Introduction
Ser capaz de identificar e quantificar os níveis de expressão de proteínas é uma técnica padrão para sanidade animal e experimentos baseados em células. No entanto, apesar de um interesse de longa data no início do desenvolvimento embrionário da válvula cardíaca, avaliando a expressão da proteína neste tecido específico durante o desenvolvimento está actualmente limitada a imunohistoquímica, tanto a garota e rato 1,2. Parte da dificuldade de se quantificar a expressão da proteína nas válvulas de desenvolvimento da maioria dos organismos-modelo (por exemplo, grão e do rato) é o tamanho pequeno das válvulas, o que limita a quantidade de proteína que pode ser obtida. Assim, para análise quantitativa, os pesquisadores geralmente dependem de extração de RNA e amplificação por PCR quantitativa ou posterior análise microarray 2-5. No entanto, RNA e proteína níveis de expressão não são totalmente correlativo 6, portanto, com foco na expressão do RNA não pode fornecer uma explicação rigorosa das inúmeras mudanças que ocorrem em qualquer sinalizaçãocaminho em vários momentos durante a evolução. Com base neste limite na metodologia actualmente disponível, o objectivo deste procedimento é de desenvolver um protocolo para a obtenção de forma fiável uma quantidade suficiente de proteína a partir das regiões de rato embrionário de válvula cardíaca em desenvolvimento para a análise quantitativa das alterações que ocorrem em diversas vias de sinalização que são importantes em a maturação deste tecido.
As válvulas são normalmente já embrionárias dissecados a partir de ratinhos para isolamento de ARN e a análise da expressão do gene posterior 2-5. No entanto, estes estudos têm sido limitados a usar a expressão do gene como ler-out de sinalização da ativação da via, que não permite a detecção de detectar modificações pós-traducionais de proteínas que podem afetar a sinalização a jusante. Usando as técnicas de isolamento de RNA como um ponto de partida, que começou com dissecando as regiões de interesse. Porque o nosso interesse foi detectar proteínas fosforiladas que eram indicativos de sinalização patatividade HWAY durante um período específico de desenvolvimento da valva aórtica (E13.5-14.5), realizamos todas as dissecções em tampão Tris livre de fosfato e recolheu as válvulas em um tampão de lise baseada em Tris com inibidores da protease e fosfatase. No nosso caso, apenas as regiões de válvulas aórticas foram recolhidas, mas a região da válvula pulmonar pode ser facilmente obtida ao mesmo tempo. As regiões valvares, foram homogeneizadas e combinado com um tampão de amostra que está sendo usado para estudar a expressão da proteína em válvulas cardíacas adultas 7. Usando pequenos volumes de amostras (por exemplo, 2 mL) e reunindo regiões de válvulas a partir de embriões com o mesmo genótipo, fomos capazes de detectar proteínas fosforiladas e não fosforilado no dia embrionário 13,5 8. Porque as regiões da válvula podem ser congeladas e armazenadas em tampão de lise, os embriões podem ser genotipados se necessário antes agrupamento.
Esta técnica amplia o conjunto de ferramentas que estão disponíveis para avaliar signalin celularg vias durante o desenvolvimento e fornece um elogio quantitativo de imuno-histoquímica, especificamente para as válvulas cardíacas em desenvolvimento. Esta técnica deve ser um benefício não só para os cardiologistas de desenvolvimento, mas também a todos os biólogos do desenvolvimento que trabalham com embriões em estágio inicial está interessado em regiões que contêm tecido limitado.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill.
1 Imposto de Válvula Aórtica
- Usando uma técnica de eutanásia aprovado para o estágio embrionário de interesse, a eutanásia um ratinho grávida com crias no dia embrionário desejado (E) de desenvolvimento.
- Usar 70% de etanol para esterilizar o abdómen da mulher grávida. Levante a pele e músculos do abdômen inferior para cima e longe dos órgãos internos, e dissecar cavidade abdominal inferior aberta da fêmea para permitir o acesso ao corno uterino.
- Para recuperar o corno uterino, manter o colo do útero com uma pinça e caudal cuidadosamente cortadas para a pinça. Levante o corno uterino, o corte de qualquer tecido conjuntivo que mantém o chifre no local, e concluir a remoção por corte da junção do corno uterino com a tuba uterina.
