Summary
Beskrevet her er en metode til at påvise og kvantificere mitokondriske ydre membranproteiner ved immunolabeling mitokondrier isoleret fra gnaver væv og analyse ved flowcytometri. Denne fremgangsmåde kan udvides til at vurdere funktionelle aspekter af mitokondrielle subpopulationer.
Abstract
Metoder til at påvise og overvåge mitokondriske ydre membran protein komponenter i animalsk væv er af afgørende betydning for at studere mitokondrie fysiologi og patofysiologien. Denne protokol beskriver en teknik, hvor mitokondrier isoleret fra gnaver væv immunolabeled og analyseret ved flowcytometri. Mitokondrier isoleret fra gnavere rygmarv og underkastes en hurtig berigelse trin for at fjerne myelin en større forurenende stof i mitokondriske fraktioner fremstillet ud fra nervevæv. Isolerede mitokondrier derefter mærket med et antistof af valg og en fluorescens-konjugeret sekundært antistof. Analyse ved flowcytometri kontrollerer den relative renhed af mitokondrie præparater ved farvning med en mitokondrie specifik farve, efterfulgt af detektion og kvantificering af immunolabeled protein. Denne teknik er hurtig, kvantificerbare og højt gennemløb, der giver mulighed for analyse af hundredtusinder af mitokondrier per prøve. Det er relevant at vurdere roman proteins på mitokondrie overflade under normale fysiologiske betingelser, samt de proteiner, der kan blive mislocalized til dette organel i patologi. Vigtigt er det, kan denne metode være koblet til fluorescerende indikatorfarvestoffer at rapportere om visse af mitokondrielle subpopulationer og er muligt for mitokondrier fra det centrale nervesystem (hjerne og rygmarv) samt leveren.
Introduction
Mitokondrier er meget dynamiske organeller, der gennemgår flere runder af fission og fusion, transporteres til steder med stor efterspørgsel efter energi og reagerer hurtigt på fysiologiske stimuli 1. Da det i stigende grad erkendes, at mitokondrier i forskellige væv, endda forskellige cellulære rum, har forskellige funktionelle profiler, er der behov for nye metoder til at identificere disse forskellige mitokondrie undergrupper.
Mikroskopi giver et middel, hvorved de enkelte mitokondrier kan visualiseres og tilstedeværelsen af et protein på eller i mitokondrier kan bestemmes ved hjælp af immunfluorescens 2. Imidlertid kvantitativ analyse ved denne fremgangsmåde er arbejdskrævende og er mere egnet til forsøg med udødeliggjorte eller primære cellelinjer. Studiet af individuelle mitokondrier stammer fra væv er betydeligt vanskeligere og de fleste metoder ikke giver mulighed for nem identifikation af mitokondrie delmængder takt med stillingtagen tilation af mitokondriefunktionen 3.
For at imødegå denne forhindring, en ny metode til at immunolabel mitokondrier isoleret fra gnaver væv og efterfølgende analyseret ved flowcytometri er blevet udviklet. Dette giver mulighed for hurtig påvisning og kvantificering af proteiner lokaliseret til den mitokondriske ydre membran, som i forhold til analyse ved mikroskopi, er langt mindre arbejdskrævende og tillader analyse af tusinder af mitokondrier i en enkelt prøve. Dette assay kan anvendes til at overvåge skæbnen og relative mængde af mitochondriale ydre membranproteiner, der menes at være konstitutivt til stede i mitochondrier, rekruttering af proteiner til det mitokondrielle overflade eller påvisning af proteiner mislocalized til mitokondrierne i patologiske tilstande. Desuden inkorporering af konventionelle fluorescerende indikatorfarvestoffer tillader samtidig vurdering af visse aspekter af mitokondriefunktion i særskilte mitokondriesubpopulationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyr anvendt i denne undersøgelse blev behandlet i nøje overensstemmelse med en protokol (N08001CVsr) godkendt af Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM) Institutionel udvalg for beskyttelse af dyr, der følger nationale standarder som skitseret af den canadiske Rådet om Animal Care (CCAC).
Forbered alle reagenser, der er nødvendige for at udføre denne protokol (tabel 1). Alle andre detaljer vedrørende udstyr, leverancer og leverandører kan findes i listen over stoffer,.
