Introduction
细菌肉毒梭菌产生的肉毒杆菌神经毒素，对人类已知1是最有效的生物毒素之一。有7个不同的血清型肉毒毒素（肉毒毒素/ AG）。肉毒毒素/ A-胆引起麻痹的神经肌肉接头处由于SNARE复合体蛋白水解2,3。 SNARE蛋白水解阻止神经递质囊泡膜融合，从而阻止神经递质胞吐4。具体的SNARE目标取决于所涉及的中毒过程中的特殊肉毒毒素血清型。肉毒毒素/ A和肉毒毒素/ E切割SNAP-25，而肉毒毒素/ C切割两种SNAP-25和突触5。剩下的血清型切割突触（也称为囊泡相关膜蛋白（VAMP）。肉毒毒素/ A被选为试验发展，因为它是负责自然发生的肉毒杆菌中毒的比例很高，并具有行动6。发展小分子的最长期限治疗对肉毒毒素/ A是主要目标我们的药物研发项目，并利用传统的基于目标的方法来确定活性位点的蛋白水解酶抑制剂7，8-10。然而，创建活性位点抑制剂具有抗多种血清型和后曝光功效广谱活性的将可能是具有挑战性的。
因此，我们已经实现了一个创新的，表型的药物发现，使用肉毒毒素SNAP-25的切割作为一个功能的端点，以确定小分子，可以阻止肉毒毒素介导的运动神经中毒的方法。 SNAP-25所需的神经递质的释放，如SNAP-25的降解是预测性麻痹和致死的体内 。例如，基于细胞的筛选可能导致发现的负责毒素失活或抑制毒素途径的靶细胞内的细胞因子的新调节剂。在表型检测发展的一个重要因素是生理上相关的生物模型的选择。 W¯¯e和其他人描述了小鼠胚胎干（ES）细胞衍生的运动神经元概括初级运动神经元的免疫学性质，包括SNAP-25 -11- 13的表达。重要的是，这些蜂窝系统到的BoNT / A中毒高度敏感和演示的SNAP-25的剂量依赖性裂解响应于增加毒素11,12的浓度。在分化的运动神经元也产生在量，足以适用于高通量板为基础的分析，并允许细胞试验的阵列的设计。
表型分析是利用两种不同的抗体，肉毒毒素/鼠标运动神经元文化的陶醉在量化内源性表达的全长SNAP-25的裂解免疫荧光法。羧基末端肉毒毒素/ A裂解敏感（BACS）抗体只识别全长SNAP-25允许SNAP-25的肉毒毒素/ A介导的蛋白水解的评价在小鼠运动神经元表达10。的盐酸法的示意图示于图1。
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Protocol
板20000分化的小鼠胚胎干细胞（MES）/孔在96孔聚-D-赖氨酸包被的板并在运动神经元的终末分化培养基维持5-7天。
1.复方管理和中毒与肉毒毒素/ A
执行下列所有工作在BSL2外壳，以保证符合CDC / NIH指南。
- 在聚丙烯96孔板中制备10mM储备溶液在100％DMSO中的每个库的化合物。使用10mM储备制备中间稀释板，其是10倍高于所需的筛选浓度。制备100μM的中间板通过分配10mM储备到96孔板中并用培养基稀释至100μM的。分配在细胞上11 10微升化合物对90微升的培养基。测试该化合物在10μM的最终浓度，并确保DMSO的终比例不超过0.5％。
- 执行所有螺栓IES是利用活细胞和活性的毒素在生物安全二级条件。与使用12通道移液器手动80微升新鲜终末分化培养基代替旧的介质，在96孔板中。进行抽吸和分配步骤，按行，以避免细胞暴露而不媒体到环境空气中。
- 预处理细胞之前通过加入10微升从源板使用12通道移液器，随后通过抽吸混合10倍的化合物应用毒素的化合物（两次）。对于每个96孔板中，治疗的6个孔的两列用10倍的DMSO稀释，在媒体上，作为高信号和低信号的控制。未经治疗的BoNT列显示全长的SNAP-25（高信号控制）的最高水平。对待其他列与肉毒毒素单独（无任何化合物）为低信号控制。使用低对照，观察SNAP-25和其检测与BACS的抗体的BoNT裂解的效率（ 图2）。
