Abstract
הפונקציה המדויקת של מיקרוגליה רב גרעיניים, הנקראת תאי globoid, כי הם ייחודיים בשפע במערכת העצבים המרכזית של leukodystrophy תא globoid (GLD) אינה ברורה. פער בידע זה התעכב בשל חוסר מתאים במודל חוץ גופית למחקר. במסמך זה, אנו מתארים מערכת תרבות העיקרית עכברית גליה שבו טיפול עם תוצאות psychosine בmultinucleation של מיקרוגליה הדומים לתאי globoid האופייניים שנמצאו בGLD. שימוש במערכת הרומן הזה, שהגדרנו את התנאים ומצבים של ניתוח למחקר של תאי globoid. פוטנציאל השימוש של מערכת מודל זה קבל תוקף במחקר הקודם שלנו, שזיהה את התפקיד פוטנציאלי לmetalloproteinase מטריקס (MMP) -3 בGLD. רומן במערכת מבחנה זה עשוי להיות מודל שימושי שבו ללמוד את המבנה ותפקוד, אלא גם מניפולציה הטיפולית הפוטנציאלית, של תאים הייחודיים אלה.
Introduction
leukodystrophy Globoid התא (GLD), המכונה גם מחלת Krabbe, היא מחלה demyelinating קטלנית כתוצאה מאובדן של מוטציות פונקציה בgalatocerebrosidase הגן (galc) 1. הצורה השכיחה ביותר של GLD היא הגרסה הילדותית המתאפיינת בהתפרצות בילדות מוקדמת ומאופיינת במהלך קליני אגרסיווי של מנוע וירידה קוגניטיבית שמובילה למוות בטרם עת לעתים קרובות לפני חמש שנים בגיל 2,3. בדיקות גנטיות משמשות לאימות אבחנה של 4 GLD. נוירופתולוגיה של GLD חושפת פגיעה במיאלין נפוצה, ניוון עצבי, astrogliosis ונוכחות של מיקרוגליה רב גרעיניים צבה נקרא תאי globoid 5-7. זיהוי של תאי globoid, לעתים קרובות המכיל תכלילים tubulous בהציטופלסמה שלהם, היה תכונה מגדירה של GLD ל97 השנים האחרונות, למרות שהתפקיד הספציפי של תאים הבולטים אלה נותר חמקמק.
מעורבותם של הלא myelגליה (מיקרוגליה ואסטרוציטים) inating בפתוגנזה של GLD כבר מזמן נחשבים תגובה משנית לפגיעה במיאלין העמוקה במחלה זו 8. מעניין לציין, כי התיאור הראשון של מחלה זו, שנעשה על ידי Knud Krabbe 1916 5, היווצרות מדווחת של phagocytes multinucleated המכיל פסולת שומנים שכבר בשם 'globoid תאים' והוא מאפיין מגדיר של מחלה זו.
תאי Globoid הם תכונת סימן ההיכר של פתולוגיה GLD, למרות שהתפקיד שלהם בGLD זכה להתעלמות ארוכה. מעניין, תאים אלה הם בין השינויים האופייניים המוקדמים ברקמת מערכת העצבים המרכזית של GLD. זה חוסר הידע אולי היה בשל ההנחה כי ההיווצרות של phagocytes multinucleated, תאים ענק הנקראים במחלות אחרות, נחשבות בדרך כלל כתוצאה של פתולוגיה ולא כוח פתוגניים ראשוני נהיגה 9. לכן, היו מעט מחקרים החוקרים את המנגנון שבאמצעות WHIתאי globoid ch נוצרים מphagocytes, במיוחד במערכת העצבים המרכזית של GLD. ההליך המתואר בדוח זה מתמקד בחשיבות של היווצרות תאי globoid במערכת העצבים המרכזית וההפגנה הקודמת שלנו שmultinucleation המושרה psychosine של מיקרוגליה במבחנה ותאים אלה הציג רמות גבוהות יותר של פעילות phagocytic. עולה בקנה אחד עם תצפיות אלה, תאי globoid במוח Twitcher לעתים קרובות מכילים פסולת PAS-חיובי, המצביעים על רמות גבוהות של פעילות phagocytic. תאי Globoid גם הם מצאו להיות immunopositive לפריטין (סמן מיקרוגליה) 10, KP-1 / CD68 (סמן מונוציטים), וחלקם גם חיובי עבור vimentin (חלבון ביניים נימה וסמן של האסטרוציטים ומיקרוגליה הופעלו) 11, HLA-DRA (קולטן משטח MHCII), וTNF-α 7, וייבא-1 (חלבון קושר סידן המשמש לזיהוי מיקרוגליה) 12. בהתבסס על אוסף זה של סמנים, תאי globoid מקורן מיקרוגליה המתפתחיםהפנוטיפ ייחודי.