Tabel 1. puffersammensætninger.
1. Indsamling af rotte rygmarv
- Dybt bedøve rotter (Sprague Dawley) med 4% isoflorane. Bekræft bedøvelse ved manglende refleks ved klemning af the forpote. Aflive rotter ved halshugning via guillotinen. Denne fremgangsmåde til eutanasi er foretrukket frem for andre, som kan forvride rygmarven.
- Skær huden af ryggen for at blotlægge rygsøjlen. Skær rygsøjlen med knogle saks lige over skinkeben. Visualiser åbningen af rygsøjlen.
- Sæt en 10 ml sprøjte, med en 200 ul pipettespids (bundet via smelte lidt over flamme), fyldt med fosfatbufferet saltopløsning (PBS) i rygsøjlen.
- Skyl rygmarven ved at anvende et medium mængde tryk til stemplet.
- Hvis nogen blod er til stede på rygmarven, skylles med PBS før man går videre til næste trin.
BEMÆRK: Denne metode er også blevet valideret for hjerne og lever. Hvis herunder disse væv, indsamle halvdelen af hjernen fra aflivet rotte og et stykke lever lige vægt til rygmarven. Alle andre trin forbliver identiske.
2. Isolering af rygmarv Mitochondria (Tilpasset fra Vande Velde et al. 4)
- Saml det hele intakt rygmarv og sted i 5 ml glashomogenisator med 5 volumener (~ 3,25 ml) homogeniseringsbuffer (HP). For optimal inddrivelse af isolerede mitokondrier, udføre alle trin på is eller i kølerum. Homogenisér væv med hånden, indtil ingen store stykker af væv tilbage, cirka otte slag. Placer homogenat i to (2 ml) eller tre (1,7 ml) mikrocentrifugerør. Centrifuger 1.300 xg i 10 minutter ved 4 ° C i en benchtop mikrocentrifuge.
- Recover supernatanten og sted i et 5 ml ultracentrifugerør. Tilføj 750 pi (~ 0,5 volumener) HB pelleten indeholdende mikrocentrifugerør og forsigtigt pellet resuspenderes. Gentag centrifugering og resuspension trin to gange mere. Pool alle supernatanter (S1A og S1B) i den samme 5 ml ultracentrifugerør ovenfor. Dette trin tjener til at fjerne små rester.
- Centrifuger puljet S1 ved hjælp af en ultracentrifuge udstyret med en svingende spand roteller og centrifugeres ved 17.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C.
- Opbevar supernatanten (S2) til yderligere behandling, hvis den cytosoliske fraktion af interesse (for eksempel til Western blot-analyse). Resuspender pellet (P2), det rå mitochondriefraktionen, i 4 ml HB + 50 mM KCI. Centrifuger 17.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C i en svingende spand rotor. Supernatanten fjernes, og forsigtigt resuspender pellet (P3) i 800 pi HB.
BEMÆRK: Mitokondrier vaskes med HB + 50 mM KCI for at fjerne eventuelle ikke-specifikke mitokondrier-associerede urenheder. - I en ny 5 ml ultracentrifugerør tilsættes nøjagtig 800 ul resuspenderet pellet (P3).
- Til dette rør tilføje, 200 pi iodixanol (densitetsgradient-medium), og derved skabe en endelig koncentration på 12% IODIXANOL. Bland indholdet af reagensglasset forsigtigt, men grundigt via pipettering med en P1000. Tilsætning af iodixanol først, og derefter resuspenderet pellet (P3) kan være at foretrække for at lette grundig blanding. Centrifugeres i en ULTracentrifuge udstyret med en svingende spand rotor ved 17.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C.
- BEMÆRK: Lever ikke indeholder myelin, og derfor er dette trin ikke nødvendigt, hvis blot leveren behandles. Hvis leveren bliver behandlet samtidig med CNS mitochondrier, anbefales det dog, at behandle alle væv lige.
- Aspirer lag af myelin i toppen af røret og fjern og kassér supernatanten. Træpiller kan være løs. Resuspender pellet i 4 ml HB. Der centrifugeres igen ved 17.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C. Supernatanten fjernes, og pellet resuspenderes i 4 ml HB. Gentag centrifugering og supernatanten fjernes.
