Introduction
Essere in grado di identificare e quantificare i livelli di espressione della proteina è una tecnica standard per ragioni sanitarie e di esperimenti basati su celle. Tuttavia, nonostante una lunga interesse per lo sviluppo della valvola cardiaca embrionale precoce, valutando l'espressione della proteina in questo tessuto specifico durante lo sviluppo è attualmente limitato a immunoistochimica sia il pulcino e il mouse 1,2. Parte della difficoltà di quantificare l'espressione della proteina nelle valvole di sviluppo della maggior parte degli organismi modello (ad esempio, ceci e topo) è la piccola dimensione delle valvole, che limita la quantità di proteine che si possono ottenere. Così, per analisi quantitative, i ricercatori in genere si basano su l'estrazione dell'RNA e l'amplificazione per la successiva PCR quantitativa o analisi microarray 2-5. Tuttavia, i livelli di espressione di RNA e proteine non sono del tutto correlativo 6, in modo da concentrarsi su espressione di RNA non è in grado di fornire una rigorosa conto dei numerosi cambiamenti che si verificano in una determinata segnalazionepercorso in diversi momenti durante l'evoluzione. Sulla base di questo limite nella metodologia attualmente disponibili, l'obiettivo di questa procedura è stato quello di sviluppare un protocollo per ottenere in modo affidabile una quantità sufficiente di proteine dalle embrionali di topo in via di sviluppo le regioni valvola cardiaca per l'analisi quantitativa dei cambiamenti che si verificano in diverse vie di segnalazione che sono importanti in la maturazione di questo tessuto.
Le valvole embrionali sono già comunemente dissezionati da topi per l'isolamento di RNA e la successiva analisi di espressione genica 2-5. Tuttavia, questi studi si sono limitati a usare l'espressione genica come out lettura di segnalare l'attivazione della via, che non consente il rilevamento di rilevare modificazioni post-traduzionali di proteine che possono influenzare la segnalazione a valle. Utilizzando le tecniche di isolamento dell'RNA come punto di partenza, abbiamo iniziato con dissezione delle regioni di interesse. Perché il nostro interesse è stato rilevando proteine fosforilate che erano indicativi di pat segnalazioneattività HWAY durante un periodo specifico di sviluppo della valvola aortica (E13.5-14.5), abbiamo effettuato tutte le dissezioni in tampone Tris senza fosfati e raccolto le valvole in un tampone di lisi a base di Tris con inibitori della proteasi e fosfatasi. Nel nostro caso specifico, solo le regioni valvola aortica sono stati raccolti, ma la regione valvola polmonare possono essere facilmente ottenuti allo stesso tempo. Le regioni valvole erano poi omogeneizzato e combinato con un tampone che viene attualmente utilizzato per studiare l'espressione della proteina in valvole cardiache adulte 7. Utilizzando piccoli volumi di campione (ad esempio, 2 microlitri) e la messa in comune delle regioni valvole da embrioni con lo stesso genotipo, siamo stati in grado di rilevare le proteine fosforilate e nonphosphorylated al giorno embrionale 13.5 8. Poiché le regioni di valvole possono essere congelati e conservati in tampone di lisi, gli embrioni possono essere genotipizzati se necessario prima di pooling.
Questa tecnica amplia il set di strumenti che sono disponibili per la valutazione signalin cellulareg percorsi durante lo sviluppo e fornisce un complimento quantitativo di immunoistochimica, specificatamente per le valvole cardiache in via di sviluppo. Questa tecnica dovrebbe essere di beneficio non solo ai cardiologi di sviluppo, ma anche a tutti i biologi dello sviluppo che lavorano con gli embrioni in fase iniziale sono interessati nelle regioni che contengono tessuti limitata.
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Protocol
NOTA: Tutti gli esperimenti sono stati approvati dalla cura e uso degli animali Comitato Istituzionale presso l'Università del North Carolina a Chapel Hill.