למרות הייחוד שלהם, את הפונקציה ותרומתו של GCS לפתוגנזה GLD הספציפיים הוזנחה. תאי Globoid כבר חשבו להיות תוצאה משנית של פגיעה במיאלין הכרונית. עם זאת, המחקרים האחרונים שבחנו את הקשר הזמני של תאי globoid לפתולוגיה בחומר הלבן של GLD זיהו הנוכחות של תאי globoid בסוף העוברי לתקופות לאחר לידה מוקדמת; פעמים הקודמות אפופטוזיס oligodendrocyte ופגיעה במיאלין הגלוי 13. כך, הרצף הזמני של פיתוח בנוירופתולוגיה של GLD מצביע על כך שתאי globoid נוצרים מראש של פגיעה במיאלין במחלה זו 14. זה הוביל להשערה שלנו כי ההיווצרות המוקדמת של תאי globoid בGLD עשויה לייצג אירוע פתוגניים הגדרה ולא תגובה משנית, תגובתי לנזק oligodendrocyte 15. בנוסף, חוסר ויסות של פעילות microglial בGLD כבר נחשב פקטוr הגבלת היעילות ארוך הטווח של טיפולים בתאי גזע hematopeotic לטיפול במחלה זו 16. כך, חוקר את התפקודים התאיים ורגולציה של מיקרוגליה, ותאי globoid, בתגובה לpsychosine צפוי לספק תובנות חדשות בפתוגנזה של GLD.
עד לאחרונה, חוסר המודל מתאים שבו תוכל ללמוד היווצרות תא globoid הגביל את ההבנה של התפקיד והתרומה של תאים אלה לפתולוגיה של GLD המדויקים. במחקרים שנעשה לאחרונה, נקבע כי יכולים להיווצר תאי globoid-כמו בתגובה ישירה לpsychosine, רעלן שומנים פתוגניים שמצטבר בGLD. מצאנו מיקרוגליה את זה, אבל לא מקרופאגים, מופעלים ולהפוך לתאי globoid בתרבויות גליה עיקריות בתגובה לpsychosine 15. השינוי הזה לתאי globoid נמצא להיות מתווך על ידי פרוטאז תאי, metalloproteinase מטריקס (MMP) -3 15. לאחרונה, אנוהרחיבו את הממצאים הללו וקבע כי תאי מיקרוגליה וgloboid מופעל psychosine פותחו במבחנת מערכת מודל זה הם בעצמה רעילה לoligodendrocytes ובתאי oligodendrocyte. לפיכך, כאשר נחשבו בהקשר של GLD, ההצטברות המוקדמת של psychosine והיווצרות של תאי globoid לפני הפגיעה במיאלין יתמוך תפקיד עיקרי ואולי פתוגניים המתעוררים למיקרוגליה במחלה זו.
אנו מציעים מחקר שהיווצרות תא globoid יחשפו מידע חדש על הפתוגנזה של GLD שיתרום להבנה של מחלה זו שלנו. יתר על כן, מודל הסלולרי החדש של GLD עשוי לספק פורמט חדש שממנו הגישות טיפוליות חדשניות לטיפול בשינויים פתולוגיים במחלה זו יכולים להיבדק. לפיכך, בדוח זה אנו מספקים פרוטוקול מפורט לפיתוח במבחנה של תאי globoid מושרה psychosine מתרבויות עיקריות של גליה myelinating שאינו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הנהלים הקשורים בעלי חיים בוצעו בהתאם למדיניות על צער בעלי חיים טיפול ושימוש בחי מעבדה שנקבע על ידי המשרד למעבדת צער בעלי חיים (NIH), ורק עם אישור מהוועדה המוסדי הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) מאוניברסיטת מרכז לבריאות קונטיקט.