- Resuspender slutpelleten (P7) i 100-200 ml HB og overføres til en 1,7 ml mikrocentrifugerør. Denne prøve indeholder isolerede mitokondrier.
- Fortsæt til protein kvantificering. Fortynd prøver og standardkurven i 2% natriumdodecylsulfat (SDS) for at sikre tilstrækkelig solubilisering af mitokondrier during protein kvantificering.
3. immunolabeling Isoleret Mitokondrier til flowcytometri
- For hver farvning mix, der skal testes, pipette 25 ug af isolerede mitokondrier i en 1,7 ml mikrocentrifugerør. Medtag en ufarvet prøve i hvert forsøg; og for hvert antistof, skal du sørge for at inkludere en prøve til den relevante isotypekontrol.
- Der centrifugeres ved 17.000 xg i 2 min ved 4 ° C i en bench-top mikrocentrifuge.
- Fjern supernatanten og resuspender isolerede mitokondrier i 50 ul Mitokondrier Buffer (M buffer) suppleret med 10% fedt-syrefri BSA i 15 minutter ved 4 ° C (blokeringstrin).
BEMÆRK: Under mærkning udføre inkubationer i køleskab ved 4 ° C. - Tilføj primære antistof (kanin-anti-Mfn2, 20 ug pr ml) til rør og inkuberes i 30 minutter ved 4 ° C.
BEMÆRK: Bestem optimal koncentration af hvert antistof empirisk ved titrering. På grund af variationer i koncentration og / eller purity kan forskellige partier af det samme antistof fra samme producent føre til forskellige resultater; derfor titrering er nødvendig for hvert nyt parti af antistof. - Vask af ubundet primært antistof: centrifugeres ved 17.000 xg i 2 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten og forsigtigt pellet resuspenderes i 200 pi M buffer. Der centrifugeres ved 17.000 xg i 2 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten og pellet resuspenderes i 50 pi M buffer.
- Tilføj sekundært antistof (æsel anti-kanin IgG phycoerythrin (PE), 0,5 ug pr ml) til rør og inkuber prøverne i 30 minutter ved 4 ° C, beskyttet mod lys.
- Vask ubundet sekundært antistof: centrifugeres ved 17.000 xg i 2 min ved 4 ° C. Supernatanten fjernes, og pellet resuspenderes i 200 ul M buffer. Der centrifugeres ved 17.000 xg i 2 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten og pellet resuspenderes i 500 ul M buffer.
- For at sikre begivenheder er faktisk mitokondrier, bejdse isolerede mitokondrier med enmitokondrier specifikt fluorescerende farvestof i 15 min ved stuetemperatur, beskyttet mod lys. Hvis der ønskes farvning af andre funktionelle parametre (mitokondrie transmembrane potentielle eller superoxid produktion), skal du fortsætte til trin 4. Hvis ikke, så fortsæt til trin 5 for erhvervelsen.
Bemærk: Det er vigtigt at kontrollere, at emissionen spektrum af det sekundære antistof er forenelig med de funktionelle farvestoffer. For eksempel, hvis kontrol mitokondriel renhed med en kommerciel farvestof med spektrale egenskaber svarende til FITC og transmembrane potentiale med tetramethylrhodamin methylester (TMRM), en levedygtig sekundært antistof vil blive allophycocyanin (APC: Ex 650 nm / Em 660 nm). Tilføj kompensationskomité kontrol, dvs en prøve immunolabeled eller farves med et enkelt fluorofor, når det er relevant. - Overførsel til et rør er egnet til læsning flowcytometer. (For at lette den lille sample størrelse, en mikrotiter- rør er placeret inde i 3 ml flowcytometer rør.) Hold prøver på is og gå straks tilflowcytometer til erhvervelsen.