- 孵育细胞30分钟，在37℃，6％CO 2，在细胞培养箱中的化合物。
- 准备肉毒杆菌神经毒素A以上的磷酸盐浓度为1mg / ml的商业来源与终端分化培养基稀释缓冲液（PBS）到最终的10倍的股票工作。
- 通过加入10微升10×的BoNT / A股成指定用于使用多通道移液管（ 图2）治疗和低信号控制井引发中毒。把指定为高的控制与单独媒体的井。
- 净化所有的塑料制品和其他一次性用品，在水中至少20分钟的研究，浸泡在0.825％次氯酸钠溶液中谈到与肉毒毒素/ A的接触。请在生物安全柜的所有过程和两个前，用5％的洗涤剂消毒清洁剂实验如的MicroChem溶液后净化工作区域。
- 标签板明确表示毒素的使用和incub吃板处理与1nM / L的BoNT / A 4小时，在37℃，6％CO 2下在细胞培养孵育箱。显示相应的指示牌，告知同事说，毒素是在实验室使用。
- 停止BONT / A蛋白裂解甲醇固定。从各孔中除去含有毒素及化合物媒体用多道移液器，并丢弃在10％漂白溶液中。直接添加冰冷的甲醇（100微升）到每个孔中。
- 培养板在室温（RT）下15分钟，以允许固定的发生。
- 固定后，安全地处理废弃试剂（被认为中和）与生物安全1级协议和相应的丢弃。
- 丢弃甲醇并用100微升PBS洗涤细胞并预先水化他们的免疫染色。执行两个额外的PBS洗涤。
- 在最后一次洗涤后，留下的PBS中的孔中，密封板与微板粘合膜，并储存在4℃直至分析。商店板在4℃下FOř好几天。
2.免疫染色
免疫染色过程是劳动密集的，多步骤的操作，其包括重复的试剂分配/吸液循环和广泛板洗涤可导致潜在的引入显著板内和板间的变异性。一种半自动化的方法被应用到保存实验室人员的时间，提高测定吞吐量，并减少免疫染色可变性。
- 使用自动化工作站配备有96孔的头部能够传送量高达250微升并集成有机器人夹具臂移动至实验室器具插入模块甲板不同的位置（见材料和设备）来获得本协议。
- 模块化甲板被设计来承载不同类型的实验室器皿，并且可以在任一时刻支持多达11项。所述自动微处理程序配备了双杂志微孔板堆叠以保持和操纵高达每循环50的板。
- 自动化工作站位于II级生物安全柜专为实验室自动化设备，以提供无菌和安全性的内部。用于自动免疫染色，在甲板上被安排为如图3所示，使试剂访问根据需要而无需人工干预。
- 预加载板根据需要为液体处理操作包含固定的细胞进入盘盒和传递到甲板上。使用96吸管头部装有250微升提示，从油井吸出PBS下降到10微升。透化细胞膜，促进抗体结合到与透化缓冲液（0.1％的Triton-X 100）的细胞内靶。之前以及将板返回到微孔板堆叠的第二存储盒为一温育15分钟，在室温（RT）下免除透化缓冲液（100微升）到每个。
- 删除通透缓冲和PErform板用PBS洗涤（两次），为在步骤1.13如前所述。
- 在最后一次洗涤步骤后，除去PBS缓冲液中，并分配100μl的含有在PBS中的1％马血清和0.1％吐温20封闭缓冲液中的成所有微孔板他们在RT返回到盘盒1小时温育之前。
- 使用两个初级抗体为免疫染色：兔多克隆抗小鼠BACS的抗体，用于检测全长的SNAP-25和小鼠单克隆抗III微管蛋白抗体用于检测神经元（见材料和设备）的。温育60分钟后，除去封闭缓冲液，并分配50微升为4ug / ml的BACS的抗体和III微管蛋白的0.5微克/毫升的在封闭缓冲液入所有的板。
- 孵育1小时在室温下除去第一抗体和洗涤用100μl的PBS中含有0.05％吐温（PBST）洗涤3次。
- 使用抗小鼠IgG标记的Alexa Fluor 647以可视化的III微管蛋白和抗兔IgG标记的Alexa˚Fluor 568形象化BACS抗体。在封闭缓冲液中制备两种抗体为2微克/毫升的稀释和分配50μl的该混合物在每孔中。