.1 הכנת תרבויות גליה מעורבות
- לעקר את כל המכשירים לפני השימוש. הוסף 3 מ"ל של התמיסה קרה כקרח סטרילי של האנק המאוזן מלח (HBSS) המכילה לא קטיונים (Mg 2 + או Ca 2 +) לשלוש 60 מ"מ צלחות פטרי סטרילי שמרו על קרח כדי לשמור על הקור.
- לבודד את קליפת המוח מגורי עכבר P0-P2 לאחר לידה, כפי שתואר קודם לכן 17,18.
הערה: מבנים קורטיקליים, כגון hippocampi, אינם כלולים בתרבויות אלה. - מוציא בזהירות את קרומי המוח ולאחר מכן להעביר את קליפת המוח המבודדים לHBSS הטרי ולנתק את רקמות אנזימים, באמצעות neערכה לנתיחה רקמות אוראל על פי הפרוטוקול של היצרן.
- צלחת התאים לתוך T-175 צלוחיות סטרילי ודגירת הלילה בתקשורת [בינוני הנשר (DMEM) עם 10% בסרום שור העובר (FBS) המכיל פניצילין / סטרפטומיצין 1x שונה Dulbecco].
- החלף את כל אמצעי התקשורת ביום שלמחרת עם תקשורת טרי. תמשיך לדגור תרבויות, עם שינויי מדיה רגילים, למשך כ 3 שבועות או עד monolayer סלולרי שהוקם.
הערה: monolayer זה יהיה מורכב מהאסטרוציטים ומיקרוגליה עם כ 10: 1 יחס 19.
.2 אינדוקציה סלולארי Globoid בתרבויות גליה מעורבות
- הכן את coverslips ECM מצופה.
- משרים coverslips העגול עם חומצת סטרילי 1 N הידרוכלורית (HCl) בצלחת פטרי סטרילית למשך 30 דקות. לשטוף coverslips עם 3x מים סטריליים ולאחר מכן לטבול ב95% EtOH לפחות 20 דקות. ואז לתת לי אוויר יבש.
- טיפות מקום matr תאי המדוללחומרי ix ציפוי (ECM) חלבון על גיליון של Parafilm (למשל 150-250 μl / טיפה של laminin 10 מיקרוגרם / מ"ל מומס בתמיסת חיץ פוספט סטרילי [PBS]). להפיץ את הטיפות כדי שcoverslips לא לגעת כאשר הניח על גבי הטיפות הללו. מניח בעדינות כל coverslip מיובש על אגל באמצעות מלקחיים.
- השאר את coverslips על הטיפות למשך כ. 4-6 שעות בתוך מכסה המנוע התרבות עם האבנט סגור.
- מניחים את coverslips ECM מצופה (בצד עד מצופה ECM) לכל אחת מהבארות של צלחת 24 גם. לשטוף היטב עם כל PBS 3x סטרילי ולשמור על 4 מעלות צלזיוס עד צורך.
- הכנת תאי גלייה לציפוי על coverslips.
- לשאוב את התקשורת מתרבויות גליה ולשטוף בעדינות 3x monolayer גליה עם 10 מ"ל של PBS סטרילית. לאחר מכן, להוסיף 8-10 מ"ל פתרון טריפסין-EDTA לT-175, ודגירה של 5-10 דקות ב37 מעלות צלזיוס.
- כאשר רוב monolayer כבר מנותק, להוסיף 20 מ"ל של מדיה מלאהלבקבוק כדי להפסיק trypsinization. לאסוף את המדיה המכילה את התאים מנותקים לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל וספין 10 דקות ב XG 300 בטמפרטורת חדר.
- לשאוב supernatant מבלי להפריע גלולה, ולאחר מכן מחדש להשעות את התאים ב2 מ"ל של מדיה מלאה טרי בעדינות על ידי pipetting הפתרון באמצעות pipet P1000.