4. En analyse mitokondrie transmembranpotentiale og mitokondrie superoxidproduktion ved flowcytometri
- Kontroller, at isolerede mitokondrier har en intakt transmembranpotentiale ved farvning med 100 nM TMRM (Ex 548 nm / Em 574 nm) 5, i trin 3.8, i 15 minutter ved stuetemperatur, beskyttet mod lys. Til sammenligning af transmembranpotentiale mellem prøverne og befolkninger, anvendelse af lavere / ikke-quenching koncentrationer af TMRM (1 til 30 nM), kan være mere passende 6.
- Som en kontrol for TMRM farvning, bejdse isoleret mitokondrier med 100 nM TMRM i nærvær af 100 uM carbonyl cyanid m-chlor phenylhydrazin (CCCP), et mitokondrie afkobleren der vil depolarisere mitokondrier. Koncentrationen af CCCP kræves for at depolarisere mitokondrierne kan være mindre, hvis der anvendes lavere koncentrationer af farvestof.
- Kontroller, at isolerede mitokondrier producerer mitokondrie superoxid ved staining med en passende mitokondrie superoxid indikator 7, også på trin 3.8, i 15 minutter ved stuetemperatur, beskyttet mod lys.
- Som en kontrol for mitokondrie superoxidproduktion, bejdse isolerede mitokondrier med farvestof i nærvær af 10 uM antimycin, en inhibitor af kompleks III respiratoriske kæde, der vil forøge mitokondrie superoxid-produktion.
5. indhentning og analyse af immunolabeled Isoleret Mitokondrier ved flowcytometri
- Instrument oprettet: Skift spændinger fra lineær til at logge tilstand for at lette analysen af isolerede mitokondrier og sat spændinger (FSC: 450; SSC: 250). Sikre, at begivenheder opsamles i FSC-A (område) tilstand samt FSC-W (bredde) og FSC-H (højde), for at være i stand til at udelukke dubletter (dvs. to begivenheder, der passerer gennem detektoren samtidig ) i indsamling, analyse af dataene efter. Indstil antallet af begivenheder, der skal indsamles til 100.000. Anskaf kontrollen kompensation, Hvis det er relevant.
- Dataopsamling: Inden datafangst, undgå vortexbehandling prøver. I stedet blandes ved forsigtigt at banke røret. Oprindeligt indsamle begivenheder på et lavt tryk, under gating. Gate på den samlede befolkning. Juster spændinger histogrammer derfor normalt toppen af ufarvet prøve vil svare til det andet årti (10 2). Når portene er etableret, og prøver at blive behandlet, kan trykket skiftes til høj.
- Analyse: Visualiser dubletter ved at plotte FSC-W versus FSC. Identificer pyjamas og dubletter. Gate på undertrøjer. Vælg mitokondrie befolkning ved gating på begivenheder, der er farvet positivt med en mitokondrie-selektive farvestof.
- Bestem baggrund mærkning fra isotypekontrol. Brug af isotypekontrol prøve, fastlægge, hvilken procentdel af mitokondrie befolkning mærkning positiv for Mfn2 antistof.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mitokondrier afledt fra rotte rygmarv kan immunolabeled med et antistof rettet mod Mitofusin2 (Mfn2), et protein involveret i fusion af den ydre membran af mitokondrier 8. Efter isolering og mærkning med et Mfn2 specifikt antistof og en fluorescens-konjugeret sekundært antistof, er mitochondrier behandles af flowcytometri (figur 1). Efter dataopsamling, der prøver analyseres ved hjælp af flowcytometri analyse software, ved først at visualisere alle indsamlede begivenheder på et punktdiagram (figur 2A). Dubletter og undertrøjer er differentierede, når de begivenheder, er plottet i FSC, bredde (W) versus (A) (figur 2B). Når undertrøjer er valgt, gate mitokondrier befolkning via FSC / SSC (figur 2C), og kontrollere antallet af hændelser der farves positive for mitokondrier-specifikke farvestof ved co-plotte et histogram af ufarvede prøve med en prøve farvet med mitokondrierne rincifikke farvestof. For at bestemme de mitokondrie begivenheder, placere en låge i skæringspunktet mellem de to toppe (figur 2D). Til rygmarv præparater, typisk> 90% af de begivenheder er positive for mitokondrier-specifikke