注意：选择用于免疫染色的二级抗体标记有不同的荧光团，以允许检测其发射的荧光的使用高含量成像仪的检测器内的不同的信道不同的波长的光。 - 保温1小时，在室温。吸出的第二抗体和洗涤3次，用100μl的PBST。
- 最后一次洗涤后，加入100微升PBS含染料Hoechst公司（32微米）染色的DNA进行核检测。
- 封板用不透光的薄膜，以保护从荧光漂白。板可被储存在4 °下星期没有显著信号丢失。
3.影像
注：使用高内涵成像Sys系统进行图像采集TEM（见材料和设备）。
- 规格高内涵成像定义的：
- 选择板型，布局，字段数，目标：格雷纳ü明确，96孔板，16，分别为20倍的水。
- 选择通道：核激发EX：405纳米通道4;细胞质EX：644纳米通道2;抗原特异性抗体频道EX：561纳米通道3，每个激光器的设置励磁电源，设置实验为2曝光，曝光1与一个激励，在644纳米，2曝光的两个激励在405纳米和561纳米。选择分级为斌。
- 使用高对照孔用于与最大强度为SNAP-25信道和低对照孔为最小强度的曝光最优化。
- 调整曝光，使每个信道的强度为约一半的饱和电平（2,000-2,500相对单位）。
- 确定使用三角校正脚本小区蒙版通道的最佳Z平面。查看网络连接gure 5染色和成像后的结果。导出数据到其中的图像分析软件是驻留在服务器上。
4.图像分析（图6）
注：以下步骤描述了应用程序的哥伦布软件算法。
- 选择一个合适的算法来分割的主要对象（核）。如果需要的话，调整背景阈值和对比度参数。哥伦布软件提供4核的检测方法。选择的方法，该方法段准确细胞核通过目视检查分段核（F中igure 6a的方法M被选中）。
- 选择突起算法（CSIRO轴突分析2）段中的突起如果需要，调整背景阈值和对比度参数来去除背景。参见图6b用于检测突起的参数。
- 识别轴突区域（突起部分），BAS版上使用β-III微管蛋白的通道（Alexa的面粉640）作为掩模（ 图6c）的-3像素扩展的二次对象（突起）。
- 计算信号通道（SNAP-25，（Alexa的面粉568）的突起区域和β-III微管蛋白通道（ 图6d＆6E）的强度。
- 选择出口所需的参数，如神经突长度，SNAP-25的平均强度，β-III微管蛋白，核数，轴突段数等 （ 图1207米 ）。
- 转让板使用机器人和负载到高内涵成像仪图像采集板堆垛。
5.数据分析：
评估设计测定法的鲁棒性，计算从该板为基础的实验中使用以下参数。
- 信号（S）到背景（B）中：S / B =平均值高信号控制的强度）/平均值低信号控制的强度 <利>信号与背景的变化（CV）的系数（以测量特定信号的均匀性）：CV =（标准偏差（SD）的样品/平均值）×100（％），以确定在液体处理的可变性，试剂等
- 信噪比：S =（平均信号强度 - 指低信号控制的强度）低控制/ SD
- 计算用的二分之一的96孔板的，而另一半的一个模拟中毒中毒的Z'因子。 Z'= 1 - 3 *（高信号控制+低信号控制的SD SD）/（平均高信号控制 - 低信号控制的意思）。用于筛选数据的进一步分析，正常化一些在平板上的基础的主原料的参数，以允许板之间和比较实验不同天之间。
- ％的裂解，这反映了信号的全长度的SNAP-25的特异性抗体检测（BACS）相关联的降低：％裂解= 100％*（MEA高信号控制的n个强度 - 试样的强度）/平均高信号控制的力度。
- 抑制裂解的百分比：抑制％= 100％*（样品的强度 - 指低信号控制的强度）/（平均高信号控制的强度 - 指低信号控制的强度）。
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Representative Results
