Abstract
球様細胞白質萎縮症（GLD）の中枢神経系においてユニークに豊富に存在する球様細胞と呼ばれる多核ミクログリアの正確な機能は、不明である。知識のこのギャップは、研究のためのin vitroモデルで適切なの欠如によって妨げられてきた。ここで、私たちは初代マウスグリア培養系を記述するGLDで見られる特徴的な球様細胞に似たミクログリアの多核化におけるサイコシン結果による治療中。この新規なシステムを用いて、グロボイド細胞の研究のための条件および分析のモードを定義した。このモデル系の使用の可能性は、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）のための潜在的な役割を同定し、当社の以前の研究で検証された-3 GLDに。 インビトロ系でのこの小説はこれらのユニークな細胞の形成と機能だけでなく、潜在的な治療操作を、研究するのに有用なモデルかもしれません。
Introduction
また、クラッベ病として知られている球様細胞白質萎縮症（GLD）は、galatocerebrosidase（GALC）遺伝子1における機能変異の喪失に起因する致命的な脱髄性疾患である。 GLDの最も一般的な形態は、幼児期に発症に代表される、多くの場合、年齢2,3、5年前にモーターと早死につながる認知機能低下の積極的な臨床経過することを特徴とする乳児変種です。遺伝子検査は、GLD 4の診断を確認するために使用される。 GLDの神経病理は、球様細胞5-7と呼ばれる広範な脱髄、神経細胞の萎縮、アストログリオーシスおよび充血多核ミクログリアの存在が明らかになる。これらの目立つ細胞の特定の機能は、とらえどころのない推移しているものの、多くの場合、それらの細胞質内に管のある介在物を含む球様細胞の同定は、過去97年間のGLDの決定的な特徴となっている。
非myelの関与GLDの病因におけるinatingグリア（ミクログリアおよびアストロサイト）は、長いこの病気8における深遠な脱髄に二次応答と考えられてきた。興味深いことに、1916年5クヌードクラッベによるこの病気の最初の説明は、「球様細胞」と命名し、この病気の決定的な特徴であるされた脂質の破片を含む多核食細胞の形成を報告した。
GLDでの役割は長い間無視されてきたが、球様細胞は、GLDの病理学の顕著な特徴である。興味深いことに、これらの細胞は、GLDのCNS組織における最も初期の特徴的な変化の一つである。知識の欠如が原因多核食細胞の形成は、他の疾患における巨細胞と呼ばれることを前提に、一般的に病理の結果ではなく、初期の病原性駆動力9とみなされている可能性があります。したがって、WHIのメカニズムを調査し、いくつかの研究がなされているchのグロボイド細胞が特にGLDのCNSにおいて、食細胞から形成される。本報告書に記載されている手順は、CNS中球様細胞の形成及びin vitroでのミクログリアのこれまでのデモサイコシン誘発性多核化の重要性に焦点を当て、これらの細胞は食作用活性の高いレベルを示した。これらの観察と一致して、トウィッチャー脳における球様細胞は、頻繁に食作用活性の高いレベルを示唆し、PAS陽性の破片が含まれています。グロボイド細胞はまた、フェリチンのために免疫陽性であることが見出されている（小膠細胞のマーカー）10、KP-1 / CD68（単球マーカー）、およびいくつかはまた、ビメンチンに対して陽性である（中間径フィラメントタンパク質およびアストロサイトのマーカーおよび活性化ミクログリア）11、 HLA-DRA（MHCII表面受容体）、およびTNF-α7、及び伊庭-1 12（小膠細胞を識別するために使用されるカルシウム結合タンパク質）。マーカーのこのコレクションをもとに、球様細胞が発達ミクログリアから発信ユニークな表現型。
彼らの独自性にもかかわらず、特定の機能とGLDの病因へのGCの寄与が大部分は見落とされています。球様細胞は、慢性脱髄の二次的な結果であると考えられてきた。しかし、GLDの白質の病理学に球様細胞の時間的関連性を検討し、過去の研究では、出生後早期の期間に、後期胚形成中球様細胞の存在を同定した。オリゴデンドロサイトのアポトーシスおよび明白な脱髄13に先行回。したがって、GLDにおいて神経病理の発症の時間的シーケンスは、グロボイド細胞がこの疾患の14脱髄の予め形成されていることを示唆している。これはGLD中球様細胞の初期形成はオリゴデンドロサイトのダメージ15に二次的に、反応性応答ではなく、定義する病原性事象を表すことが私たちの仮説につながった。さらに、GLDにおけるミクログリアの活性の調節不全は、事実上考えられてきたrは、この疾患を治療するための16 hematopeotic幹細胞治療の長期有効性を制限する。したがって、プシコシンに応答して細胞機能及びミクログリアの規制、グロボイド細胞を、調査GLDの病因に新たな洞察を提供することが期待される。