farvestof. For andre væv, såsom lever, ~ 98% af begivenheder vil etiket med farvestoffet (data ikke vist). Efter valg kun begivenheder, som mærker positivt for mitokondrier-specifikke farvestof, fastlægge baggrund mærkning med isotypekontrol ved at vælge en port (Mfn2 +), der indeholder 1% eller mindre isotype-mærkning (figur 2E, venstre). Anvende denne port ensartet på alle prøver mærket med antistof Mfn2 at bestemme den procentdel af mitokondrier med Mfn2 til stede på den ydre mitochondriemembran (Figur 2E, højre). I dette eksperiment, 30% af mitokondrier stammer fra rygmarven etiket positiv for Mfn2. Det er vigtigt at bemærke her, at Mfn2 selv anses for at være en ubikvitært udtrykt mitochondrial ydre membranprotein, er det ikke tidligere blevet kvantificeret. Desuden er en immunocytokemisk analyse af Mfn2 i dyrkede celler viser en ikke-homogen mærkning af individuelle mitokondrier 9. Det er også muligt at Mfn2 epitop var utilgængelig på grund af skrive translationelle modifikationer eller på grund af interaktioner med sig selv eller andre bindende partnere. Af note blev antistoffet i denne undersøgelse genereret under anvendelse af et syntetisk peptid til N-terminalen (aminosyrer 38-55). Der er et forudsagt splejsningsvariant af Mfn2 mangler de første 302 aminosyrer, selv om denne variant har endnu ikke bekræftet eksperimentelt (UniProt databasen). Således dette assay er i stand til at detektere alternativt splejsede Mfn2 mangler den N-terminale sekvens, da antistoffet anvendes.
Mitokondrie transmembrane potentiale (ΔΨ m) og superoxidproduktion kan vurderes i denne analyse. På tværs af den indre mitokondrielle membran, der er en adskillelse beregning which driver ATP-produktion via oxidativ phosphorylering. TMRM er et kationisk farvestof, der akkumuleres i mitokondrierne i membranpotentialet afhængig måde 5, og kan derfor anvendes som en reporter af mitokondrie transmembrane potentiale. Størstedelen af mitokondrier (95%) er TMRM positive efter farvning sammenlignet med ufarvet kontrol (figur 3A). Når der imidlertid tilføjes afkobler CCCP der et markant fald i antallet af mitokondrier i stand til at fastholde TMRM (figur 3A). CCCP tillader fri passage af ioner på tværs af den indre mitokondrielle membran i det væsentlige at ødelægge adskillelsen af ladning og depolariserende membranen.
Mitokondrier frigivelse superoxid som en normal biprodukt af oxidativ phosphorylering fra komplekse I og III i elektron transportkæden. Mitokondrie superoxid kan måles via en membranpermeabel farvestof, der er målrettet til mitokondrier og bliver fluorescerende Follofløj en reaktion med superoxid 7. Funktionelle mitokondrier producere en basal mængde superoxid forhold til ufarvede prøver (figur 3B). Tilsætning af komplekset III inhibitoren Antimycin A giver en forøgelse af superoxid, som det ses ved en højregående forskydning i fluorescens og et større antal af mitokondrier (typisk ~ 10%), der er fluorescerende med mitokondrie superoxid indikator (figur 3B).
Figur 1. Skematisk af isolation, immunolabeling og analyse af mitokondrier. Trin 1: indsamle væv og homogeniseres Trin 2:. Isoleringsproceduren indeholder otte centrifugeringstrin. Myelin, er en væsentlig begrænsning af centralnervesystemet væv fjernes ved at fortynde mitokondrier i iodixanol (densitetsgradient medium) og Centrifugering, hvilket resulterer i myelin flyder til toppen af røret, mens mitokondrierne pelleteres Trin 3:. Efter isolering og kvantificering er mitochondrier blokeret, mærket med primært antistof og vasket. Et sekundært antistof konjugeret til en fluorofor derefter tilsættes. Ubundet antistof vaskes ud Trin 4:. På dette tidspunkt fluorescerende farvestoffer, der rapporterer om mitokondriel renhed eller mitokondriefunktion kan tilføjes Trin 5:. Mitokondrier er nu klar til at blive analyseret ved flowcytometri.
