Introduction
Ser capaz de identificar y cuantificar los niveles de expresión de proteínas es una técnica estándar para animal- y los experimentos basados en células. Sin embargo, a pesar de un interés de larga data en el desarrollo de la válvula cardíaca embrionaria temprana, la evaluación de la expresión de proteínas en este tejido específico durante el desarrollo se limita actualmente a la inmunohistoquímica en tanto el pollo y 1,2 ratón. Parte de la dificultad de cuantificar la expresión de proteínas en las válvulas de desarrollo de la mayoría de organismos modelo (por ejemplo, de pollo y de ratón) es el pequeño tamaño de las válvulas, lo que limita la cantidad de proteína que se puede obtener. Por lo tanto, para los análisis cuantitativos, los investigadores normalmente se basan en la extracción de ARN y amplificación por PCR cuantitativa posterior o el análisis de microarrays 2-5. Sin embargo, los niveles de expresión de ARN y proteínas no son del todo correlativa 6, por lo que se centra en la expresión del ARN no pueden dar una explicación rigurosa de los numerosos cambios que se producen en cualquier señalización dadavía en varias ocasiones durante la evolución. Sobre la base de este límite en la metodología actualmente disponible, el objetivo de este procedimiento fue desarrollar un protocolo para la obtención fiable de cantidades suficientes de proteína a partir de las regiones de la válvula cardiaca de embriones de ratón en desarrollo para el análisis cuantitativo de los cambios que se producen en diversas vías de señalización que son importantes en la maduración de este tejido.
Válvulas embrionarias son ya comúnmente disecados de los ratones para el aislamiento de ARN y análisis de expresión génica posterior 2-5. Sin embargo, estos estudios se han limitado a la utilización de la expresión génica como una lectura de salida de activación de la vía de señalización, que no permite la detección de detectar proteínas modificaciones post-traduccionales que pueden afectar a la señalización aguas abajo. Utilizando las técnicas de aislamiento de ARN como punto de partida, comenzamos con la disección de las regiones de interés. Debido a que nuestro interés se detecta proteínas fosforiladas que eran indicativos de pat señalizaciónhway actividad durante un período específico de desarrollo de la válvula aórtica (E13.5-14.5), que realiza todas las disecciones en tampón Tris-fosfato libre y se recogió las válvulas en un tampón de lisis a base de Tris con inhibidores de fosfatasa y proteasa. En nuestro caso específico, sólo se recogieron las regiones de la válvula aórtica, pero la región de la válvula pulmonar podrían obtenerse fácilmente al mismo tiempo. Las regiones de la válvula fueron entonces homogeneizada y combinado con un tampón de muestra que se utiliza actualmente para estudiar la expresión de proteínas en las válvulas cardiacas adultas 7. Mediante el uso de pequeños volúmenes de muestra (por ejemplo, 2 l) y puesta en común de las regiones de la válvula a partir de embriones con el mismo genotipo, hemos sido capaces de detectar las proteínas fosforiladas y no fosforilada en el día embrionario 13.5 8. Debido a que las regiones de válvula pueden ser congelados y almacenados en tampón de lisis, los embriones pueden ser genotipados si es necesario antes de la puesta en común.
Esta técnica amplía el conjunto de herramientas que están disponibles para evaluar signalin celularg vías durante el desarrollo y ofrece un cumplido cuantitativa de inmunohistoquímica, específicamente para las válvulas cardíacas en desarrollo. Esta técnica debe ser de beneficio no sólo para los cardiólogos de desarrollo, sino también a todos los biólogos del desarrollo que trabajan con embriones en fase inicial están interesados en regiones que contienen tejido limitado.
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Protocol
NOTA: Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill.
1. Impuestos Especiales de la válvula aórtica
- Usando una técnica de eutanasia aprobadas para la etapa embrionaria de interés, la eutanasia a un ratón embarazada con cachorros en el día embrionario deseado (E) del desarrollo.