- לקבוע את מספר התאים באמצעות hemocytometer ולאחר מכן מחדש להשעות תאים בינוניים מלא בצפיפות הרצויה (10 5 תאים / מ"ל לדוגמא). פלייט התאים על coverslips ECM מצופה (למשל 500 μl לבאר כל הצלחת 24 גם). הוסף מדיה שלמה טרי נוספת לכל גם ל3-5 ימים של דגירה על 37 מעלות צלזיוס, או עד שתאים לגדול למפגש החזותי הרצוי.
- טיפול בPsychosine.
- מחדש את psychosine לריכוז המניה (108.3 מ"מ) בsulfoxide דימתיל (DMSO). לדלל מניות זה ב100% EtOH לעשות מניית עובדת שיכולn יתווסף לבאר כל צלחת 24 גם כדי להשיג ריכוז סופי של 10 מיקרומטר.
- בעת הוספת psychosine, בעדינות מערבולת צלחת התרבות לערבב psychosine לתקשורת והתרבות. להשלים את psychosine ידי הוספה המקבילה של 10 מיקרומטר בכל יום אחר במשך שבוע אחד.
- לאחר 7 ימי טיפול psychosine, לאסוף את התקשורת ו500 μl pipet של paraformaldehyde הקר 4% (PFA) לתוך כל אחד. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות כדי לתקן את התאים. לאחר מכן, לשטוף היטב 3x כל אחד עם PBS ולאחר מכן לשמור על צלחות ב 4 ° C. עד מעובד לimmunocytochemistry (ראה להלן).
הערה: תקשורת תרבית תאים ניתן לאסוף להאנזימטית או assay ELISA בשלב זה אם תרצה בכך.
.3 Immunocytochemistry (ICC) לדמיין תאי Globoid
- החלף PBS עם חיץ חסימה [+ 0.3% Tween-20 5 +% עזים בסרום נורמלי PBS (NGS)], ודגירת התאים עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר.
- בcubate תאים הקבועים בantisera העיקרי נגד איבא-1 [(1: 1,000) בדילול מלא PBS + 0.3% Tween-20 + 2% NGS] במשך שעה לפחות 1 בטמפרטורת חדר, ולאחר מכן לשטוף היטב עם כל דקות 3x PBS 5 / לשטוף.
- מוסיף את נוגדן פלואורסצנטי מצומדות- המשני המתאים כדי לזהות את עיקרי תיוג נוגדן ונגד כתם עם 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1: 1,000) לזהות גרעינים. דגירה בפתרון נוגדנים משני עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר ולשטוף עם דקות 3x PBS 5.
- הר כל coverglass לשקופיות מיקרוסקופ באמצעות הרכבה בינונית. צפה בשקופיות במיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור ניתוחים חזותיים וכמותית.
.4 ניתוח ואפיון של תאי Globoid בתרבות ראשית
- השתמש בשלושה הקריטריונים מורפולוגיים הבאים כדי לזהות תא globoid בתרבות:
- לזהות תאי globoid באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי על ידי תיוג immunopositive עבור סמן microglial, + איבא-1.
- זההתאי globoid כ( כלומר שתיים או יותר גרעינים חיוביים DAPI המכילים) polynucleated.
- לזהות תאי globoid ידי מורפולוגיה מעוגלת להבדיל מההופעה מסועפת מאוד של מנוחה תאי microglial.
הערה: תאים יכולים להיות גם שנאסף לצורך ניתוח סמן פני תא וכימות על ידי cytometry זרימה מתרבויות אלה.
- מדידת הפעלת phagocytic של מיקרוגליה ותאי globoid
- כדי להעריך את פעילות phagocytic של מיקרוגליה טופל psychosine, להוסיף חרוזים לטקס FITC שכותרתו לבארות בהתאם להוראות היצרן. להוסיף חרוזים לטקס ניאון מצומדות- 48 שעות לפני קיבוע עם PFA. תקן תאים שטופלו בחרוזים (כאמור בסעיף 2.4), ותהליך לimmunocytochemistry (כאמור בסעיף 3).