1 Excise della valvola aortica
- Utilizzando una tecnica di eutanasia approvato per la fase embrionale di interesse, eutanasia di un mouse incinta con cuccioli al giorno embrionale desiderata (E) dello sviluppo.
- Utilizzare etanolo al 70% per sterilizzare l'addome della femmina incinta. Sollevare la pelle ei muscoli del basso addome alto e lontano dagli organi interni, e sezionare cavità inferiore addominale open femminile per consentire l'accesso al corno uterino.
- Per recuperare il corno uterino, tenere il collo dell'utero con una pinza e caudale con attenzione tagliare le pinze. Sollevare il corno uterino, tagliando qualsiasi tessuto connettivo che tiene il corno in luogo, e completare la rimozione tagliando la giunzione del corno uterino con l'ovidotto.
- Posizionare il corno uterino sezionato in una capsula di Petri contenente cold 0.1 M tampone Tris (pH 7.6) e sciacquare come necessario. Quindi, tagliare il corno uterino longitudinalmente per esporre i sacchi embrionali aperto.
- Per esporre l'embrione, tagliare aprire un sacco embrionale allo svincolo della placenta e l'embrione e tagliare i vasi ombelicali per liberare l'embrione. Posizionare l'embrione sezionato in un secondo piatto di Petri con freddo 0.1 M tampone Tris. Ritorna il primo piatto di Petri con i rimanenti embrioni undissected per ghiaccio fino pronto per la prossima embrione.
- Per migliorare l'accesso della parete toracica all'interno dell'embrione, decapitare il embrione. Se genotipizzazione è necessario, rimuovere e salvare un pezzo di tessuto in più in una provetta Eppendorf posti su ghiaccio.
- Inserire l'embrione sul dorso, e tagliare la parete toracica verticalmente lungo il lato della gabbia toracica, vicino a una zampa anteriore, e orizzontalmente sopra il diaframma di visualizzare il cuore. Quindi, aprire la parete toracica per esporre il cuore.
- Utilizzando pinze per tenere alto lungo i grossi vasi, sollevare il cuore con pinze e tagliare i vasi di seguito. Iln, tagliare sopra la pinza per liberare il cuore. Se i vasi polmonari rimangono non tagliata, i polmoni possono essere rimossi con il cuore e devono essere rimosse prima di continuare.
- Tagliare e rimuovere l'arteria polmonare di sopra del livello della valvola; nelle fasi embrionali qui descritte, l'arteria polmonare è leggermente opaca, che aiuta nella sua discriminazione dalla regione valvola. Tagliare appena sotto la valvola polmonare, evitando il miocardio ventricolare trabeculated e raccogliere come descritto al punto 1.10, se questa regione è anche di interesse. Qui e nella fase successiva, utilizzare un'azione capillare per disegnare tampone Tris eccesso di distanza dalla regione di interesse prima di raccogliere in tampone di lisi.
- Rimuovere accuratamente il distale dell'aorta alla valvola aortica, appena sopra il livello della valvola; come l'arteria polmonare, l'aorta rimane leggermente opaca in queste fasi embrionali, aiutando nella sua rimozione. Tagliare appena sotto la valvola aortica, ancora una volta evitando il miocardio ventricolare trabeculated, e trasferire ilvalvola con pinze ad una provetta Eppendorf con tampone di lisi 2 microlitri (descritto nella tabella materiali) contenente inibitori di proteasi e fosfatasi sul ghiaccio.
- Ripetere i passaggi 1,6-1,10 finché le valvole sono stati rimossi da tutti gli embrioni, raccogliendo ogni valvola in un tubo Eppendorf separata. Se tutti gli embrioni hanno lo stesso genotipo, tutte le valvole possono essere raccolte in un unico tubo Eppendorf.
- Se genotipizzazione deve essere eseguito per determinare quali valvole di riunire insieme, immediatamente mettere i campioni in tampone di lisi a -80 ° C fino a nuovo uso. I campioni possono quindi essere raggruppati dopo genotipizzazione (punto 2.1.1).