从高和低控制数据创建两个不同的群体与两个位数超过3个标准差（图7A）的差。该筛选方法的目的是要找到样品群体中的化合物，其值越接近阳性对照群体，假定样品群体（ 图7B中，（i））内的正态分布。数据点，超出平均值的3个标准偏差被认为是从噪声统计上不同的，并且分类为有效的“命中”（ 图7B（ii）中 ，红色框）。被归类为“命中”化合物将受到在未来的研究进一步确认测试， 图7B（ⅱ）示出的阳性命中的样品的群体中检测从所述隔离板的代表性子集。所有4点过值低于（中位数的样本 - 3 *样品的SD）属于这是在4个不同的隔离板发现在不同位置的同一抑制剂。这种抑制剂表现出强大的SNAP-25保护的BoNT / A， 如图5。
图1：工作流程中的肉毒毒素/ A HCI测定化合物筛选。
图2：该96孔板中的地图为的盐酸测定高对照孔（粉红色）分别以0.5％DMSO处理的，因为只有控制和低对照孔（蓝色）分别与1nM的BoNT / A和0.5％DMSO处理。样品孔（绿色）均采用1nm的毒素和10种化合物的微米0.5％DMSO。外的列和行（灰色）都没有使用，由于不兼容的优化板垫和20X水浸泡的目的的图像边缘井无力。
图3：自动化工作站甲板的免疫荧光测定法的设计封闭缓冲液，一级抗体，二级抗体和细胞染色分装在96孔聚丙烯板中，以减少死体积的试剂的损失。 PBS分装在能容纳300毫升托盘。用于废液抽吸歧管显示的插图图像上。
图4：屏幕截图含量高成像实验建立的。
图6：屏幕截图显示的图像分析流水线的各个步骤。
图7：从人机交互屏幕所产生的数据的统计处理的可视化。 （A）。 （一）箱线图分析，从控制井计算的裂解％的;与它们各自的标准差（n = 16）表现为中间值。粉红色代表着高信号控制器（HSC）;蓝色代表低信号控制（LSC）。 Z'= 0.97（ii）所述相同的值，作为上述（i）的直方图分布来演示两个控制种群之间的距离。中位数和3的SD计算从与相应的盒情节相关联的统计值。（B）中 。 192化合物的分布处理的样品来自相同的实验。 （ⅰ）盒式情节表明相比于对照以及统计学显著异常值的％裂解样品的统计值。 （ii）和（iii）中，在所有的数据群相同的值从屏幕的直方图分布（绿色）。点击数（在红场高亮显示），从有乳沟％值小于3SD从样本中（<25.89％裂解）的中位数的异常值选择。在选择过程中的四命中突出显示（ⅲ）中的所有数据点的直方图具有相似的值，以高的信号控制和表示的相同化合物，掺入的板测试中，公知的BoNT / A抑制剂（苦楝素），该封端的SNAP -25乳沟。
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Discussion
肉毒杆菌神经毒素，相对缓解他们的武器化的高效力，导致其分类为A类（最高优先级）生物威胁剂由美国疾病控制和预防。不幸的是，没有FDA批准的治疗剂来对抗的BoNT中毒后的毒素已被内化的运动神经元。促进从肉毒毒素中毒的神经元恢复任何成药机制可能会导致对潜在疗法的发展对这种生物的威胁，以保护双方的军种和公众。在这篇文章中，我们提出了一个详细的分析HCI协议进行筛选的致命毒素抑制剂如肉毒毒素/ A。这个实验的一个不寻常的方面是毒素和实施严格的生物安全议定书，以确保实验室的安全严格交接。至尊必须小心，同时积极毒素正在使用中。肉毒毒素/经甲醇固定和微孔板decontaminati一失在用10％漂白粉，5％的表面擦拭巾是允许微孔板从生物安全柜生物安全2级实验室环境中删除下游评估的关键步骤。
由于加上缓慢的运动神经元扩展（手机号码），化合物库的不断扩大规模，HCI测定的神经毒素拮抗剂往往运行在几个星期。这就需要在板之间并跨越时间的可变性，必须消除或最小化。在这个协议中，我们提供了自动化的方法染色，图像采集和分析，以减少在测定变异性。进一步的可靠性和一致性可以通过使用该协议，包括细胞电镀，清洗，并固定相关的例行任务的自动化而实现。我们的集团正在评估这些改进与把它们纳入到我们的协议在不久的将来的意图的影响。
