A8874 | |
| LSR II flow cytometer | BD | ||
| BD FACSDiva Software | BD | ||
| FlowJo | TreeStar Inc. | Software used for analysis | |
| BCA protein assay kit | Pierce/Thermo Scientific | 23225 | Bradford assay is not recomended as it is not compatible with high concentrations of SDS |
References
- Itoh, K., Nakamura, K., Iijima, M., Sesaki, H.
- Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. J Cell Biol. 183, 795-803 (2008).
- Zorov, D. B., Kobrinsky, E., Juhaszova, M., Sollott, S. J. Examining intracellular organelle function using fluorescent probes: from animalcules to quantum dots. Circ Res. 95, 239-252 (2004).
- Vande Velde, C., Miller, T., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 4022-4027 (2008).
- Loew, L. M., Tuft, R. A., Carrington, W., Fay, F. S. Imaging in five dimensions: time-dependent membrane potentials in individual mitochondria. Biophys J. 65, 2396-2407 (1993).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50, 98-115 (2011).
- Xu, X., Arriaga, E. A. Qualitative determination of superoxide release at both sides of the mitochondrial inner membrane by capillary electrophoretic analysis of the oxidation products of triphenylphosphonium hydroethidine. Free Radic Biol Med. 46, 905-913 (2009).
- Otera, H., Ishihara, N., Mihara, K. New insights into the function and regulation of mitochondrial fission. Biochim Biophys Acta. 1833, 1256-1268 (2013).
- de Brito, O. M., Scorrano, L. Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria. Nature. 456, 605-610 (2008).
- Wikstrom, J. D., Twig, G., Shirihai, O. S. What can mitochondrial heterogeneity tell us about mitochondrial dynamics and autophagy. Int J Biochem Cell Biol. 41, 1914-1927 (2009).
- Pickles, S., Destroismaisons, L., Peyrard, S. L., Cadot, S., Rouleau, G. A., Brown, R. H. Jr, Julien, J. P., Arbour, N., Vande Velde, C. Mitochondrial damage revealed by immunoselection for ALS-linked misfolded SOD1. Hum Mol Genet. 22, 3947-3959 (2013).
- Frank, S., Gaume, B., Bergmann-Leitner, E. S., Leitner, W. W., Robert, E. G., Catez, F., Smith, C. L., Youle, R. J. The role of dynamin-related protein 1, a mediator of mitochondrial fission, in apoptosis. Dev Cell. 1, 515-525 (2001).
- West, A. P., Brodsky, I. E., Rahner, C., Woo, D. K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Walsh, M. C., Choi, Y., Shadel, G. S., Ghosh, S. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472, 476-480 (2011).
- Abad, M. F., Di Benedetto, G., Magalhães, P. J., Filippin, L., Pozzan, T. Mitochondrial pH monitored by a new engineered green fluorescent protein mutant. J Biol Chem. 279, 11521-11529 (2004).
- Murphy, A. N., Bredesen, D., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 9893-9898 (1996).
- Tantama, M., Martinez-François, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio. Nat Commun. 4, 2550 (2013).