- Utilice 70% de etanol para esterilizar el abdomen de la hembra embarazada. Levante la piel y los músculos de la parte inferior del abdomen hacia arriba y lejos de los órganos internos, y disecar la cavidad abdominal inferior Open femenino para permitir el acceso a la trompa uterina.
- Para recuperar el cuerno uterino, mantenga el cuello del útero con una pinza y caudal cuidadosamente cortado al fórceps. Levante el cuerno uterino, cortar cualquier tejido conectivo que mantiene la bocina en su lugar, y completar la eliminación mediante la reducción de la unión de la trompa uterina con el oviducto.
- Coloque el cuerno uterino diseccionado en una placa de Petri que contiene cold 0,1 M de tampón Tris (pH 7,6) y enjuague según sea necesario. A continuación, cortar el cuerno uterino en sentido longitudinal para exponer los sacos embrionarios abierta.
- Para exponer el embrión, cortar y abrir un saco embrionario en la unión de la placenta y el embrión y cortar los vasos umbilicales para liberar el embrión. Coloque el embrión diseccionado en un segundo plato de Petri con frío tampón Tris 0,1 M. Devuelva la primera placa de Petri con los restantes embriones no seccionada a hielo hasta que esté listo para el próximo embrión.
- Para mejorar el acceso de la pared torácica en el embrión, decapitar al embrión. Si genotipado es necesario, retire y guarde un pedazo de tejido extra en un tubo Eppendorf se colocó en hielo.
- Coloque el embrión en su parte posterior, y cortar la pared torácica verticalmente a lo largo del lado de la caja torácica, cerca de una extremidad anterior, y horizontalmente por encima del diafragma para visualizar el corazón. Luego, abrir la pared torácica para exponer el corazón.
- Con unas pinzas para mantener en alto a lo largo de los grandes vasos, levantar el corazón con unas pinzas y cortar los vasos debajo. Eln, corte por encima de la pinza para liberar el corazón. Si los vasos pulmonares permanecen sin cortar, los pulmones se pueden eliminar con el corazón y deben ser removidos antes de continuar.
- Corte y retire la arteria pulmonar por encima del nivel de la válvula; en las etapas embrionarias descritos en este documento, la arteria pulmonar es ligeramente opaca, que ayuda en su discriminación de la región de la válvula. Corte justo debajo de la válvula pulmonar, evitando el miocardio ventricular trabeculado y recoger como se describe en el paso 1.10 si esta región es también de interés. Aquí y en la siguiente etapa, usar la acción capilar para extraer el exceso de tampón Tris lejos de la región de interés antes de la recogida en tampón de lisis.
- Retire cuidadosamente la aorta distal a la válvula aórtica, justo por encima del nivel de la válvula; como la arteria pulmonar, la aorta se mantiene ligeramente opaca en estas etapas embrionarias, ayudar en su eliminación. Corte justo debajo de la válvula aórtica, evitando de nuevo el miocardio ventricular trabeculado, y transferir elválvula usando fórceps a un tubo Eppendorf con tampón de lisis 2 l (descrito en la Tabla de Materiales) que contiene inhibidores de la proteasa y fosfatasa en hielo.
- Repetir los pasos 1.6 a 1.10 hasta que las válvulas han sido extirpados de todos los embriones, la recogida de cada válvula en un tubo Eppendorf separado. Si todos los embriones tienen el mismo genotipo, todas las válvulas pueden ser recogidos en un solo tubo Eppendorf.
- Si el genotipado se va a realizar para determinar qué válvulas para agrupar juntos, colocar inmediatamente las muestras en tampón de lisis a -80 ° C hasta su uso posterior. Las muestras pueden luego ser agrupados después de genotipado (etapa 2.1.1).
Extracción 2. Proteína
- Descongele tejidos recogidos en el hielo y se centrifuga a 13.100 xg durante 1 min para recoger los tejidos en tampón de lisis en la parte inferior del tubo.