Estrazione 2 Proteine
- Scongelare tessuti raccolti su ghiaccio e centrifugare a 13.100 xg per 1 min per raccogliere i tessuti in un tampone di lisi sul fondo della provetta.
- Se sono stati genotipizzati embrioni, utilizzare una pipetta per raccogliere delicatamente e piscina di buffer di lisi contenente le regioni valvole da embrioni con genotipi simili. Per garantire un forte be, riunendo 3-4 regioni valvole da embrioni E13.5 per si raccomanda campione.
- Se tutti gli embrioni erano dello stesso genotipo e tutte le regioni valvole sono stati raccolti insieme nel passo 1.10, lisare l'intero campione, come descritto al punto 2.2.
- Controllare il volume del campione composito risultante e aggiungere tampone di lisi per un volume totale di 40 microlitri; poi, interrompere e omogeneizzare campioni utilizzando perline in acciaio inox 5 mm provette Eppendorf. Azionare il Lyser per 2-4 min a 50 Hz, come da istruzioni del produttore. Tubi Spin brevemente, (~ 13.100 xg per 1 minuto), e il trasferimento dei campioni ai nuovi tubi, lasciando dietro di sé i detriti insolubile.
- Preparare e campioni separati per SDS-PAGE e trasferimento per la successiva analisi Western Blot, a seguito di un protocollo come Eslami et al 9. Blotting per una proteina di controllo di carico è essenziale per la quantificazione delle proteine.
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Representative Results
Utilizzando questa tecnica di preparazione, siamo stati in grado di rilevare fosforilata Smad 1,5,8 (pSmad) nelle singole regioni della valvola aortica da E13.5 embrioni. Come mostrato nella Figura 1A, la proteina isolata da anche una sola regione valvola è sufficiente per rilevare una banda pSmad debole. Intensità del segnale aumenta in proporzione al numero di regioni valvole che vengono pool. È importante sottolineare che il / rapporto β-actina pSmad rimane pressoché costante tra le diverse dimensioni del campione (Figura 1C). A causa dei bassi livelli di proteine disponibili, la stessa macchia non può essere messo a nudo e reprobed per totale Smad. Tuttavia, una macchia separata che mostra totale Smad 1 e β-actina mostra lo stesso pattern di espressione (Figura 1B).
Queste regioni valvole sono quasi del tutto privo di contaminanti miocardio ventricolare. Utilizzando questa tecnica di preparazione in combinazione con campioni del ventricolo destro, siamo stati in grado di rilevare ventriclare ANP marcatore miocardio nelle regioni della valvola aortica, che tale marcatore è stato prontamente rilevato nel ventricolo (Figura 2). Inoltre, il miocardio ventricolare marcatore miosina catena leggera 2V è anche facilmente rilevata nel campione ventricolare ma è appena rilevabile nelle regioni della valvola aortica. Questi risultati supportano la precisione della dissezione.
Figura 1 Smad fosforilazione nelle regioni valvola aortica embrionali. Campioni sono stati preparati con un numero crescente di topo embrionale regioni della valvola aortica pool, da 1 a 4 regioni valvole per campione. Ciascun campione comprende tutte le proteine isolate da tutta la regione valvola (s) in un volume totale di 25-28 microlitri. Tessuti preparati sono stati poi sottoposti ad analisi western blot per fosforilata Smad1,5,8 (pSmad) (A), Totale Smad1 (C), e β-actina (A, C). Protein è stato rilevato usando Lumigen ECL Ultra e ripreso con il software UVM VisionWorks. L'intensità della banda di pSmad e β-actina è proporzionale alla quantità di materiale di partenza, come quantificato in (B) utilizzando il software ImageJ. I dati presentati sono la media e la deviazione standard delle due macchine distinte. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. regioni valvola aortica non esprimono marcatori miocardio ventricolare. Campioni sono stati preparati con un numero crescente di topo embrionale regioni della valvola aortica pool, da 1 a 4 regioni valvole per campione, o con uncampione del ventricolo destro. I campioni sono stati trattati come descritto in Figura 1 e cancellato per il miocardio ventricolare marcatori ANP (A) e la catena leggera della miosina (MLC) -2V (B). ANP è completamente limitato al campione ventricolare, e MLC-2V è espresso a livelli estremamente bassi in confronto con il campione ventricolare. β-actina è mostrato come un controllo di carico.