最近まで、球様細胞の形成を研究するための適切なモデルの欠如は、GLDの病理学にこれらの細胞の正確な機能と貢献の理解を制限されていた。最近の研究では、グロボイド細胞様細胞がプシコシンに直接応答して、GLDに蓄積する病原性脂質毒素を形成することができることが判明した。私たちは、ミクログリアを発見したではなく、マクロファージは、活性化され、15をサイコシンに応じて、一次グリア培養における球様細胞に形質転換する。球様細胞へのこの変換は、細胞外プロテアーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）-3 15により媒介されることが見出された。さらに最近では、私たちこのin vitroモデル系で開発されたものサイコシン活性化ミクログリアと球様細胞をこれらの調査結果を拡張し、決定したオリゴデンドロサイトおよびオリゴデンドロサイト前駆細胞に強力に有毒である。したがって、GLD、サイコシンやこの疾患におけるミクログリアのための新たなプライマリおよびおそらく病原性の役割を支持する脱髄の前に球様細胞の形成の初期の蓄積の文脈で考えると。
私たちは、球様細胞形成の研究は、この病気の理解に貢献するGLDの病因に関する新しい情報を明らかにすることを提案する。また、GLDこの新しい細胞モデルは、この疾患の病理学的変化に対処するための新規な治療的アプローチをテストすることができ、そこから新たなフォーマットを提供することができる。したがって、本報告書で、私たちは、非ミエリン形成グリアの初代培養からサ イコシン誘発性球様細胞のインビトロ開発のための詳細なプロトコルを提供する。
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Protocol
動物に関わるすべての手順は、実験動物の愛護管理と使用に関する方針に従って行った実験動物福祉（NIH）の事務所が定めるだけの大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）から承認を得てコネチカット保健センター。
混合グリア培養物の調製
- 使用前にすべての楽器を滅菌する。冷たい保つために氷の上で維持さ3の滅菌60ミリメートルペトリ皿にマグネシウム（Mg 2 +またはCa 2 +を）全くの陽イオンを含まない氷冷滅菌ハンクス液（HBSS）の3ミリリットルを追加します。
- 以前に17,18に記載されているように、出生後のP0〜P2の仔マウスからの皮質を分離します。
注：このような海馬などの皮質下構造は、これらの培養物に含まれていません。 - ねを使って、慎重に髄膜を除去した後、新鮮なHBSSに隔離皮質を転送し、酵素的に組織を解離製造業者のプロトコルに従ってウラル組織切開キット。
- プレート細胞無菌T-175フラスコに及び[1×ペニシリン/ストレプトマイシンを含む10％ウシ胎児血清（FBS）を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）]を培地中で一晩インキュベートする。
- 新鮮な培地と次の日、すべてのメディアを交換してください。約3週間または携帯単層が確立されるまで、通常のメディアの変化と、文化をインキュベートし続けます。
注：1の比率19：この単層は、約10とアストロサイトとミクログリアから構成されます。
混合グリア培養における2球様細胞の誘導
- ECMでコーティングされたカバースリップを準備します。
- 30分間滅菌したペトリ皿中の滅菌1N塩酸酸（HCl）で円形のカバースリップを浸す。滅菌水の3倍とカバーガラスを洗浄した後、少なくとも20分間、95％エタノールに浸します。した後、空気乾燥させます。
