Introduction
Å være i stand til å identifisere og kvantifisere protein ekspresjonsnivåene er en standard teknikk for dyre-og cellebaserte forsøk. Men til tross for en langvarig interesse for tidlig embryohjerteventil utvikling, evaluere protein uttrykk i denne spesifikke vev under utviklingen er foreløpig begrenset til immunhistokjemi i både dama og mus 1,2. En del av vanskeligheten med å kvantifisere protein ekspresjon i utviklings ventiler i de fleste modellorganismer (f.eks chick og mus) er den lille størrelsen av ventilene, som begrenser mengden av protein som kan oppnås. Således, for kvantitative analyser, forskere typisk avhengige RNA-ekstraksjon og etterfølgende forsterkning for kvantitativ PCR eller mikromatriseanalyse 2-5. Men RNA og protein uttrykk nivåer er ikke helt samsvarende 6, så fokus på RNA uttrykk kan ikke gi en grundig redegjørelse for de mange endringene som skjer i enhver signalepathway på ulike tidspunkter i løpet av utviklingen. Basert på denne grensen i tiden tilgjengelig metodikk, målet med denne prosedyren var å utvikle en protokoll for pålitelig skaffe tilstrekkelige mengder protein fra utviklings embryonale mus hjerteventil regioner for kvantitativ analyse av endringene som skjer i ulike signalveier som er viktige i modningen av dette vevet.
Embryonale ventiler er allerede vanlig dissekert fra mus for RNA isolering og påfølgende analyse av genuttrykk 2-5. Imidlertid har disse studier vært begrenset til å bruke gen-ekspresjon som et lese-av signalveien aktivering, som ikke tillater påvisning av detektere post-translasjonelle modifikasjoner protein som kan påvirke nedstrøms signalisering. Bruke RNA isolasjon teknikker som utgangspunkt, begynte vi med å dissekere regionene av interesse. Fordi vår interesse var å påvise fosforylerte proteiner som var veiledende signal pathway aktivitet i løpet av en bestemt periode med aortaklaffen utvikling (E13.5-14.5), vi utførte alle disseksjoner i fosfatfritt Tris buffer og samlet inn ventilene i en Tris-basert lysis buffer med fosfatase og proteasehemmere. I vårt spesifikke tilfellet, kun aortaventilen regionene ble oppsamlet, men lunge ventilen regionen kan lett oppnås på samme tid. Ventil regioner ble deretter homogenisert og kombinert med en prøvebuffer som i dag brukes for å studere protein uttrykk hos voksne hjerteklaffene 7. Ved hjelp av små prøvevolumer (f.eks 2 liter) og pooling ventil regioner fra embryo med samme genotype, var vi i stand til å oppdage fosforylerte og nonphosphorylated proteiner på embryonale dag 13,5 8. Fordi ventil regioner kan fryses og lagres i lyseringsbuffer, kan embryoene bli genotypet om nødvendig før sammenslåing.
Denne teknikken utvider sett med verktøy som er tilgjengelig for å vurdere celle signaling trasé under utvikling og gir en kvantitativ kompliment til immunhistokjemi, spesielt for utviklingshjerteklaffene. Denne teknikken bør være til nytte ikke bare for utviklings kardiologer, men også til alle utviklings biologer som arbeider med tidlig stadium embryoer er interessert i regioner som inneholder begrenset vev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Alle forsøkene ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of North Carolina i Chapel Hill.
1. Vesenet aortaklaffen
- Ved hjelp av en godkjent dødshjelp teknikk for fosterstadiet av interesse, avlive en gravid mus med unger i ønsket embryonale dag (E) av utviklingen.
- Bruk 70% etanol for å sterilisere magen til den gravide kvinne. Løft hud og muskel av den nedre del av magen opp og bort fra de indre organer, og dissekere åpen i kvinnens nedre bukhulen for å tillate tilgang til det uterine horn.
- Hvis du vil hente livmor horn, holder livmorhalsen med pinsett og nøye kutte caudal til tang. Løft livmor horn, kutte noen bindevev som holder hornet på plass, og fullføre fjerningen ved å kutte krysset av livmor horn med egglederen.
