Summary
전혈 세포 독성 분석 (WCA)는 형광 현미경 및 자동화 된 화상 처리와 높은 처리량 셀 위치 결정 기술을 통합하여 개발 된 세포 독성 분석이다. 여기서, 우리는 항 CD20 항체로 처리 림프종 세포가 세포 독성 정량적 분석을 제공하는 인간 전혈에서 실시간 분석 할 수있는 방법을 설명한다.
Abstract
전반적인 세포 독성의 시간 정보에 대한 액세스를 허용 생균 기반 전혈 세포 독성 분석 (WCA)는 높은 처리량 셀 측위 기술 개발된다. 표적 종양 세포 인구 먼저 배열 형식으로 고정화에 미리 프로그램 및 녹색 형광 세포질 염료로 표시되어 있습니다. 셀 어레이의 형성에 이어, 항체 약물은 인간 전혈과 조합하여 첨가한다. 요오드화 프로피 듐 (PI)는 다음 세포 사멸을 평가하기 위해 첨가된다. 셀 어레이는, 자동 촬상 시스템으로 분석된다. 세포질 염료를 대상으로 종양 세포 인구 레이블하지만, PI는 죽은 종양 세포 인구 레이블. 따라서, 표적 암 세포의 사멸 율은 죽은 표적 세포의 수에 표적 세포 생존 수를 계산함으로써 정량화 할 수있다. 이 방법으로, 연구자들은 시간 의존적 농도 의존적 세포 독성 정보에 액세스 할 수있다. 놀랍게도, 유해 라디오 없다화학 물질이 사용된다. 여기에 제시된 WCA는 림프종, 백혈병 및 고형암 세포주에서 테스트되었습니다. 따라서, WCA는 연구자가 관련성이 높은 생체 조건에서 약물의 효능을 평가할 수 있습니다.
Introduction
제약 산업에서의 최근의 진보는 종양 세포 항체 및 개인화 된 암 치료의 특정 식별을 실현하는데 관심이 높아진있다; 그러나, 여러 가지 장애물 공정에서 발생된다. 전임상 개발에 항암 활성을 에이전트의 단 5 %의 단계 II-III 시험 1, 2에 충분한 효능을 표시 한 후 라이센스가 부여됩니다. 많은 예제 인해 서로 다른 혈액 성분 3-5 그 항 종양 약물은 인간에 주로 실험 동물에 다르게 동작 보여 주었다으로 임상 전략 (생체 외 및 생체 내) 최적입니다.
항암 약물 스크리닝 플랫폼의 필요성을 해결하기 위해 비싼 동물 실험 및 임상 시험 전에 체크 포인트를 제공하기 위해, 인간 전혈 세포 독성 분석 (WCA)는 더욱 중요한 생물학적 환경에서 항 종양 약물의 효능을 평가하기 위해 제안된다.전혈 세포 독성 분석은 항체 및 인간 전혈의 다른 약물 후보 개별 세포의 반응을 평가할 수있다.
WCA는 높은 처리량과 높은 함량 촬상 6 높은 처리량 셀 위치 결정 기술을 통합하여 개발된다. 자동화 된 이미징 시스템을 이용하여 모두 거실과 사균의 수는 고정밀 도로 측정 할 수있다. 인해 표적 세포가 동일한 초점 평면 상에 고정된다는 사실 때문에, WCA는 적혈구의 제거없이 실시간 정량적 세포 독성 분석을 제공 할 수있다. 또한, 자동 촬상 시스템은 그 특정 기준에 도달 한 경우에만 표적 세포 (예., 형광 표지 된 세포 및 세포 형태) 등의 여러 가지 이점 게이팅되고 처리를 제공한다. 또한, 하루에 144 판의 생산을 허용한다. 결과적으로,이 영상 능력과 처리량이 높은 C의 실행을 허용ontent 동시에 높은 처리량 실험. WCA 및 자동화 된 이미징 시스템을 조합함으로써, 높은 처리량 정량 세포 독성 분석은 더욱 중요한 생물학적 환경에서 달성 될 수있다.