在这份报告中，我们描述了一个SNAP-25采用高含量成像来测量完整的SNAP-25的运动神经元中的相对荧光性裂解分析法。该测定中使用BACS和β-III微管蛋白的抗体来检测全长的SNAP-25和β-III微管蛋白分别为11。 β-III微管蛋白作为标记物特异性地鉴定神经元（ 图4）。虽然肉毒毒素/ A裂解SNAP-25，并降低了SNAP-25的信号，小分子抑制任何部分这一过程的改进在成像检测SNAP-25的信号。作为该测定法依赖于从SNAP-25分布在许多微小突起产生的荧光信号，高品质的图像是绝对必要的。因此，能产生高分辨率的共焦图象的自动显微镜，建议（ 图4）。我们经常在使用20X水浸物镜捕获6-16字段/孔在96孔格式。场的成像的数量依赖于神经突向发电机密封所需的总数目Ë统计学显著的效果。
模块化的图像分析算法，用于提取多参数数据（ 图6）。哥伦布模块化图像分析算法，比较容易产生更简单的分析方案。对于更复杂的分析，或进行复杂的读数特定参数设计，阿卡贝拉基于脚本可以在歌剧院环境以及哥伦布的上下文内使用。除了从SNAP-25和β-III微管蛋白的通道中得到的荧光强度，我们定期收集的其他参数，如总细胞数（间接测量细胞毒性），神经突长度，轴突分枝和其它端点中量化神经元的健康化验。原始端点数据被输出到统计分析软件进行进一步的数据分析和命中的选择（ 图7）。此处呈现的数据证明了的HCl测定的是effici的能力ently用于在寻求利用生理有关运动神经元模型肉毒毒素/ A抑制剂的表型筛选。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Botulinum neurotoxin A | Metabiologics | NA | No catalog number |
| Microtitre plates | Greiner | 655946 | Poly-D-Lysine 96-well plates |
| BACs antibody | Lampire Biological | NA | |
| Microchem | National | 0255 | |
| Methanol | Thermo Scientific | A412-20 | |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050 | |
| PE JANUS MDT Mini Automated Workstation | Perkin Elmer | AJMDT01 | |
| Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| BIII tubulin antibody | R&D Systems | BAM1195 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379-1L | |
| Hoechst 33342dye | Invitrogen | 3570 | |
| Antimouse IgG | Invitrogen | A21236 | |
| Anti rabbit IgG | Invitrogen | A10042 | |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Ver 2.4 | |
| Spotfire | Perkin Elmer | Ver 5.5 | |
| Clorox bleach | Fisher Scientific | 18-861-284 | |
| PlateStack |
References
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