- בחר נוגדנים משני fluorophore מצומדות-, כך שהם אינם חופפים ספקטרום פליטת הניאון של חרוזים fluorophore שכותרתו.
- Analyzדואר פרופילי phagocytotic של איבא-1 + מיקרוגליה על ידי זיהוי אותם התאים שישתפו למקם עם חרוזים fluorescently שהכותרת.
הערה: Psychosine יפעיל מיקרוגליה. חרוזים phagocytosed יזוהו בתוך איבא-1 תאים + mononucleated וmultinucleated בהגדרת התרבות זו.
.5 אינדוקציה של תאי Globoid מתרבויות מזוקקים microglial
הערה: גישה חלופית לפענח איתות בין תאית בין astrocyte ומיקרוגליה היא יתרון נוסף של במבחנה globoid מודל זה תא. טיהור של תאי microglial העיקריים לreplating או שיתוף culturing יכולה להיות מושגת על ידי רכוש הדבקות הנמוך שלהם בתרבות, כפי שמתוארת בשלבים הבאים (ראה סעיף 5.2).
- לאסוף את התקשורת מתרבויות גליה מעורבות ומחוברות לצינור חרוטי 50 מ"ל ולתחזק אותו על 37 מעלות צלזיוס בחממה.
- בידוד microglial מתרבויות גליה מעורבות ראשית.
- לאחר הסרת התקשורת מבקבוק T175 מחוברות מעורבת תרבות גליה, להוסיף מדיה רועדת חמה [בהיקף של מדיה מלאה + 25 מ"מ 4 החומצה (2-Hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) + 25 סודיום ביקרבונט מ"מ (Sigma)]. לנער את צלוחיות ל3-4 שעות בייקר מסלולית ב100 סל"ד (37 מעלות צלזיוס). לאסוף את המדיה מצלוחיות מזועזעות אלה לתוך 50 צינורות חרוטי מ"ל.
הערה: תקשורת זה תכלול מיקרוגלים פחות חסיד מהצלוחיות. - ספין התקשורתי XG 300 10 דקות בטמפרטורת חדר. לשאוב supernatant ולאחר מכן מחדש להשעות את התאים ב2 מ"ל של תקשורת מיזוג astrocyte (שנאסף בשלב 5.1).
- להקים את מספר התאים שנרכש באמצעות hemocytometer ולאחר מכן צלחת תאי microglial על coverslips מצופה מצע (ראה סעיף 2.1) לimmunocytochemistry, או צלחת על גבי צלחות גם דבקות ultralow לאוסף עתידי של תאי globoid לתרבות משותפת עם סוגי תאים אחרים, כגון oligodendrocytes (כיורדribed בסעיף הבא).
הערה: ברגע שמצופית המיקרוגלים יכולים להיות מטופלים עם psychosine (10 מיקרומטר) כפי שתואר לעיל (ראה סעיף 2.3).
- לאחר הסרת התקשורת מבקבוק T175 מחוברות מעורבת תרבות גליה, להוסיף מדיה רועדת חמה [בהיקף של מדיה מלאה + 25 מ"מ 4 החומצה (2-Hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) + 25 סודיום ביקרבונט מ"מ (Sigma)]. לנער את צלוחיות ל3-4 שעות בייקר מסלולית ב100 סל"ד (37 מעלות צלזיוס). לאסוף את המדיה מצלוחיות מזועזעות אלה לתוך 50 צינורות חרוטי מ"ל.
- שיתוף תרבות עם ראשוני Oligodendrocytes לניתוח רעיל.
הערה: אוסף של מיקרוגליה טופל psychosine מצלחות ההיענות הנמוכה לתרבות משותפת שלאחר מכן על תרבויות עיקריות של oligodendrocytes, או תאי אב oligodendrocyte, יכולה לשמש כדי לבחון את התפקוד ציטוטוקסיות הפוטנציאל של תאים דמויי globoid אלה במבחנה.- לפתח תרבויות של oligodendrocytes העיקרית בשיטות הוקמו 18,20. כדי לאסוף את מיקרוגליה טופל psychosine, בעדינות pipet לנתק את התאים חסיד רופף מהחלק התחתון של הבארות. לאסוף את התאים, צנטריפוגות ב XG 300 10 דקות, ולאחר מכן resuspend בזהירות בתקשורת בידול oligodendrocyte [מורכבת מתקשורת Neurobasal, L-גלוטמין (1x), B-27 תוספת (1x), וtriiodothyronine (T3, 10 ng / ml )].