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Protocol
1. 대상 셀 준비
- 37 O C에서 (10 % 열 - 불 활성화 소 태아 혈청 (FBS), 4 ㎚ L 글루타민, 500 IU / ml의 페니실린 / 스트렙토 마이신, RPMI 1640 배지) 성장 배지에서 표적 세포 (예. 라지 림프종 세포)를 유지 5 % CO 2 인큐베이터.
- 15ml의 튜브에 표적 세포 펠릿 시료를 원심 분리기. 원심 분리 시간은 다른 세포 유형에 따라 달라집니다; 라지 세포에 대한 468 XG에 3 분 동안 원심 분리.
- 먼저 상층 액의 표면에 형성하는 거품을 대기음, 전체 상층 액을 제거합니다.
- 튜브에 PBS의 10 ML을 추가합니다. 세포 덩어리를 분리시킨 솔루션을 피펫 팅에 의해 여러 번 아래로 세포를 다시 일시 중지합니다.
- 원심 분리기 468 X g에서 3 분의 샘플.
- 상등액의 표면에 형성하는 기포를 대기음, 전체 상층 액을 제거한다.
세포 마이크로 어레이 2. 준비
- Obtain 세포 부착 96 웰 플레이트 키트 또는 단일 셀 어레이 8 웰 챔버 슬라이드 (재료 / 시약의 표 참조).
- 키트에서 DNA 시약에 액티베이터의 1.2 μl를 적용합니다. , 유리 병 캡을 반전, 부드럽게 솔루션을 혼합 흔들어.
- 이 솔루션은 실온에서 20 분 동안 반응 할 수 있습니다.
- (15 ML 튜브에서) 표적 세포 펠렛에 혼합 용액을 적용합니다.
- 500 nM의 최종 농도 세포질 녹색 형광 염료를 추가한다.
- 오비탈 쉐이커상에서 RT에서 30 분 동안 혼합 용액 및 염료로 표적 세포를 부화.
- 5 ml의 PBS로 두 번 세포를 씻어, 10 ml의 성장 배지에서 세포를 재현 탁.
- 각 웰 단계 2.7에서 용액 100 μl를 적용합니다. hemacytometer를 이용하여 세포 수를 계산. 확인 세포 수를 잘 당 6 ~ 10 × 10월 4일에서 1일까지 × 5 사이의 세포를 다양합니다.
- 실온에서 배양 10 ~ 15 분 후, 부드럽게 200-30로 두 번 샘플을 씻어0 μL 성장 미디어는 언 바운드 세포를 제거합니다.
참고 : 약 5 ~ 10 μL 성장 미디어는 세척 후 각 웰에 남아 있습니다.
3. 전체 혈액 세포 독성 분석 실험
- 물론 각각의 샘플에 인간의 전체 혈액의 180 μl를 추가합니다.
- ㎖ / 5mg을에 항 CD20 항체 용액을 얻어서하도록 일련의 희석을 수행하는 50, 20, 10, 5, 2, 1, 1.5 ㎖의 튜브에 항 CD20 항체 용액 0.5 ㎍ / ml로. 각 샘플 잘 삼중를 만들기 위해 항 -CD20 항체의 농도를 각각 20 μl를 추가합니다.
- 각 웰에 500nM의 최종 농도로 요오드화 프로피 듐을 추가한다.
- 16 시간 동안 5 % CO 2로 37 ° C에서 얻어진 플레이트를 인큐베이션.
- 이미지 슬라이드 또는 8 배 배율 자동 이미징 시스템을 96 웰 플레이트에 세포.
- 결과를 정량화하는 자동 촬상 시스템의 셀 카운팅 프로그램을 사용한다.
주 : 자동 촬상 시스템의 소프트웨어는 단순 제공단계별 세포 계수에 대한 작업을. 이 소프트웨어를 사용하는 프로토콜은 제공자의 웹 사이트에서 확인할 수있다. - 소프트웨어의 메인 페이지에서 [리뷰 결과]를 선택합니다.