- Si se genotipo embriones, utilizar una pipeta para recoger suavemente y tampón piscina lisis que contiene las regiones de la válvula a partir de embriones con genotipos similares. Para asegurar una fuerte by, la puesta en común 3-4 regiones de la válvula a partir de embriones E13.5 se recomienda por muestra.
- Si todos los embriones eran de la misma genotipo y todas las regiones de la válvula se recogieron juntos en el paso 1.10, lisar toda la muestra, como se describe en el Paso 2.2.
- Compruebe el volumen de la muestra agrupada resultante y añadir tampón de lisis hasta un volumen total de 40 l; entonces, desarticular y homogeneizar muestras usando 5 mm bolas de acero inoxidable en tubos Eppendorf. Operar el Lyser durante 2-4 min a 50 Hz, según las instrucciones del fabricante. Centrifugar los tubos brevemente, (~ 13.100 xg durante 1 min), y transferencia de muestras a tubos nuevos, dejando atrás los restos insolubles.
- Preparar y muestras separadas para SDS-PAGE y transferencia de Western blot posterior, siguiendo un protocolo como Eslami et al 9. Secante para una proteína de control de carga es esencial para la cuantificación de proteínas.
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Representative Results
Utilizando esta técnica de preparación, hemos sido capaces de detectar fosforilados Smad 1,5,8 (pSmad) en las regiones de la válvula aórtica individuales de E13.5 embriones. Como se muestra en la Figura 1A, la proteína aislada de incluso una sola región de la válvula es suficiente para detectar una banda pSmad débil. Intensidad de la señal aumenta proporcionalmente con el número de regiones de la válvula que se agruparon. Es importante destacar que la relación pSmad / β-actina se mantiene casi constante a través de los diferentes tamaños de las muestras (Figura 1C). Debido a los bajos niveles de proteína disponible, la misma transferencia no puede ser desnudado y se volvió a sondear para el total de Smad. Sin embargo, una mancha separada que muestra total de Smad 1 y β-actina muestra el mismo patrón de expresión (Figura 1B).
Estas regiones de la válvula son casi enteramente desprovista de contaminación de miocardio ventricular. Utilizando esta técnica de preparación en combinación con muestras del ventrículo derecho, no hemos podido detectar Ventricular ANP marcador de miocardio en las regiones de la válvula aórtica, mientras que este marcador se detecta fácilmente en el ventrículo (Figura 2). Además, el infarto de miosina ventricular marcador de cadena ligera 2V también se detecta fácilmente en la muestra ventricular pero es apenas detectable en las regiones de la válvula aórtica. Estos resultados apoyan la precisión de la disección.
Figura 1. Smad fosforilación en las regiones de la válvula aórtica embrionarias. Las muestras se prepararon con un número creciente de regiones de la válvula aórtica de ratón embrionario agrupados, que van de 1 a 4 regiones de válvulas por muestra. Cada muestra incluye todas las proteínas aisladas de la región entera de la válvula (s) en un volumen total de 25-28 l. Tejidos preparadas se sometieron a continuación a análisis de transferencia Western para Smad1,5,8 fosforilada (pSmad) (A), Smad1 total de (C), y β-actina (A, C). La proteína se detectó utilizando Lumigen ECL Ultra y fotografiado con software UVM VisionWorks. La intensidad de la banda de pSmad y β-actina es proporcional a la cantidad de material de partida, según se cuantifique en (B) usando el software ImageJ. Los datos presentados son la media y la desviación estándar de dos manchas separadas. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. regiones válvula aórtica no expresan marcadores miocardio ventricular. Muestras se prepararon con un número creciente de regiones de la válvula aórtica del ratón embrionario combinados, que van de 1 a 4 regiones de válvulas por muestra, o con unmuestra del ventrículo derecho. Las muestras se procesaron como se describe en la Figura 1 y se transfirieron para el miocardio ventricular marcadores ANP (A) y la cadena ligera de la miosina (MLC) -2V (B). ANP está totalmente restringido a la muestra ventricular, y MLC-2v se expresa en niveles muy bajos en comparación con la muestra ventricular. β-actina se muestra como control de carga.