- Coloque o corno uterino dissecado em uma placa de Petri contendo cold 0,1 M de tampão Tris (pH 7,6) e enxaguar, conforme necessário. Em seguida, corte o corno uterino aberto longitudinalmente para expor os sacos embrionários.
- Para expor o embrião, cortar abrir um saco embrionário na junção da placenta e o embrião e o corte dos vasos umbilicais para libertar o embrião. Inserir o embrião dissecados numa segunda placa de Petri com frio de tampão Tris 0,1 M. Voltar a primeira placa de Petri com os restantes embriões não dissecado para gelo até estar pronta para a próxima embrião.
- Para melhorar o acesso da parede torácica dentro do embrião, decapitar o embrião. Se genotipagem é necessário, remover e guardar um pedaço tecido extra em um tubo Eppendorf colocado no gelo.
- Inserir o embrião em sua volta, e cortar a parede do peito verticalmente ao longo do lado da caixa torácica, perto de uma pata dianteira, e horizontalmente por cima do diafragma para visualizar o coração. Em seguida, abra a parede torácica para expor o coração.
- Utilizando uma pinça para segurar alta ao longo dos grandes vasos, levante o coração usando uma pinça e cortar os vasos abaixo. An, corte acima do fórceps para libertar o coração. Se os vasos pulmonares permanecem não cortados, os pulmões podem ser removidos com o coração e deve ser removido antes de continuar.
- Cortar e remover a artéria pulmonar acima do nível da válvula; nos estágios embrionários aqui descritos, a artéria pulmonar é ligeiramente opaca, o que ajuda na sua discriminação da região da válvula. Cortar logo abaixo da válvula pulmonar, evitando o miocárdio ventricular trabecular e recolher como descrito no passo 1.10, se esta região é também de interesse. Aqui e no passo seguinte, utilizar acção capilar para extrair o excesso de tampão Tris para longe da região de interesse antes da recolha em tampão de lise.
- Cuidadosamente remover a aorta distai na válvula aórtica, imediatamente acima do nível da válvula; como a artéria pulmonar, a aorta permanece ligeiramente opaca nestes estágios embrionários, auxiliando na sua remoção. Corte logo abaixo da válvula aórtica, novamente evitando o miocárdio ventricular trabeculado e transferir oválvula utilizando uma pinça para um tubo de Eppendorf com um tampão de lise 2 ul (descrito na tabela de Materiais) contendo inibidores de protease e fosfatase em gelo.
- Repita os passos 1,6-1,10 até as válvulas foram excisadas a partir de todos os embriões, recolhendo cada válvula num tubo de Eppendorf separados. Se todos os embriões têm o mesmo genótipo, todas as válvulas podem ser coletadas em um único tubo de Eppendorf.
- Se a genotipagem é para ser realizado para determinar quais as válvulas para reunir, colocar imediatamente as amostras em tampão de lise a -80 ° C até à sua utilização. As amostras podem em seguida ser combinadas, após a genotipagem (passo 2.1.1).
Extracção de Proteína 2.
- Descongelar tecidos colhidos em gelo e centrifugar a 13100 xg durante 1 minuto para recolher os tecidos em tampão de lise, na parte inferior do tubo.
- Se os embriões foram genotipados, use uma pipeta para coletar suavemente e pool de buffer de lise contendo as regiões de válvulas a partir de embriões com genótipos similares. Para garantir uma forte be, reunindo 3-4 regiões de válvulas a partir de embriões E13.5 é recomendado por exemplo.
- Se todos os embriões eram do mesmo genótipo e todas as regiões de válvulas foram colhidas em conjunto no passo 1.10, lisar a totalidade da amostra, tal como descrito na etapa 2.2.
- Verificar o volume da amostra combinada resultante e adicionar tampão de lise para um volume total de 40 ul; então, interromper e homogeneizar amostras utilizando cinco milímetros esferas de aço inoxidável em tubos Eppendorf. Operar o lyser para 2-4 min a 50 Hz, de acordo com as instruções do fabricante. Tubos girar rapidamente, (~ 13.100 xg por 1 min) e de transferência de amostras para novos tubos, deixando para trás os escombros insolúvel.