- Plasser dissekert uterine horn i en petriskål inneholdende cold 0,1 M Tris buffer (pH 7,6) og skyll etter behov. Deretter kuttet livmor horn åpen lengde-messig å eksponere de embryonale sekker.
- Å utsette fosteret, kutte åpne en embryonale sac i krysset av morkaken og fosteret og klippe navle fartøy for å frigjøre embryo. Plasser dissekert embryo i en andre petriskål med kaldt 0,1 M Tris-buffer. Returnere den første petriskål med de resterende undissected embryoer til is før du er klar for neste embryo.
- For å bedre brystveggen tilgang innen embryo, halshogge embryoet. Hvis genotyping er nødvendig, fjerne og lagre en ekstra vev brikke i en Eppendorf rør plasseres på is.
- Plasser embryo på ryggen, og kutte brystveggen vertikalt langs siden av brystkassen, i nærheten av en forbena, og horisontalt over membranen til å visualisere hjertet. Deretter åpner brystveggen for å avdekke hjerte.
- Bruk pinsett til å holde høy langs de store blodårene, løfter hjertet ved hjelp av pinsett og kutte fartøyene under. Denn, kutt over tang for å frigjøre hjertet. Dersom lungekar forbli uncut, kan lungene bli fjernet med hjertet og bør fjernes før du fortsetter.
- Skjær og fjerne lungearterien over nivået av ventilen; ved embryonale stadier som er beskrevet her, er lungearterien svakt opak, som hjelpemidler i dens diskriminering fra ventilen regionen. Kutt rett under lunge ventilen, unngå trabeculated ventrikkel myokard og samle som beskrevet i trinn 1.10 hvis denne regionen er også av interesse. Her og i det neste trinnet, bruker kapillarvirkning å trekke overskudds Tris buffer bort fra regionen av interesse før oppsamling i lyseringsbuffer.
- Fjern forsiktig aorta distalt aortaventilen, like over nivået av ventilen; som lungearterien, forblir aorta lett blakket på disse embryonale stadier, hjelpe til dens fjerning. Kutt rett under aortaklaffen, igjen unngå trabeculated ventrikkel myokard, og overføreventilen ved hjelp av pinsett til et Eppendorf-rør med 2 ul lyseringsbuffer (beskrevet i Materialer tabellen) inneholdende protease-og fosfatase-inhibitorer på is.
- Gjenta trinn 1.6 til 1.10 til ventilene er blitt skåret ut fra alle embryoer, samle hver ventil i en separat Eppendorf-rør. Hvis alle embryoer har samme genotype, kan alle ventilene bli samlet i en enkelt Eppendorf-rør.
- Hvis genotyping skal utføres for å bestemme hvilke ventiler å samle sammen, umiddelbart plassere prøvene i lyseringsbuffer ved -80 ° C inntil videre bruk. Prøvene kan samles etter genotype (trinn 2.1.1).
2. Protein Extraction
- Tin innsamlede vev på is og sentrifuger ved 13.100 xg i 1 min for å samle vev i lyseringsbuffer ved bunnen av røret.
- Hvis embryoene ble genotypet, bruk en pipette til å forsiktig samle og basseng lysis buffer som inneholder ventil regioner fra embryoer med lignende genotyper. For å sikre en sterk bog, pooling 3-4 ventil regioner fra E13.5 embryo per prøve anbefales.
- Hvis alle embryoer var av samme genotype og alle ventil regioner ble samlet sammen i trinn 1.10, lyserer hele prøven, som beskrevet i trinn 2.2.
- Kontroller volumet av den resulterende samleprøve og tilsett lysis-buffer til et totalvolum på 40 mikroliter; deretter, avbryte og homogen prøver ved hjelp av 5 mm rustfritt stål perler i Eppendorf-rør. Betjene lyser for 2-4 min ved 50 Hz, i henhold til produsentens anvisninger. Spin rør kort stund, (~ 13 100 xg i 1 min), og overføre prøver til nye rør, etterlater den uløselige rusk.