- לספור את מספר התאים באמצעות hemocytometer ולאחר מכן זרע מיקרוגליה על תרבות oligodendrocyte ב1 x 10 5 תאים / מ"ל, וכתוצאה מכך 1 משוער: 2 מיקרוגליה / יחס oligodendrocyte. דגירה כשיתוף תרבות לתקופה של עד 3 ימים.
- תקן את התאים לimmunocytochemistry (ראה סעיף 2.4). אסוף תקשורת תרבית תאים לELISA או בדיקות כימיות לפי צורך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה, כפי שנכתב, צפוי להימשך כ 36 ימים כדי להשלים מהתחלה ועד הסוף (ראה איור 1: ניסיוני זרימת העבודה Scheme). זה היה הניסיון שלנו כי התפתחותם של תאים 'כמו globoid' במערכת התרבות העיקרית זה היא גם אמינה ושחזור: ההיווצרות של תאי multinucleated בתגובה לpsychosine הוא ציינה באופן עקבי עם 7 ימים של טיפול.
צביעת Immunocytochemical של מיקרוגליה באמצעות איבא-1 בשיתוף עם נגד גרעיני כתם יאפשר זיהוי של גדול, מעוגלת תאי multinucleated (איור 1b). במקרים מסוימים תוכן בגרעין תאי globoid דמוי אלו יופיע עם גרעינים שונים. עם זאת, במקרים רבים, הגדלת ברוטו של הגודל של הגרעין משקפת את מצב multinucleated של תאים אלה (איור 1b). מספר התאים כמו globoid-יכול להשתנות משדה ראייה לשדה ראייה,אבל זה ראוי לציין כי חלקם של תאי globoid נוצר במבחנה מייצג <5-10% מכלל אוכלוסיית תא microglial. כמו כן, חשוב לציין כי טיפול psychosine גם מעורר הפעלה כללית של מיקרוגליה (עלייה למדידה כלומר בפעילות phagocytic) המתרחשת בתגובה לpsychosine טיפול בקרב מיקרוגלי mononucleated ותאי multinucleated globoid (GCS) בתרבויות אלה. כפי שניתן לראות באיור 1 ג, פרופילי phagocytically פעילים של איבא-1 + מיקרוגליה ניתן בקלות זיהו כאשר הכניסו בשיתוף התרבות עם תאי אב oligodendrocyte (OPCs).
מערכת תרבית תאים זה ניתן למניפולציה ניסויית כאמצעי להעריך את הביולוגיה של תאי globoid. לדוגמא, יש לנו לאחרונה הפגין תפקיד חדש לפרוטאז תאי, מטריצת פרוטאינאז-3 (MMP-3 / stromelysin-1) כמתווך חשוב של היווצרות GC-Induced psychosine באמצעות רחוב ללא מוצא זהassay ture 15.