- Preparar e amostras separadas para SDS-PAGE e transferência para a subsequente análise de mancha de Western, seguindo um protocolo tal como Eslami et al, 9. Blotting para uma proteína de controlo de carga é essencial para a quantificação de proteínas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Usando esta técnica de preparação, nós fomos capazes de detectar fosforilada Smad 1,5,8 (pSmad) nas regiões única válvula aórtica de E13.5 embriões. Como mostrado na Figura 1A, a proteína isolada a partir de mesmo uma única região de válvula é capaz de detectar uma banda pSmad fraco. A intensidade de sinal aumenta proporcionalmente com o número de regiões de válvula, que são reunidas. É importante notar que a relação pSmad / β-actina permanece quase constante entre os diferentes tamanhos de amostra (Figura 1C). Devido aos baixos níveis de proteína disponível, a mesma membrana não pode ser removido e sondado para total de Smad. No entanto, uma mancha em separado, indicando um total de Smad e β-actina mostra o mesmo padrão de expressão (Figura 1B).
Estas regiões de válvulas são quase inteiramente desprovida de contaminar miocárdio ventricular. Usando esta técnica de preparação em combinação com amostras do ventrículo direito, não fomos capazes de detectar ventricular ANP marcador miocárdio em regiões da valva aórtica, que este marcador foi facilmente detectada no ventrículo (Figura 2). Além disso, o miocárdio marcador da miosina de cadeia leve de 2V ventricular também é facilmente detectada na amostra ventricular, mas é dificilmente detectável nas regiões da válvula aórtica. Estes resultados suportam a precisão da dissecção.
Figura 1 Smad fosforilação em regiões embrionárias da válvula aórtica. Amostras foram preparadas com o aumento do número de regiões de válvula aórtica do rato embrionário reunidas, variando de 1 a 4 regiões de válvula por amostra. Cada amostra compreende todas as proteínas isoladas a partir da região de válvula inteira (s) em um volume total de 25-28 ul. Tecidos preparadas foram então submetidas a análise de mancha de western para fosforilada Smad1,5,8 (pSmad) (A), Smad1 total (C), e β-actina (A, C). A proteína foi detectada usando Lumigen ECL Ultra e fotografada com software UVM VisionWorks. A intensidade da banda de pSmad e β-actina é proporcional à quantidade de material de partida, tal como quantificada, em (B), utilizando o software ImageJ. Os dados apresentados são a média e desvio padrão de duas manchas distintas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. regiões de válvulas aórticas não expressam marcadores de miocárdio ventricular. Amostras foram preparadas com o aumento do número de regiões de válvula aórtica do rato embrionário reunidas, variando de 1 a 4 regiões de válvulas por exemplo, ou com umamostra do ventrículo direito. As amostras foram processadas tal como descrito na Figura 1 e transferidas para o miocárdio ventricular marcadores ANP (A) e da cadeia leve da miosina (MLC) -2V (B). O ANP é completamente restrito à amostra ventricular, e MLC-2v é expresso em níveis muito baixos em comparação com a amostra do ventrículo. β-actina é mostrado como um controlo de carga.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A capacidade de quantificar os níveis de proteína no início de rato embrionárias e Chick regiões da válvula cardíaca fornece uma ferramenta adicional para a compreensão dos eventos de sinalização celular críticos para o desenvolvimento da válvula. Nosso protocolo aqui descrito não diferem muito de procedimentos de isolamento de proteína padrão. No entanto, modificando alguns passos fundamentais, temos obtido sucesso proteínas fosforiladas de extremamente pequenas amostras. Para alcançar este resultado, os passos seguintes são de particular importância. Para assegurar que a proteína de qualidade é obtido, é crucial para manter as amostras refrigerada, se em gelo usando tampões ou gelados, na presença de protease e, se necessário, os inibidores da fosfatase. Além disso, a homogeneização com um dispositivo que é projetado para processar pequenos volumes de amostras é essencial para interromper adequadamente membranas celulares. Mesmo com essas precauções, o rendimento obtido de proteína pode ser demasiado baixa para ser detectada através do teste de Bradford com um