Figur 2. Strategi for analyse af isolerede mitochondrier ved flowcytometri. The Forward Scatter (FSC) og Side Scatter (SSC) spændinger skal justeres til små arrangementer, ved hjælp af begge parametre i logaritmisk tilstand. FSC-bredde (FSC-W) oplysningerne skal væreopsamlet for at udelukke dubletter. Bemærk, på de fleste flowcytometre, standardindstillingen for FSC og SSC er lineær tilstand. (A) Visualiser alle indsamlede hændelser på et punktdiagram. (B) dubletter, to mitokondrier passerer ved laseren på samme tid, kan skelnes fra slåbrokker ved at plotte FSC versus FSC-W (lineær funktion). Arrangementer er udelukket, hvis FSC-W værdi er mere end det dobbelte af den gennemsnitlige FSC-W værdi for flertallet af begivenheder, dvs dem, der er en del af den tætte sky. Arrangementer under denne tærskel er gated som undertrøjer. (C) Igen, visualisere begivenhederne i et punktdiagram, og gate på de resterende arrangementer. (D) Plot et histogram af ufarvede prøve (fast, grå, fyldte) og prøve farvet med en mitokondrie specifik farvestof (MSD: solid, grøn). Gate de begivenheder der farves positive for MSD (MSD +). (E) Histogram af isotypekontrol, kanin-IgG (stiplet, sort) og Mfn2 mærkede prøve (fast, lyserød).Indstil porten, så at give ≤ 1% Mfn2 + på isotypekontrol højdepunkt og anvende denne samme port til eksperimentel prøve at bestemme procentdelen af begivenheder, mærkning positive for Mfn2 (Mfn2 +). Klik her for at se en større version af dette figur.
Figur 3. En analyse mitokondrielle transmembranpotentiale (ΔΨ m) og superoxid produktion i isolerede mitokondrier ved flowcytometri. (A) under basale betingelser alle aktive mitokondrier vil mærke med TMRM (fast, sort), sammenlignet med ufarvet kontrol (fast, grå, fyldt), fordi farvestoffet akkumuleres i mitokondrier med et transmembrane potentiale. Addi ning af protonophore CCCP (stiplet, blå) spreder transmembranpotentialet forårsager mitokondrier at depolarisere og fastholde mindre farvestof i forhold til basale forhold. Data rapporteres som delta betyder fluorescensintensitet (ΔMFI), som er den gennemsnitlige fluorescerende intensitet af ufarvet kontrol fratrækkes den gennemsnitlige fluorescerende intensitet af prøven. (B) under basale betingelser, mitokondrier producere superoxid som et biprodukt af oxidativ phosphorylering. Denne mitokondrie kilde til superoxid kan analyseres med en mitokondrie superoxid indikator (MitoO 2-: solid, sort) i forhold til ufarvet kontrol (fast, grå, fyldt). Tilsætning af komplekset III inhibitor Antimycin A (punkterede, appelsin) resulterer i øget superoxidproduktion, sammenlignet med basale niveauer. Data rapporteres som procent af celler farves positive for MitoO 2- indikator.k "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det bliver stadig mere tydeligt, at mitokondrier er vigtige aktører i både normale fysiologi og sygdom. Mens immunoblotting kan bestemme, hvilke proteiner findes i mitokondrier eller på mitokondrie overflade i en bestemt tilstand, denne metode rapporter om gennemsnittet af hele befolkningen. Denne metode kan ikke give oplysninger om relative mængder af mitokondrie delpopulationer eller undergrupper. Selv om det tidligere har været antaget, at alle mitokondrier er skabt lige, er det område, i stigende grad erkendes, at mitokondrier i en celle har stor variation med hensyn til morfologi og / eller funktion 10.