- 希釈された細胞外MATR地滴パラフィルムのシート上九（ECM）タンパク質コーティング材料（滅菌リン酸緩衝液[PBS]中に溶解ラミニンを10μg/ mlの、例えば 150〜250μlの/滴）。これらの液滴の上に置かれたときにカバーガラスが接触しないように液滴を配布します。静かに鉗子を用いて、液滴上にそれぞれ乾燥したカバースリップを配置。
- 約のための小滴上にカバースリップのままにしておきます。サッシと培養フード内部の4-6時間はクローズ。
- 24ウェルプレートのウェルのそれぞれにECMコーティングされたカバースリップ（ECMコーティングされた面を上）を配置します。滅菌PBSで3回で各ウェルを洗浄し、必要になるまで4℃で保管してください。
- カバーガラス上にめっき用のグリア細胞を調製する。
- グリア培養物から培地を吸引除去し、穏やかに滅菌PBS 10mlでグリア単層3回洗う。次に、T-175 8〜10 mlトリプシン-EDTA溶液を加え、37℃で5〜10分間インキュベートする。
- 単層の大部分が分離されたら、完全培地20mlのを追加フラスコにトリプシン処理を停止します。 50mlの円錐チューブに分離した細胞を含む培地を収集し、室温で300×gで10分間スピン。
- 優しくP1000ピペットを用いて溶液をピペッティングすることによって新鮮な完全培地2ml中で細胞を再懸濁後、ペレットを乱すことなく、上清を吸引します。
- 所望の密度（ 例えば 、10 5細胞/ ml）での血球計算板を用いて細胞、完全培地中で再懸濁した細胞の数を決定します。プレートのECMコーティングされたカバーガラス上に細胞（ 例えば 500μlの24ウェルプレートの各ウェルに）。 37℃でのインキュベーションの3〜5日間の各ウェルに追加の新鮮な完全メディアを追加するか、細胞が所望の視覚コンフルエンスに成長するまで。
- サイコシンでの治療。
- ストック濃度のジメチルスルホキシド（108.3ミリモル）（DMSO）にサイコシンを再構成。ワーキングストックを作るために100％EtOHにこのストックを希釈することができますnは10μMの最終濃度を達成するために、24ウェルプレートの各ウェルに添加すること。
- プシコシンを追加する時に、穏やかに培養培地中にプシコシンを混合する培養プレートを旋回させる。一週間一日おきに、10μMと同等のものを追加することでサイコシンサプリメント。
- プシコシン処置の7日後、各ウェルに冷4％パラホルムアルデヒド（PFA）の培地および500μlのピペットを収集する。細胞を固定するために20分間室温でインキュベートする。その後、PBSで各ウェル3回洗浄し（下記参照）、免疫細胞化学のために処理するまで、4℃でプレートを保つ。
注記：所望であれば、細胞培養培地は、この時点で酵素的またはELISAアッセイ用に回収することができる。
球様細胞を可視化するために3。免疫細胞化学（ICC）
- ブロッキング緩衝液をPBSに交換し、[PBS + 0.3％のTween-20 + 5％正常ヤギ血清（NGS）]、そして室温で1時間、細胞をインキュベートする。
- 中に伊庭-1に対する一次抗血清中の固定された細胞をcubate [（1：1,000）PBSで希釈+ 0.3％+ 2％NGS-20トゥイーン]室温で少なくとも1時間、その後PBSで3回、5分間でそれぞれをよく洗う/洗う。
- 核を識別するための4 '、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール（千DAPI、1）で抗体標識及び対比染色のプライマリを識別するために適切な二次蛍光標識抗体を加える。室温で1時間、二次抗体溶液中でインキュベートし、PBSで3×5分間洗浄する。
- 封入剤を使用したスライドを顕微鏡に、各カバーガラスをマウントします。ビューは、視覚的·定量分析のための蛍光顕微鏡にスライドさせる。
4。分析と初代培養中球様細胞の特性評価
- 培養中の球様細胞を識別するために、次の3つの形態学的基準を使用します。
- ミクログリアマーカー、伊庭-1 +のための免疫標識により、蛍光顕微鏡を用いて、球様細胞を識別します。
- 確認する多核として球様細胞（ すなわち 2つ以上のDAPI陽性核を含む）。
- ミクログリア細胞休止の高度に分岐した外観とは異なる丸い形態によって球様細胞を識別します。
注：細胞はまた、これらの培養物からのフローサイトメトリーによる細胞表面マーカー分析および定量のために回収することができる。