- Forbered og separate prøver til SDS-PAGE og overføring for senere vestlig blot analyse, etter en protokoll som Eslami et al ni. Blotting på en lastekontroll protein er viktig for protein kvantifisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av dette preparatet teknikken, var vi i stand til å oppdage fosforylert Smad 1,5,8 (pSmad) i enkle Aortaklaffefeil regioner fra E13.5 embryoer. Som vist i figur 1A, er tilstrekkelig til å detektere en svak pSmad bånd proteinet isolert fra en eneste ventil region. Signal intensitet øker proporsjonalt med antall ventil regioner som er gruppert. Viktigere, forblir pSmad / β-aktin ratio nesten konstant på tvers av de ulike utvalgsstørrelser (figur 1C). På grunn av de lave nivåer av protein er tilgjengelig, kan det samme ikke blot være strippet og reprobed for total Smad. Men en separat blot som viser total Smad 1 og β-aktin viser samme uttrykksmønster (figur 1B).
Disse ventil regionene er nesten helt blottet for forurensende ventrikkel myokard. Ved hjelp av dette preparatet teknikk i kombinasjon med prøver av høyre ventrikkel, var vi ikke i stand til å oppdage ventricmeringen myokard markør ANP i Aortaklaffefeil regioner, mens denne markør ble lett detektert i ventrikkelen (figur 2). Videre er det ventrikulære myokardial markør myosinlettkjedefosfatase 2V også lett oppdages i den ventrikulære prøven, men er knapt synlig i aortaventilen regioner. Disse resultatene støtter preciseness av disseksjon.
Figur 1. Smad fosforylering i embryonale Aortaklaffefeil regioner. Prøvene ble utarbeidet med økende antall sammenslåtte embryonale mus aortaklaffen regioner, som strekker seg fra 1 til 4 ventil regioner per prøve. Hver prøve omfatter alle proteiner isolert fra hele ventil region (er) i et totalvolum på 25-28 pl. Fremlagt vev ble deretter utsatt for Western blot-analyse for fosforylert Smad1,5,8 (pSmad) (A), Total Smad1 (C), og β-aktin (A, C). Protein ble oppdaget ved hjelp av Lumigen ECL Ultra og avbildes med UVM Vision programvare. Bandet intensiteten av pSmad og β-aktin er proporsjonal til mengden av utgangsmaterialet, som kvantifisert i (B) ved hjelp av ImageJ programvare. Dataene som presenteres er gjennomsnitt og standardavvik på to separate blotter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Aortaklaffefeil regioner uttrykker ikke ventrikulære myokard markører. Prøvene ble utarbeidet med økende antall sammenslåtte embryonale mus aortaklaffen regioner, som strekker seg fra 1 til 4 ventil regioner per prøve, eller med enprøve av den høyre ventrikkel. Prøver ble behandlet som beskrevet i figur 1 og blottet for det ventrikulære myokardium markører ANP (A) og myosin lett kjede (MLC) -2v (B). ANP er fullstendig begrenset til den ventrikulære prøven, og MLC-2v er uttrykt ved svært lave nivåer sammenliknet med den ventrikulære prøven. β-aktin er vist som en lastkontroll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Evnen til å kvantifisere protein nivåer i tidlig embryo mus og chick hjerteventil regioner gir et ekstra verktøy for å forstå de kritiske cellulære signal arrangementer for ventil utvikling. Vår protokoll beskrevet her skiller seg ikke mye fra standard protein isolasjonsprosedyrer. Men ved å endre noen viktige skritt, har vi lykkes fått fosforylerte proteiner fra ekstremt små utvalgsstørrelser. For å oppnå dette utfallet, kan fremgangsmåten er av særlig betydning. For å sikre at kvaliteten protein er erholdt, er det avgjørende å holde prøvene avkjølt, enten på is eller ved hjelp av is-kald buffer, i nærvær av protease og, om nødvendig, fosfatase-inhibitorer. Videre er avgjørende for tilfredsstillende å forstyrre cellemembranene homogenisering med en enhet som er utformet for å behandle små prøvevolumer. Selv med disse forholdsregler, kan det oppnådde utbytte av protein være for lav til å detektere via Bradford-analysen med et