Fluorescensmikroskopi tilgange tager hensyn heterogenitet mitokondrier. Kvantificering af denne type data er imidlertid arbejdskrævende. Desuden er denne fremgangsmåde er bedre egnet til undersøgelser ved anvendelse af dyrkede celler, som mærkning af mitokondrier in vivo / in situ er vanskelig på grund af for stramtende antal mitokondrier stede, hvilket gør differentiering af individuelle organeller i sagens natur vanskeligt. I de fleste immunocytokemi protokoller, er det heller ikke muligt samtidigt at mærke ydre mitokondriske membranproteiner og vurdere mitokondriefunktion grund af den cellulære permeabilisering trin kræves til antistofmærkning. Den nuværende metode virker med isolerede mitokondrier, og derfor ikke kræver en permeabilization skridt. Hertil kommer, at visualisering af individuelle mitokondrier er kun mulig via elektronmikroskopi, som ikke er modtagelig for analysen af mitokondriefunktionen. Det er sagt, anerkender vi, at isolering af mitokondrier fra væv fører til afbrydelse af mitokondrie-netværket, og dette kan påvirke nogle elementer af mitokondriefunktionen. Men sammenligninger af funktionelle aspekter af isolerede mitokondrier fra væv, der behandles på samme måde fortsat gyldige.
Denne metode immunmærkning væv afledt isolated mitokondrier og efterfølgende analyse ved flowcytometri giver mulighed for en hurtig og målelig metode til at påvise og overvåge tilstedeværelsen af et protein, placeret på den ydre membran. Påvisning af en meget rigelige mitokondrieprotein (ligesom Mfn2) er muligt med denne teknik. Tilsvarende kan denne metode påvise lav hyppighed proteiner, der kun deponeres på mitokondriemembranen i sygdom, ligesom misfoldet SOD1 i forbindelse med amyotrofisk lateral sklerose (ALS) 11. Desuden kan denne fremgangsmåde være nyttig til at overvåge de proteiner, der transient forbinder med mitokondrie-overflade som en del af deres normale funktion. Eksempler indbefatter dynamin-relaterede protein-1 (Drp1), et cytosolisk protein, der er rekrutteret til mitokondrier at fremme mitokondrie fission 12 og tumor nekrose faktor receptor-associeret faktor 6 (TRAF6), som translokerer for mitokondrier at forøge mitokondrie reaktive oxygenspecies som en del af et immunrespons medfødt 13.
På nuværende denne teknik er modtagelig kun proteiner placeret på mitokondrie-overflade, som standard permeabilisering protokoller til intracellulær mærkning kræver et detergent, der forstyrrer den strukturelle integritet af mitokondrier. Selv om der er forsøgt en række mulige reagenser (ikke offentliggjort), der er stadig behov for yderligere optimering af immunolabeling protokollen til at gøre denne protokol medgørlige at afsløre intra-mitokondrie komponenter.
Denne teknik har bred anvendelse og kan anvendes til at detektere tilstedeværelsen eller ansættelse af et eller flere proteiner til mitokondrierne under forskellige eksperimentelle paradigmer. Endvidere mitochondrier kan co-mærket med to forskellige antistoffer, såvel som med fluorescerende indikatorer 11. Andre fluorescerende prober kan også inkorporeres for at karakterisere yderligere aspekter af mitokondriefunktion. For eksempel kan kommercielt tilgængelige farvestoffer overvåge mitokondrie pH 14 15, og ATP-niveauet 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Laurie Destroismaisons og Sarah Peyrard for fremragende teknisk support og Dr.Alexandre Prat for adgang til flowcytometret. Vi vil også gerne anerkende Dr. Timothy Miller for hans bidrag om fjernelse af myelin fra forberedelserne. Dette arbejde blev støttet af de canadiske Institutes of Health Research (CIHR) Neuromuskulær Research Partnership, canadisk Foundation for Innovation, ALS Society of Canada, Frick Foundation for ALS Research, CHUM Foundation og Fonds de la Recherche en Santé du Quebec (CVV). Både CVV og NA er Forskning Lærde af Fonds de la Recherche en Santé du Quebec og CIHR nye undersøgere. SP er støttet af Tim Noël Studentship fra ALS Society of Canada.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rats | Charles River | Strain code 400 | Adult (9 weeks to 18 weeks) male or female rats can be used for the isolation protocol. Weight of rats is dependent on gender and age (males between 300 to 500 g and females between 200 to 350 g) are typically used. |