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Discussion
La capacità di quantificare i livelli di proteine nei primi mesi del topo embrionale e pulcino regioni della valvola cardiaca fornisce un ulteriore strumento per la comprensione degli eventi di segnalazione cellulari critici per lo sviluppo della valvola. Il nostro protocollo qui descritto non differisce molto da procedure di isolamento delle proteine standard. Tuttavia, modificando alcuni passaggi chiave, abbiamo ottenuto con successo proteine fosforilate da estremamente campioni di piccole dimensioni. Per ottenere questo risultato, i seguenti passaggi sono di particolare importanza. Per garantire che proteine di qualità è ottenuta, è essenziale mantenere i campioni refrigerati, sia su ghiaccio o utilizzando tamponi ghiacciate, in presenza di proteasi e, se necessario, inibitori di fosfatasi. Inoltre, omogeneizzazione con un dispositivo che è stato progettato per elaborare piccoli volumi di campione è essenziale per interrompere in maniera adeguata le membrane cellulari. Anche con queste precauzioni, il rendimento ottenuto di proteine potrebbe essere troppo bassa per rilevare tramite il saggio Bradford con uno spettrofotometroo un kit proteina quantificazione e hanno ancora campione disponibile per le analisi successive. Siamo stati in grado di stabilire che ogni regione della valvola aortica contiene circa 1 mg di proteina raggruppando 7 regioni della valvola aortica e con l'intero campione per la quantificazione. Nonostante questa limitazione, sufficienti proteine si ottiene per rilevare proteine fosforilate e non fosforilate, anche se la mancanza di previa quantificazione effettua un controllo di carico essenziale. Abbiamo appositamente utilizzammo β-actina, perché è una proteina di alta abbondanza, che ci ha permesso di rilevare anche dopo stripping di numerose volte di membrana; il suo peso molecolare diverso dai nostri proteine di interesse; ed è ubiquitariamente espresso. Un western blot prova con un diverso numero di campioni aggregati viene raccomandato per determinare quanti tessuti devono essere aggregate per entrambi le regioni valvole cardiache embrionali in altre fasi di sviluppo o per altri piccoli tessuti di interesse. Inoltre, si consiglia di mettere in comune almeno tre tcampioni di emissione per ciascun campione di proteina rappresentano variabilità nelle dimensioni dei tessuti sezionati e nella lunghezza del tempo ogni embrione seduto sul ghiaccio prima della dissezione. Se la proteina di interesse non può essere rilevato tramite western blot anche dopo la messa in comune dei campioni, si consiglia di ridurre il volume del campione e aumentando il tempo di omogeneizzazione al fine di garantire che tutte le proteine potenziale è disponibile per il rilevamento. Inoltre, gli inibitori della proteasi possono anche essere aggiunti al tampone Tris ghiacciato durante le dissezioni per le proteine instabili o facilmente degradati. Se la proteina di interesse è espressa a livelli bassi, sulla risoluzione dei problemi durante la parte western blot di questo esperimento, come la regolazione del incubazione dell'anticorpo primario o il metodo di rilevamento del substrato, può aiutare con visualizzazione.
Se la prova (ad esempio, immunoistochimica o ibridazione in situ) suggerisce che una proteina di interesse è espressa sia nelle valvole cardiache e la surrounding miocardio, l'arteria miocardio aortica o polmonare può essere preso in giro a parte delicatamente con aghi di tungsteno, anche da valvole da E12.5 embrioni 5. Perché questo ulteriore passo si allunga il tempo di dissezione e di aggiungere notevole difficoltà tecnica, si consiglia l'impiego come necessaria solo. Nel nostro studio originale, abbiamo iniziato con una analisi immunoistochimica che ha mostrato che Smad fosforilazione è stato modificato solo nel mesenchima valvola; così, eravamo fiduciosi che le eventuali differenze osservate tramite western blot erano dovuti a cambiamenti nell'espressione del mesenchima valvola 8. Inoltre, poiché le valvole di sviluppo del tratto di efflusso siedono all'incrocio delle grandi arterie e ventricoli, l'esecuzione di una macchia di controllo per la contaminazione ventricolare utilizzando un anticorpo specifico del miocardio ventricolare, come ANP o MLC-2V è raccomandato.