spektrofotometereller en protein kvantifisering kit og har fortsatt prøver tilgjengelig for senere analyser. Vi var i stand til å bestemme at hvert aortaklaff region inneholder omtrent 1 mikrogram av protein ved å blande 7 Aortaklaffefeil regioner, og ved hjelp av hele prøven for kvantifisering. Til tross for denne begrensning, er tilstrekkelig til å påvise proteinet erholdt fosforylerte og ikke-fosforylerte proteiner, selv om den manglende før kvantifisering gjør en lastkontroll nødvendig. Vi spesielt utnyttet β-aktin fordi det er en høy overflod protein, som tillater oss å oppdage det selv etter stripping membran mange ganger; dens molekylvekt forskjellig fra våre proteiner av interesse; og det er ubikvitært uttrykt. En rettssak western blot med forskjellige antall samleprøver anbefales å finne ut hvor mange vev må være felles for enten embryonale hjerteventil regioner i andre stadier av utvikling eller for andre små vev av interesse. I tillegg anbefaler vi å samle minst tre temisjons prøver for hvert protein prøve for å ta hensyn til variasjoner i størrelsen av de dissekerte vev, så vel som i det tidsrom hver embryo satt på is før disseksjon. Dersom det ikke kan påvises proteinet av interesse via Western blot selv etter å samle prøver, anbefales det å redusere prøvevolumet og økning av homogenisering tid til å sikre at alle potensielle protein er tilgjengelig for påvisning. I tillegg kan proteasehemmere også bli tilsatt til iskald Tris-buffer under dissections for ustabile eller lett degradert proteiner. Hvis proteinet av interesse er uttrykt ved lave nivåer, ytterligere feilsøking i løpet av western blot del av forsøket, som for eksempel å justere det primære antistoff inkubering eller substratet påvisningsmetoden, kan hjelpe til med visualisering.
Dersom bevis (f.eks immunhistokjemi eller in situ hybridisering) tyder på at et protein av interesse er uttrykt både i hjerteklaffene og omgivending myokard, kan aorta eller lungearterien myokard bli ertet hverandre forsiktig med wolfram nåler, selv fra ventiler fra E12.5 embryoer fem. Fordi dette ekstra trinnet vil forlenge tiden av disseksjon og legge betydelig tekniske problemer, anbefaler vi å bruke det som trengs bare. I vår opprinnelige studien, begynte vi med en immunhistokjemisk analyse som viste at Smad fosforylering ble bare endret i ventilen mesenchyme; Dermed var vi sikre på at eventuelle forskjeller observert via western blot var på grunn av endringer i uttrykk i ventilen mesenchyme åtte. Videre fordi utviklings utstrømningen veisventiler sitter i krysset av de store arterier og ventriklene, utføre en kontroll blot for ventrikkel forurensning ved hjelp av en ventrikkel myokard-spesifikt antistoff som ANP eller MLC-2V anbefales.
Fordi ventilene gjennomgå dramatiske omorganisering under utvikling, kan vi tilby følgende scenen spesifikke recommendations for putene / ventiler og deres omkringliggende vev. For tidlig puter (E9.5-11.5), er både utløpskanalen og atrioventrikulær puter lett visualisert og dissekert på grunn av gjennomlysbarheten av myokard 10; Men disse embryoer er små, og dissekere nåler er anbefalt i stedet for tang og microscissors. For mid-stage differensiering (E12.5-14.5) 10, de semilunære ventiler (dvs. aorta og lungearterien ventiler) vil være lettere tilgjengelig enn de atrioventrikulærklaffer (dvs. mitral og trikuspidalklaff). Imidlertid må semilunære ventiler nøye dissekert fordi aorta og lungearterien er septating og roterer i løpet av denne tidsrammen 11,12. Nøye oppmerksomhet bør gis til rotasjon av basen av aorta og lungearterien, og midtpunktet mellom disse arteriene bør være konsistent identifiseres. Ved senere stadier av ventil modning og kondens (E15.5 og senere) 10, kan mitral og trikuspidalklaff bli ertet bort fra innsiden av ventriklene; Imidlertid bør semilunære ventiler være lettere tilgjengelig.