| Dounce homogenizer | Kontes Glass Co. | 885450-0022 | Duall 22 |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend Micro 17 R | |
| Ultra-Clear Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344057 | Transparent, thin walled |
| Sorvall Ultracentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall WX UltraSeries | |
| AH-650 rotor and buckets | Thermo Scientific | ||
| Opti-prep | Axis-Shield | 1114542 | Iodixanol, density gradient medium |
| Fatty acid free Bovine Serum Albumin | Sigma | A8806 | Must be fatty acid free for mitochondria |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma | S9637 | |
| Rabbit anti-Mitofusin2 antibody | Sigma | M6319 | |
| Rabbit IgG | Jackson Immuno Research | 011-000-003 | |
| Anti-Rabbit IgG PE | eBioscience | 12-4739-81 | |
| Micro titer tube | Bio-Rad | 223-9391 | For sample acquisition by flow cytometry |
| MitoTrackerGreen (MTG) | Invitrogen | M7514 | 100 nM: Ex 490 nm/Em 516 nm |
| TMRM | Invitrogen | T668 | 100 nM: Ex 548 nm/Em 574 nm |
| CCCP | Sigma | C2759 | |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 | 5 µM: Ex 540 nm/Em 600 nm |
| Antimycin A | Sigma | A8874 | |
| LSR II flow cytometer | BD | ||
| BD FACSDiva Software | BD | ||
| FlowJo | TreeStar Inc. | Software used for analysis | |
| BCA protein assay kit | Pierce/Thermo Scientific | 23225 | Bradford assay is not recomended as it is not compatible with high concentrations of SDS |
References
- Itoh, K., Nakamura, K., Iijima, M., Sesaki, H.
- Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. J Cell Biol. 183, 795-803 (2008).
- Zorov, D. B., Kobrinsky, E., Juhaszova, M., Sollott, S. J. Examining intracellular organelle function using fluorescent probes: from animalcules to quantum dots. Circ Res. 95, 239-252 (2004).
- Vande Velde, C., Miller, T., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 4022-4027 (2008).
- Loew, L. M., Tuft, R. A., Carrington, W., Fay, F. S. Imaging in five dimensions: time-dependent membrane potentials in individual mitochondria. Biophys J. 65, 2396-2407 (1993).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50, 98-115 (2011).
- Xu, X., Arriaga, E. A. Qualitative determination of superoxide release at both sides of the mitochondrial inner membrane by capillary electrophoretic analysis of the oxidation products of triphenylphosphonium hydroethidine. Free Radic Biol Med. 46, 905-913 (2009).
- Otera, H., Ishihara, N., Mihara, K. New insights into the function and regulation of mitochondrial fission. Biochim Biophys Acta. 1833, 1256-1268 (2013).
- de Brito, O. M., Scorrano, L. Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria. Nature. 456, 605-610 (2008).
- Wikstrom, J. D., Twig, G., Shirihai, O. S. What can mitochondrial heterogeneity tell us about mitochondrial dynamics and autophagy. Int J Biochem Cell Biol. 41, 1914-1927 (2009).
- Pickles, S., Destroismaisons, L., Peyrard, S. L., Cadot, S., Rouleau, G. A., Brown, R. H. Jr, Julien, J. P., Arbour, N., Vande Velde, C. Mitochondrial damage revealed by immunoselection for ALS-linked misfolded SOD1. Hum Mol Genet. 22, 3947-3959 (2013).
- Frank, S., Gaume, B., Bergmann-Leitner, E. S., Leitner, W. W., Robert, E. G., Catez, F., Smith, C. L., Youle, R. J. The role of dynamin-related protein 1, a mediator of mitochondrial fission, in apoptosis. Dev Cell. 1, 515-525 (2001).
- West, A. P., Brodsky, I. E., Rahner, C., Woo, D. K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Walsh, M. C., Choi, Y., Shadel, G. S., Ghosh, S. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472, 476-480 (2011).
- Abad, M. F., Di Benedetto, G., Magalhães, P. J., Filippin, L., Pozzan, T. Mitochondrial pH monitored by a new engineered green fluorescent protein mutant. J Biol Chem. 279, 11521-11529 (2004).
- Murphy, A. N., Bredesen, D., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 9893-9898 (1996).
- Tantama, M., Martinez-François, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio. Nat Commun. 4, 2550 (2013).