- ミクログリアおよび球様細胞の貪食活性化を測定する
- プシコシン処理したミクログリアの食作用活性を評価するために、メーカーの指示に従ってウェルにFITCで標識したラテックスビーズを加える。前PFAで固定し、蛍光共役ラテックスビーズ48時間を追加します。ビーズで処理した細胞（セクション2.4で述べたように）、および免疫細胞化学のためのプロセスを（セクション3で説明したように）修正しました。
- 彼らは、フルオロフォア標識されたビーズの蛍光発光スペクトルと重複しないようにフルオロフォア結合二次抗体を選択する。
- ANALYZ電子蛍光標識ビーズと共局在する細胞を同定することにより、伊庭-1 +ミクログリアの貪食プロファイル。
注：サイコシンがミクログリアを活性化します。貪食ビーズは、この培養設定で単核および多核伊庭-1 +細胞内で識別されます。
精製ミクログリア培養から球様細胞の誘導5。
注：アストロサイトとミクログリアの間に間シグナルを解読するための代替アプローチは、 この in vitro球様細胞モデルのもう1つの利点である。次の手順（セクション5.2を参照）で説明したように再播種または共培養のための一次ミクログリア細胞の精製は、培養中のそれらのより低い粘着性によって達成することができる。
- 50mlの円錐チューブにコンフルエント混合グリア培養物からメディアを集め、インキュベーター中、37℃で、それを維持する。
- 次混合グリア培養物からミクログリア離。
- コンフルエント混合グリア培養T175フラスコから培地を除去した後、[+ 25mMの4-（2 - ヒドロキシエチル）-1 - ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）+ 25 mMの重炭酸ナトリウム（Sigma）を完全培地からなる]暖かい振盪メディアを追加する。 100rpmで（37℃）で、オービタルシェーカーで3〜4時間にわたってフラスコを振る。 50mlコニカルチューブにこれらの振とうフラスコから培地を収集します。
注：このメディアは、フラスコからあまり付着性ミクログリアが含まれます。 - 室温で10分間300×gでメディアをスピン。アストロサイト馴化培地2ml中の細胞を再懸濁後、上清を吸引し、（ステップ5.1に集め）。
- 血球計数器を用いて獲得したセルの数を確立した後、基板コーティングしたカバーガラス上にミクログリア細胞をプレート（セクション2.1を参照）免疫細胞化学のために、または他の細胞型との共培養のための球様細胞の将来の収集のために超低付着ウェルプレート上にプレート、そのようなオリゴデンドロサイトなど（DESCなど次の項のribed）。
注：一度（セクション2.3を参照）のようにミクログリアはサイコシン（10μM）で処理することができるメッキ。
- コンフルエント混合グリア培養T175フラスコから培地を除去した後、[+ 25mMの4-（2 - ヒドロキシエチル）-1 - ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）+ 25 mMの重炭酸ナトリウム（Sigma）を完全培地からなる]暖かい振盪メディアを追加する。 100rpmで（37℃）で、オービタルシェーカーで3〜4時間にわたってフラスコを振る。 50mlコニカルチューブにこれらの振とうフラスコから培地を収集します。
- 細胞毒性分析のための一次オリゴデンドロサイトとの共培養。
NOTE：オリゴデンドロサイト、またはオリゴデンドロサイト前駆細胞の初代培養物へのその後の共培養のための低接着プレートからプシコシン処理したミクログリアの収集は、 インビトロでのこれらのグロボイド細胞様細胞の潜在的な細胞傷害性機能を調べるために使用することができる。- 確立された方法18,20を使用して、プライマリオリゴデンドロサイトの培養液を開発する。サイコシン処理したミクログリアを収集するには、静かに井戸の底から緩く接着細胞を分離するためにピペット。細胞を収集し、10分間300×gで遠心分離し、次に注意深くオリゴデンドロサイト分化培地に再懸濁[（1×）L-グルタミン、神経基本培地からなる、B-27サプリメント（1×）、およびトリヨードチロニン（T3、10ng / mlの）]。