Poiché le valvole subiscono drammatica riorganizzazione durante il loro sviluppo, offriamo i seguenti specifiche fasi RACCOMANDAZIONI per i cuscini / valvole e il loro tessuto circostante. Per i primi cuscini (E9.5-11.5), sia il tratto di efflusso e cuscini atrioventricolare sono facilmente visualizzati e sezionato a causa della traslucenza del miocardio 10; tuttavia, questi embrioni sono piccoli, e gli aghi di dissezione sono raccomandati invece di forcipe e microscissors. Per la differenziazione mid-stage (E12.5-14.5) 10, le valvole semilunari (vale a dire, il aortica e valvole dell'arteria polmonare) saranno più facilmente accessibili rispetto alle valvole atrioventricolari (ad esempio, le valvole mitrale e tricuspide). Tuttavia, le valvole semilunari devono essere accuratamente sezionati, perché l'aorta e l'arteria polmonare sono septating e rotazione durante questo lasso di tempo 11,12. Particolare attenzione deve essere data alla rotazione della base della aorta e l'arteria polmonare, e il punto medio tra queste arterie dovrebbe essere costantemente identificata. Alle successive fasi di maturazione valvola e la formazione di condensa (E15.5 e successive) 10, le valvole mitrale e tricuspide può essere preso in giro da dentro i ventricoli; Tuttavia, le valvole semilunari dovrebbero essere più facilmente accessibili.
Analisi Western blot è una tecnica di lunga data per quantificare i livelli di espressione della proteina in valvole cardiache adulte 13, in cui la dimensione biopsia è di grandi dimensioni. Al contrario, le prime analisi embrionali gratuiti sono concentrati su entrambi immunoistochimica non quantitativa per rilevare l'espressione della proteina o trascrizione inversa PCR, dove la piccola quantità iniziale di mRNA isolato può essere amplificata prima dell'analisi. Queste tecniche attualmente impiegate forniscono alcune informazioni riguardanti cambiamenti nell'espressione genica e di segnalazione, ma non hanno la capacità di valutare quantitativamente i livelli di proteina. Con questo protocollo, possiamo ora aggiungere dati quantitativi di espressione proteica correlati con i dati di espressione di mRNA quantitativi e analisi immunoistochimica.
Questo protocollo complimenti tecniche stabilite per isolare mRNA dalle valvole cardiache embrionali e l'espressione della proteina di imaging. Come tale, la combinazione di queste tecniche consentirà analisi più complete del up-e down-regolazione di vie di segnalazione, da mRNA post-traslazionale modificazioni delle proteine. Inoltre, questa tecnica consente per la quantificazione dell'espressione della proteina, che migliorerà le tecniche di immunoistochimica attualmente utilizzate. Insieme, noi crediamo che questa tecnica sarà di interesse per ogni ricercatore interessato alle valvole cardiache o la preparazione di altri particolarmente piccoli espianti di tessuto per l'analisi western blot quantitativa.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Timed-pregnant mouse | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| 0.1 M Tris, pH 7.6 | |||
| Microscissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Fine forceps, #5 | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Dissecting needle holders | Ted Pella Inc. | 13560 | |
| Dissecting needles | Ted Pella Inc. | 13561-10 | |
| Micropipette, 20 μl, with tips | |||
| Lysis buffer | 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton | ||
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | Add 1 tablet to 10 ml lysis buffer |
| TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | |
| Stainless steel beads | Qiagen | 69989 | |
| Microcentrifuge |
References
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