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Discussion
La capacidad de cuantificar los niveles de proteína a principios de embriones de ratón y Chick regiones válvula cardíaca proporciona una herramienta adicional para la comprensión de los eventos de señalización celular críticas para el desarrollo de la válvula. Nuestro protocolo descrito en este documento no difiere en gran medida de los procedimientos de aislamiento de proteínas convencionales. Sin embargo, mediante la modificación de algunas medidas clave, que hemos obtenido con éxito proteínas fosforiladas desde muy pequeños tamaños de muestra. Para lograr este resultado, los siguientes pasos son de particular importancia. Para asegurar que se obtiene la proteína de calidad, es crucial para mantener las muestras refrigeradas, ya sea en hielo o mediante el uso de tampones en frío de hielo, en presencia de la proteasa y, si es necesario, inhibidores de la fosfatasa. Además, la homogeneización con un dispositivo que está diseñado para procesar pequeños volúmenes de muestra es esencial para interrumpir adecuadamente las membranas celulares. Incluso con estas precauciones, el rendimiento obtenido de la proteína puede ser demasiado baja para detectar a través de el ensayo de Bradford con un espectrofotómetroo un kit de cuantificación de proteínas y todavía tiene muestra disponible para el análisis posteriores. Hemos sido capaces de determinar que cada región de la válvula aórtica contiene aproximadamente 1 g de proteína mediante la agrupación de 7 regiones de la válvula aórtica y el uso de toda la muestra para la cuantificación. A pesar de esta limitación, se obtiene suficiente proteína para detectar proteínas fosforiladas y no fosforiladas, aunque la falta de cuantificación anterior hace un control de carga esencial. Específicamente utilizó β-actina, ya que es una proteína de alta abundancia, que nos permitió detectar incluso después de quitar la membrana en numerosas ocasiones; su peso molecular difiere de nuestras proteínas de interés; y se expresa de forma ubicua. Se recomienda un ensayo de western blot con diferentes números de muestras combinadas para determinar cuántos tejidos deben ser agrupados para cualquiera de las regiones de las válvulas cardiacas embrionarias en otras etapas de desarrollo o para otros pequeños tejidos de interés. Además, se recomienda la puesta en común al menos tres tmuestras de emisión para cada muestra de proteína para explicar la variabilidad en el tamaño de los tejidos disecados, así como en la longitud de tiempo que cada embrión se sentó en hielo antes de la disección. Si la proteína de interés no se puede detectar a través de western blot, incluso después de la puesta en común de muestras, se recomienda la reducción de volumen de la muestra y el aumento del tiempo de homogeneización para asegurar que toda la proteína potencial está disponible para la detección. Además, inhibidores de la proteasa también pueden ser añadidos a tampón Tris enfriado con hielo durante disecciones para las proteínas inestables o fácilmente degradados. Si la proteína de interés se expresa en niveles bajos, la solución de problemas durante la fase de transferencia de Western de la experiencia, como el ajuste de la incubación del anticuerpo primario o el método de detección de sustrato, puede ayudar con la visualización.
Si la evidencia (por ejemplo, inmunohistoquímica o hibridación in situ) sugiere que una proteína de interés se expresa tanto en las válvulas cardiacas y la surrouNding miocardio, el miocardio arteria aórtica o pulmonar se puede, se separan suavemente con agujas de tungsteno, incluso desde las válvulas de E12.5 embriones 5. Debido a que este paso adicional alargará el tiempo de disección y añadir dificultad técnica significativa, sugerimos emplear según sea necesario solamente. En nuestro estudio original, comenzamos con un análisis inmunohistoquímico que mostró que Smad fosforilación sólo se cambió en el mesénquima de la válvula; por lo tanto, estábamos seguros de que las diferencias observadas a través de western blot se debieron a cambios en la expresión en el mesénquima 8 válvulas. Además, debido a que las válvulas del tracto de salida en desarrollo se sientan en la unión de las grandes arterias y los ventrículos, realizando una transferencia de control para la contaminación ventricular utilizando un anticuerpo específico-miocardio ventricular tales como ANP o MLC-2V se recomienda.