Western blot analyse er en langvarig teknikk for å kvantifisere protein uttrykk nivåer hos voksne hjerteklaffene 13, der biopsi størrelsen er stor. I motsetning til dette har de frie tidlig fosterdød analyser rettet mot enten ikke-kvantitativ immunhistokjemi for å påvise proteinekspresjon eller revers transkripsjon PCR, hvor den lille mengden av start isolerte mRNA kan forsterkes før analyse. Disse tiden ansatt teknikker gi noen relevant informasjon om endringer i signalering og genuttrykk, men mangler evnen til å kvantitativt vurdere protein nivåer. Med denne protokollen kan vi nå legge til kvantitative protein uttrykk data å korrelere med den kvantitative mRNA uttrykk data og immunhistokjemiske analyser.
Denne protokollen komplimenter etablerte teknikker for å isolere mRNA fra embryonale hjerteklaffene og bilde protein uttrykk. Som sådan, vil kombinere disse teknikkene tillate mer fullstendige analyser av opp-og nedregulering av signalveier, fra mRNA til post-translasjonell protein modifisering. Videre, tillater denne teknikk for kvantifisering av protein ekspresjon, noe som vil øke tiden benyttede immunhistokjemi teknikker. Sammen tror vi at denne teknikken vil være av interesse for enhver forsker interessert i hjerteklaffene eller forbereder andre særlig små vev explants for kvantitativ western blot analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Timed-pregnant mouse | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| 0.1 M Tris, pH 7.6 | |||
| Microscissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Fine forceps, #5 | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Dissecting needle holders | Ted Pella Inc. | 13560 | |
| Dissecting needles | Ted Pella Inc. | 13561-10 | |
| Micropipette, 20 μl, with tips | |||
| Lysis buffer | 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton | ||
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | Add 1 tablet to 10 ml lysis buffer |
| TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | |
| Stainless steel beads | Qiagen | 69989 | |
| Microcentrifuge |
References
- Wirrig, E. E., Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Differential expression of cartilage and bone-related proteins in pediatric and adult diseased aortic valves. J Mol Cell Cardiol. 50, 561-569 (2011).
- Chakraborty, S., et al. Twist1 promotes heart valve cell proliferation and extracellular matrix gene expression during development in vivo and is expressed in human diseased aortic valves. Dev Biol. 347, 167-179 (2010).
- Lee, M. P., Yutzey, K. E. Twist1 directly regulates genes that promote cell proliferation and migration in developing heart valves. PLoS One. 6 (e29758), (2011).
- Peacock, J. D., Huk, D. J., Ediriweera, H. N., Lincoln, J. Sox9 transcriptionally represses Spp1 to prevent matrix mineralization in maturing heart valves and chondrocytes. PLoS One. 6 (e26769), (2011).
- Chakraborty, S., Cheek, J., Sakthivel, B., Aronow, B. J., Yutzey, K. E. Shared gene expression profiles in developing heart valves and osteoblast progenitor cells. Physiol Genomics. 35, 75-85 (2008).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13, 227-232 (2012).
- Meng, X., et al. Expression of functional Toll-like receptors 2 and 4 in human aortic valve interstitial cells: potential roles in aortic valve inflammation and stenosis. Am J Physiol Cell Physiol. 294, 29-35 (2008).
- Dyer, L. A., Wu, Y., Moser, M., Patterson, C. BMPER-induced BMP signaling promotes coronary artery remodeling. Developmental Biology. 386, 385-394 (2014).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
- Garside, V. C., Chang, A. C., Karsan, A., Hoodless, P. A. Co-ordinating Notch, BMP, and TGF-beta signaling during heart valve development. Cell Mol Life Sci. 70, 2899-2917 (2013).
- Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M.
- Scherptong, R. W., et al. Morphogenesis of outflow tract rotation during cardiac development: the pulmonary push concept. Dev Dyn. 241, 1413-1422 (2012).
- Mohler, E. R., Adam 3rd, L. P., McClelland, P., Graham, L., Hathaway, D. R. Detection of osteopontin in calcified human aortic valves. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17, 547-552 (1997).