איור 1:. זרימת עבודה ניסויית למבחנת דגם תרבות הראשית בשל היווצרות תאי Globoid תרשים זרימה () המתארת את השלבים העיקריים ולהתערב פעמים (בימים) להתפתחותם של תאי globoid בתרבות. כל צעד הוא שכותרתו עם סעיף הטקסט הקשור אליו מהפרוטוקול. עבודה זו מספקת גם התקדמות הגיונית ממעורב (astrocyte ותרבויות microglial; סעיף 1) ותרבות המוצא חלופית של מיקרוגליה המטוהרים (סעיף 5) צביעת immuncytochemical נציג של תא microglial multinucleated הבא 7 ימים רצופים של psychosine (ב) (10. טיפול מיקרומטר) כפי שזוהה על ידי Iba1 (הירוק) וDAPI (הכחול). (C) דוגמא של תא microglial phagocytic המשוער (ירוק) לאחר טיפול psychosine בשיתוף התרבות עם Olig2 + OPC (אדום). סרגל קנה מידה (בלוח ב ') = 90 מיקרומטר עבור' B 'ו= 150 מיקרומטר ל'C'. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור 1, וכאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של תרשים 1C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המתואר במסמך זה מספק מערכת מודל חדשה שבו ללמוד פיתוח ואפיון פונקציונלי של מיקרוגליה מופעלים ותאים globoid. עבודה מוקדמת של אל Im et. באמצעות שורת תאי HEK293 סיפק תבנית לפיתוח הפרוטוקול הנוכחי לחקר תא globoid היווצרות 21. כמו כן, חשוב להצביע על כך שתאי globoid נגזרים במודל שונה מתאי globoid האם של זיהוי בGLD. לדוגמא, יש לנו ציינו באופן שגרתי quadranucleation של מיקרוגליה בתרבויות העכבריות שלנו, בזמן שהתאים globoid בGLD נצפו לעתים קרובות מכילים מעל 10 גרעינים. שנית, תאי globoid נוצרו במערכת במבחנה גם קטנים בקוטר כבהשוואה לאלו שנצפו בvivo. יש עשוי להיות מספר סיבות להבדלים פנוטיפי אלה שעשויים לכלול את הפשטות היחסית של מערכת התרבות בשימוש. לדוגמא, איןנוירונים או oligodendrocytes נוכחת במהלך שלב האינדוקציה של היווצרות תאי globoid באמצעות הליך תרבות זו עיקרי גליה. כמו כן, התזמון של פרוטוקול היום שבעה מניבה צפיפות משמעותית של תאי globoid; עם זאת, פעמים טיפול ארוכות יותר עשויות לשפר עוד יותר את הדמיון של תאי globoid העכבריים שהוקמו על ידי פרוטוקול זה עם תכונות יליד תאי globoid נצפו בGLD.
תכונה חשובה של המודל הזה היא שהוא משתמש בתרבויות עיקריות מעורבות גליה, הכוללות הן האסטרוציטים ומיקרוגלי 15,19. זהו יתרון חשוב של מודל תא globoid זה לשירות שלה בהערכת התרומות ויחסי הגומלין בין האסטרוציטים ומיקרוגלים. שני סוגי התאים שאינם myelinating אלה מופעלים בGLD, אם כי תפקידם במחלה זו הן, עדיין, מאופיין בצורה גרועה. חשוב לציין, שקבענו בעבר כי האסטרוציטים בGLD להביע ורמות גבוהות יותר של MMP-3 ביטוי שזה כנראה astrocyte-derivגורם אד היה קריטי להפיכתו של מיקרוגליה בתגובה לpsychosine. יישומים עתידיים של מודל זה במבחנה של היווצרות תאי globoid יכולים להעסיק תרבויות chimeric של האסטרוציטים ומיקרוגלים של רקע גנטי שונה, אשר יכול להיות מועסק על מנת לקדם את ההבנה של תרומת התא ספציפי להשפעות פתוגניים של psychosine במיקרוגלים שלנו.
לסיכום, פרוטוקול זה מספק גישה חדשה ללמוד את הפתוגנזה של GLD. התפקיד של תאי globoid היה מסתורי והשערות על פונקציות מגן או מזיקות שלהם בGLD הוצעו. זיהוי המוקדם של תאי globoid בהיסטוריה הטבעית של GLD יתמוך נוסף לדעתנו בשלב זה כי הפעולה של המיקרוגליה בGLD היא תגובה פתוגניים ראשונית ומתווך סביר של פתולוגיה המיאלין במחלה זו. הסתגלות של מערכת מודל במבחנה זו צפויה לקדם את ההבנה שלנו על הדואר הסלולריtiology של GLD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing no cations (Mg2+ and Ca2+). | Life technologies | 14175-095 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi | 130-092-628 | |
| 40 μm cell-strainer | Fisherbrand | 22363547 | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing cations (Mg2+ and Ca2+). | Gibco | 14025-092 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Penicilin/Streptomycin | Life technologies | 15070-063 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Trypsin-EDTA solution | Life technologies | 25299-056 | |
| Psychosine | Sigma | P9256 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 19208 | |
| Normal Goat Serum (NGS) | Invitrogen | PCN5000 | |
| Iba-1 | WAKO | 019-19741 | |
| Alexa Fluor conjugated antisera | Life Technologies | Various | |
| Mounting Media | Southern Biotech | OB100-01 | |
| Phagocytic Assay Kit | Cayman Chemicals | 500290 | |
| HEPES | Sigma | BP310-500 |
References
- Rafi, M. A., Luzi, P., Chen, Y. Q., Wenger, D. A. A large deletion together with a point mutation in the GALC gene is a common mutant allele in patients with infantile Krabbe disease. Hum Mol Genet. 4, 1285-1289 (1995).