- 血球計数器を用いて細胞数をカウントした後、おおよそ1になり、1×10 5細胞/ mlで、オリゴデンドロサイト培養上ミクログリアをシード：2ミクログリア/オリゴデンドロサイトの比率。最大3日間共培養として培養する。
- 免疫細胞化学のために細胞を修正しました。（セクション2.4を参照）。 ELISAのために細胞培養培地を収集したり、必要に応じて化学分析。
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Representative Results
このプロトコルは、書かれたように、（：実験ワークフロースキーム図1を参照してください）最初から最後まで完了するのに約36日かかると予想される。サイコシンに応答した多核細胞の形成は、一貫して7日間の処理で観察されている：それは、この初代培養系における「球様様」細胞の開発は信頼性と再現性の両方であることを私たちの経験をされています。
大型の識別を可能にする核対比染色と併せて伊庭-1を使用しミクログリアの免疫細胞化学染色は、多核細胞を丸く（ 図1b）。いくつかの例では、これらの球様細胞様細胞の核内容が明確な核と一緒に表示されます。しかし、多くの場合、核の大きさの総額の拡大は、これらの細胞（ 図1b）の多核の状態を反映している。グロボイド細胞様細胞の数は、視野を視野で変えることができるそれはインビトロで形成された球様細胞の割合が<総ミクログリア細胞集団の5〜10％を表していることは注目に値する。それはサイコシン治療はまた、これらの培養における単核ミクログリアおよび多核球様細胞（GCS）の中で治療をサイコシンに応答して発生したミクログリアの一般化された活性化（食作用活性、すなわち測定可能な増加）を連想させることを指摘することも重要です。 図1cに示すように、オリゴデンドロサイト前駆細胞（OPCの）との共培養中に入れたとき、伊庭-1 +ミクログリアの食作用活性なプロファイルを容易に識別することができる。
この細胞培養系は、グロボイド細胞の生物学を評価するための手段として、実験操作に適している。例えば、私たちは最近、このCULを使用してサイコシン誘発性GC形成の重要なメディエーターとして細胞外プロテアーゼ、マトリックスメタロ-3（MMP-3 /ストロメライシン1）のための新規の役割を実証しているトゥーレアッセイ15。
図1：球様細胞形成の初代培養のin vitroモデルの実験的ワークフロー（A）フローチャートは、主なステップを示すと文化球様細胞の発達のために（日単位）回介在。各ステップは、プロトコルからそれに関連するテキストセクションで標識されている。 （;セクション1アストロサイトやミクログリアの文化）と精製されたミクログリア（第5節）、（B）サイコシンの7日間連続の後に多核ミクログリア細胞の代表immuncytochemical染色の代替の出発培養物（10。このワークフローでは、混合から論理進行の両方を提供しますIBA1（緑）およびDAPI（青色）によって識別されるμM）処理（C）推定貪食ミクログリア細胞の例（OLIG2 +（赤）、OPCとの共培養におけるサイコシン処理した後の）緑。 「B」と「C」のために=150μmのための（パネルB）でスケールバー=90μmの。 図1Bの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックして、してくださいと、ここで、図1Cの拡大版を表示します。
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Discussion
ここに記載されているプロトコルは、活性化したミクログリアと球様細胞の発達および機能的特徴を研究するための新しいモデルシステムを提供します。イムらによる以前の研究。 HEK293細胞株を使用する球様細胞形成の研究のための21本のプロトコルの開発のためのテンプレートを提供した。それは、モデルで導出球様細胞がGLDにおける識別可能なネイティブ球様細胞とは異なることを指摘することも重要です。 GLD中球様細胞が頻繁に10の核を超える含有が観察されているが、たとえば、私たちは日常的に、私たちのマウス培養におけるミクログリアのquadranucleationを観察している。 in vivoで観察されるものと比較して、第二に、in vitroの系で形成された球様細胞も直径が小さい。使用される培養系の相対的な単純化を含んでもよいこれらの表現型の違いのために、いくつかの理由がある可能性が高い。例えば、全く存在しないこの一次グリア培養手順を用いて、球様細胞形成の誘導期の間に存在するニューロンまたはオリゴデンドロサイト。また、7日間のプロトコルのタイミングは球様細胞の有意な密度が得られ;しかしながら、より長い処理時間がさらにGLDで観察グロボイド細胞の天然の特徴を有するこのプロトコルにより形成されたネズミグロボイド細胞の類似性を高めることができる。