espectrofotômetroou um kit de quantificação de proteínas e ainda tem amostra disponível para análises posteriores. Fomos capazes de determinar que cada região da válvula aórtica contém aproximadamente 1 mg de proteína, reunindo sete regiões da válvula aórtica e usando toda a amostra para quantificação. Apesar desta limitação, a proteína é obtida suficiente para detectar proteínas fosforiladas e não-fosforilados, embora a falta de quantificação prévia torna essencial um controlo de carregamento. Nós especificamente utilizado β-actina, porque é uma proteína de alta abundância, o que nos permitiu detectá-lo mesmo após a remoção da membrana inúmeras vezes; o seu peso molecular diferente dos seus proteínas de interesse; e que é expressa ubiquamente. Um ensaio de Western blot, com diferentes números de amostras reunidas é recomendado para determinar o número de tecidos devem ser reunidas para tanto as regiões de válvulas cardíacas embrionárias a outros estádios de desenvolvimento ou para outras pequenas tecidos de interesse. Além disso, recomendamos a reunir, pelo menos, três tamostras de emissão para cada amostra de proteína para explicar a variabilidade no tamanho dos tecidos dissecados, bem como no tempo de cada embrião sentou em gelo antes da dissecação. Se a proteína de interesse não pode ser detectado através de Western blot, mesmo após a agregação amostras, recomenda-se reduzir o volume da amostra e aumentando o tempo de homogeneização para assegurar que toda a proteína de potencial disponível para a detecção. Além disso, os inibidores de protease podem também ser adicionados ao tampão Tris arrefecido com gelo durante dissecações para proteínas instáveis ou facilmente degradadas. Se a proteína de interesse é expressa em níveis baixos, a solução de problemas durante a porção de western blot da experiência, tais como ajustando a incubação do anticorpo primário, ou o método de detecção do substrato, pode ajudar a visualização.
Se os elementos (por exemplo, imuno-histoquímica ou hibridação in situ), sugere que uma proteína de interesse é expressa tanto nas válvulas cardíacas e o arrending miocárdio, o miocárdio artéria aorta ou pulmonar pode ser provocado para além suavemente com agulhas de tungstênio, mesmo de válvulas de embriões E12.5 5. Porque este passo adicional irá prolongar o tempo de dissecção e adicionar dificuldade técnica significativa, sugerimos empregá-la quando necessário apenas. Em nosso estudo original, que começou com uma análise imuno-histoquímica que mostrou que Smad fosforilação só foi alterado no mesênquima válvula; Assim, estávamos confiantes de que quaisquer diferenças observadas via western blot foram devido a mudanças na expressão do mesênquima válvula 8. Além disso, porque as válvulas do fluxo de saída em desenvolvimento sentar na junção das grandes artérias e dos ventrículos, a execução de uma mancha de controlo de contaminação ventricular utilizando um anticorpo específico para o miocárdio ventricular, tais como ANP ou MLC-2v é recomendada.
Porque as válvulas sofrer reorganização dramática durante o seu desenvolvimento, oferecemos a seguinte específicos do estágio rRECOMENDAÇÕES para as almofadas / válvulas e seu tecido circundante. Para os primeiros almofadas (E9.5-11.5), tanto a via de saída e almofadas atrioventricular são facilmente visualizados e dissecadas devido à translucidez do miocárdio 10; No entanto, estes embriões são pequenos, e agulhas de dissecação são recomendados em vez de uma pinça e microtesouras. Para a diferenciação de fase intermédia (E12.5-14.5) 10, as válvulas semilunares (isto é, a aorta e as válvulas de artéria pulmonar) vai ser mais facilmente acessível do que as válvulas atrioventricular (isto é, válvulas mitral e tricúspide). No entanto, as válvulas semilunares deve ser cuidadosamente dissecado porque a aorta ea artéria pulmonar são septating e girando durante este período de tempo 11,12. Deve ser dada especial atenção à rotação da base da aorta e da artéria pulmonar, eo ponto médio entre essas artérias deve ser consistentemente identificados. Em estágios mais avançados de maturação válvula e condensação (E15.5 e tarde) 10, a valva mitral, tricúspide pode ser provocado longe de dentro dos ventrículos; No entanto, as válvulas semilunares deve ser mais facilmente acessível.