- Duffner, P. K., et al. The long-term outcomes of presymptomatic infants transplanted for Krabbe disease: report of the workshop held on July 11 and 12. Genet Med. 11, Holiday Valley, New York. 450-454 (2008).
- Duffner, P. K., Jalal, K., Carter, R. L. The Hunter's Hope Krabbe family database. Pediatr Neurol. 40, 13-18 (2009).
- Duffner, P. K., et al. Newborn screening for Krabbe disease: the New York State model. Pediatr Neurol. 40, 245-252 (2009).
- Krabbe, K. A new familial, infantile form of brain sclerosis. Brain. 39, 74-114 (1916).
- Percy, A. K., Odrezin, G. T., Knowles, P. D., Rouah, E., Armstrong, D. D. Globoid cell leukodystrophy: comparison of neuropathology with magnetic resonance imaging. Acta Neuropathol. 88, 26-32 (1994).
- Itoh, M., et al. Immunohistological study of globoid cell leukodystrophy. Brain Dev. 24, 284-290 (2002).
- Reddy, A. S., Patel, J. R., Vogler, C., Klein, R. S., Sands, M. S. Central nervous system pathology progresses independently of KC and CXCR2 in globoid-cell leukodystrophy. PLoS One. 8, (2013).
- McNally, A. K., Anderson, J. M. Macrophage fusion and multinucleated giant cells of inflammation. Adv Exp Med Biol. 713, 97-111 (2011).
- Kaneko, Y., Kitamoto, T., Tateishi, J., Yamaguchi, K. Ferritin immunohistochemistry as a marker for microglia. Acta Neuropathol. 79, 129-136 (1989).
- Graeber, M. B., Streit, W. J., Kreutzberg, G. W. The microglial cytoskeleton: vimentin is localized within activated cells in situ. J Neurocytol. 17, 573-580 (1988).
- Kondo, Y., Adams, J. M., Vanier, M. T., Duncan, I. D. Macrophages counteract demyelination in a mouse model of globoid cell leukodystrophy. J Neurosci. 31, 3610-3624 (2011).
- Pollanen, M. S., Brody, B. A. Fetal globoid cell leukodystrophy. Arch Pathol Lab Med. 114, 213-216 (1990).
- Martin, J. J., et al. Fetal Krabbe leukodystrophy. A morphologic study of two cases. Acta Neuropathol. 53, 87-91 (1981).
- Ijichi, K., et al. MMP-3 mediates psychosine-induced globoid cell formation: Implications for leukodystrophy pathology. Glia. , (2013).
- Pellegatta, S., et al. The therapeutic potential of neural stem/progenitor cells in murine globoid cell leukodystrophy is conditioned by macrophage/microglia activation. Neurobiol Dis. 21, 314-323 (2006).
- Crocker, S. J., Milner, R., Pham-Mitchell, N., Campbell, I. L. Cell and agonist-specific regulation of genes for matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors by primary glial cells. Journal of Neurochemistry. 98, 812-823 (2006).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J Vis Exp. , (2013).
- Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia. Glia. 56, 1187-1198 (2008).
- Moore, C. S., et al. Astrocytic Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1 (TIMP-1) Promotes Oligodendrocyte Differentiation and Enhances CNS Myelination. J Neurosci. 31, 6247-6254 (2011).
- Im, D. S., Heise, C. E., Nguyen, T., O'Dowd, B. F., Lynch, K. R. Identification of a molecular target of psychosine and its role in globoid cell formation. J Cell Biol. 153, 429-434 (2001).