このモデルの重要な特徴は、アストロサイトとミクログリア15,19の両方が含まれる次混合膠細胞培養を、使用していることです。これはアストロサイトとミクログリアの間での貢献と相互作用を評価する上で、その有用性については、この球様細胞モデルの重要な利点である。この疾患におけるそれらの役割があるものの、まだ不十分な特徴とこれらの非ミエリン化細胞型の両方が、GLDで活性化される。重要なことは、私たちは以前にGLDでのアストロサイトがMMP-3発現の高いレベルで発現していると判断したこのおそらくアストロサイトDERIVことエドの要因はサイコシンに応答したミクログリアの形質転換に重要でした。球様細胞形成のこのin vitroモデルは、ミクログリアにおけるサイコシンの病原性効果に対する細胞特異的な貢献の理解を進めるために使用することができた星状細胞および遺伝的背景の異なるミクログリアのキメラの文化を採用する可能性の未来のアプリケーション。
要約すると、このプロトコルは、GLDの病因を研究するための新しいアプローチを提供します。球様細胞の役割は、謎めいていたとGLDでの保護的または有害な機能に関する仮説が提案されている。 GLDの自然史における球様細胞の早期発見は、さらにGLDにおけるミクログリアの活性化は、一次病原性応答とこの疾患におけるミエリン病変の可能性メディエータであることを、この時点で私たちの見解を支持する。 このin vitroモデル系の適応は、携帯電話、電子上の私たちの理解を促進することが期待されているGLDのtiology。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing no cations (Mg2+ and Ca2+). | Life technologies | 14175-095 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi | 130-092-628 | |
| 40 μm cell-strainer | Fisherbrand | 22363547 | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing cations (Mg2+ and Ca2+). | Gibco | 14025-092 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Penicilin/Streptomycin | Life technologies | 15070-063 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Trypsin-EDTA solution | Life technologies | 25299-056 | |
| Psychosine | Sigma | P9256 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 19208 | |
| Normal Goat Serum (NGS) | Invitrogen | PCN5000 | |
| Iba-1 | WAKO | 019-19741 | |
| Alexa Fluor conjugated antisera | Life Technologies | Various | |
| Mounting Media | Southern Biotech | OB100-01 | |
| Phagocytic Assay Kit | Cayman Chemicals | 500290 | |
| HEPES | Sigma | BP310-500 |
References
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