Análise de Western blot é uma técnica de longa data para quantificar os níveis de expressão de proteínas em válvulas cardíacas adultas 13, onde o tamanho da biópsia é grande. Em contraste, as análises embrionárias precoces cortesia concentraram-se em imuno-histoquímica ou não-quantitativo para detectar a expressão de proteínas ou a transcrição reversa PCR, em que a pequena quantidade de partida de ARNm isolado pode ser amplificado antes da análise. Estas técnicas empregadas atualmente fornecer algumas informações pertinentes a respeito de mudanças na sinalização e expressão gênica, mas não têm a capacidade de avaliar quantitativamente os níveis de proteína. Com este protocolo, agora podemos adicionar dados de expressão de proteína quantitativos para correlacionar com os dados de expressão de mRNA quantitativa e análises de imuno-histoquímica.
Este protocolo elogios técnicas estabelecidas para isolar mRNA das válvulas cardíacas embrionárias e expressão da proteína de imagem. Como tal, a combinação destas técnicas que permitem a realização de análises mais completas do ascendente e descendente regulação das vias de sinalização, a partir de mRNA para a modificação pós-traducional da proteína. Além disso, esta técnica permite a quantificação da expressão da proteína, o que irá melhorar as técnicas de imunohistoquímica atualmente utilizados. Juntos, acreditamos que esta técnica será de interesse para qualquer pesquisador interessado nas válvulas cardíacas ou preparar explantes de tecido especial as pequenas para western blot quantitativa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Timed-pregnant mouse | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| 0.1 M Tris, pH 7.6 | |||
| Microscissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Fine forceps, #5 | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Dissecting needle holders | Ted Pella Inc. | 13560 | |
| Dissecting needles | Ted Pella Inc. | 13561-10 | |
| Micropipette, 20 μl, with tips | |||
| Lysis buffer | 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton | ||
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | Add 1 tablet to 10 ml lysis buffer |
| TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | |
| Stainless steel beads | Qiagen | 69989 | |
| Microcentrifuge |
References
- Wirrig, E. E., Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Differential expression of cartilage and bone-related proteins in pediatric and adult diseased aortic valves. J Mol Cell Cardiol. 50, 561-569 (2011).
- Chakraborty, S., et al. Twist1 promotes heart valve cell proliferation and extracellular matrix gene expression during development in vivo and is expressed in human diseased aortic valves. Dev Biol. 347, 167-179 (2010).
- Lee, M. P., Yutzey, K. E. Twist1 directly regulates genes that promote cell proliferation and migration in developing heart valves. PLoS One. 6 (e29758), (2011).
- Peacock, J. D., Huk, D. J., Ediriweera, H. N., Lincoln, J. Sox9 transcriptionally represses Spp1 to prevent matrix mineralization in maturing heart valves and chondrocytes. PLoS One. 6 (e26769), (2011).
- Chakraborty, S., Cheek, J., Sakthivel, B., Aronow, B. J., Yutzey, K. E. Shared gene expression profiles in developing heart valves and osteoblast progenitor cells. Physiol Genomics. 35, 75-85 (2008).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13, 227-232 (2012).
- Meng, X., et al. Expression of functional Toll-like receptors 2 and 4 in human aortic valve interstitial cells: potential roles in aortic valve inflammation and stenosis. Am J Physiol Cell Physiol. 294, 29-35 (2008).
- Dyer, L. A., Wu, Y., Moser, M., Patterson, C. BMPER-induced BMP signaling promotes coronary artery remodeling. Developmental Biology. 386, 385-394 (2014).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
- Garside, V. C., Chang, A. C., Karsan, A., Hoodless, P. A. Co-ordinating Notch, BMP, and TGF-beta signaling during heart valve development. Cell Mol Life Sci. 70, 2899-2917 (2013).
- Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M. Fate of the mammalian cardiac neural. Development. 127, 1607-1616 (2000).
- Scherptong, R. W., et al. Morphogenesis of outflow tract rotation during cardiac development: the pulmonary push concept. Dev Dyn. 241, 1413-1422 (2012).
- Mohler, E. R., Adam 3rd, L. P., McClelland, P., Graham, L., Hathaway, D. R. Detection of osteopontin in calcified human aortic valves. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17, 547-552 (1997).