Debido a que las válvulas se someten a una reorganización drástica durante su desarrollo, ofrecemos la siguiente etapa específica de ras recomendaciones para los cojines / válvulas y su tejido circundante. Para los primeros cojines (E9.5-11.5), tanto en el tracto de salida y cojines auriculoventriculares son fácilmente visualizados y disecados debido a la translucidez del miocardio 10; sin embargo, estos embriones son pequeñas, y agujas de disección se recomiendan en lugar de fórceps y micro tijeras. Para la diferenciación en estadio intermedio (E12.5-14.5) 10, las válvulas semilunares (es decir, la aorta y la arteria pulmonar válvulas) serán más fácilmente accesibles que las válvulas auriculoventriculares (es decir, las válvulas mitral y tricúspide). Sin embargo, las válvulas semilunares deben ser disecados cuidadosamente porque la aorta y la arteria pulmonar están septating y girando durante este marco de tiempo 11,12. La atención cuidadosa se debe dar a la rotación de la base de la aorta y la arteria pulmonar, y el punto medio entre estas arterias se debe identificar de forma coherente. En etapas posteriores de la maduración de la válvula y la condensación (E15.5 y posteriores) 10, las válvulas mitral y tricúspide se burló de distancia desde el interior de los ventrículos; sin embargo, las válvulas semilunares deberían ser más fácilmente accesible.
Western blot es una técnica de larga data para la cuantificación de los niveles de expresión de proteínas en las válvulas cardíacas adultas 13, donde el tamaño de la biopsia es grande. En contraste, los análisis embrionarias tempranas gratuitos o bien se han centrado en la inmunohistoquímica no cuantitativa para detectar la expresión de proteína o la transcripción inversa PCR, donde la cantidad de partida pequeña de ARNm aislado se puede amplificar antes del análisis. Estas técnicas empleadas actualmente proporcionan alguna información pertinente con respecto a cambios en la expresión génica y señalización, pero carecen de la capacidad de evaluar cuantitativamente los niveles de proteína. Con este protocolo, ahora podemos añadir los datos de expresión de proteínas cuantitativos para correlacionar con los datos de expresión de mRNA cuantitativa y análisis de inmunohistoquímica.
Este protocolo cumplidos establecen técnicas para aislar ARNm de las válvulas cardiacas embrionarias y expresión de la proteína de imágenes. Como tal, la combinación de estas técnicas permitirá para los análisis más completos de la arriba y abajo de regulación de las vías de señalización, a partir de ARNm de modificación post-traduccional de proteínas. Además, esta técnica permite la cuantificación de la expresión de la proteína, lo que aumentará técnicas de inmunohistoquímica actualmente utilizados. Juntos, creemos que esta técnica será de interés para cualquier investigador interesado en las válvulas cardíacas o preparar otros explantes de tejido en particular las pequeñas para el análisis de western blot cuantitativo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Timed-pregnant mouse | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| 0.1 M Tris, pH 7.6 | |||
| Microscissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Fine forceps, #5 | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Dissecting needle holders | Ted Pella Inc. | 13560 | |
| Dissecting needles | Ted Pella Inc. | 13561-10 | |
| Micropipette, 20 μl, with tips | |||
| Lysis buffer | 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton | ||
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | Add 1 tablet to 10 ml lysis buffer |
| TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | |
| Stainless steel beads | Qiagen | 69989 | |
| Microcentrifuge |
References
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