- [샘플 저장 한 파일]을 선택합니다.
- 제 1 게이트는 FITC 강도가> (50), 다음 게이트 TxRed가 강도> (20)을 의미 의미한다.
- [플레이트 개요]를 선택합니다.
- [내보내기 테이블]을 선택합니다.
참고 :이 프로그램의 비율 세포 살해 공식은 다음과 같습니다 :
% 표적 세포 살해 = (녹색과 빨간색 두 염색 된 세포의 # / 세포의 # 녹색 스테인드) * 100 %
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Representative Results
항 CD20 항체 및 림프종 세포 (라지 세포 및 MC / CAR)은 전혈 세포 독성 분석 (WCA) 7,8 입증하는 모델 시스템으로 선택되었다. MC / CAR 세포들은 멤브레인 CD20 낮은 카피 수 있었는 라지 세포는 세포 표면 상 CD20의 높은 카피 수 있었다. 표적 세포는 먼저 녹색 형광 세포질 염료 녹색 염색 96 웰 플레이트에 배열했다. 10000 - 50000 림프종 표적 세포를 각 웰에 고정화 하였다. 갓 그린 인간 전혈 180 ㎕를 각 웰에 첨가 하였다. 항 CD20 항체는 농도 구배 96 웰 플레이트의 각 웰에 첨가 하였다. 37 ° C에서 16 시간 배양 한 후, 세포 수는 녹색 형광 세포 및 적색 형광 세포의 수를 분석하여 자동 화상 카메라를 통해 정량적으로 평가 하였다. 림프종 표적 세포가 모두 동일한 초점 평면 상에 배열 되었기 때문에, 각 셀의 형광도 레모 않고 직접 검출되었다웰에 혈구 ving.
도 1에 도시 된 바와 같이, (건재 죽은 모두) 대상 라지 림프종 세포의 검출을 행 하였다. 도 1에서 녹색 점 제시된 표적 세포의 수를 나타내었다. 그들은 PI와 형광 빨간색 염색 때문에 그림 1의 죽은 세포 (붉은 점)은 적색 형광의 강도를 정량적으로 분석 하였다. 항체의 세포 독성은 (녹색 점) 제시 세포에 죽은 세포의 비율 (모두 녹색과 빨간색 염색)을 통해 분석 하였다. 항 CD20 항체의 농도가 감소 된 농도로 형광 빨강 점의 수는 감소 하였다.
각 항체 농도는 삼중 독립적으로 시험 하였다. 각 항체 농도를 들어, 웰 당 400 개 이상의 표적 세포는 평균값 및 세포 독성 결과의 표준 편차를 제공하도록 묘화 하였다. 400 데이터 포인트 체육와 함께, 우리의 데이터를 바탕으로r에 항체 농도, 우리는 p 값 <0.01로 통계 결과를 얻었다. 용량 의존적 마약 효율은도 2를 얻었다. CD20 항원의 낮은 카피 수와 MC / CAR 세포 제어 세포주로 사용 하였다. 0.12 ㎍ / ㎖가 EC (50) 값은 보체 의존성 세포 독성 분석 (CDC) 또는 항체 의존성 세포 독성을 포함한 정규 항체의 세포 독성 분석에서 얻은 값 범위 내에 라지 림프종 세포, 대 WCA 결과 (용 얻었다 ADCC) 분석. 9-11
도 1. 항체 기반 세포 독성은 전혈에서 측정. 라지 세포는 녹색 세포질 염색으로 표지 한 후 고정화 하였다. PI는 세포 사멸에 접근시켰다. 죽은 세포는 PI로 빨간색 염색 하였다. 다양한 정광항 CD20 항체의 이온은 전혈의 추가로 첨가 하였다. (a) 2.5 ㎍ / ㎖의 항 CD20 항체를 16 시간 후에, (b) 1 ㎍ / ㎖의 항 CD20 항체를 16 시간 후에, (c) 0.5 ㎍ / ㎖의 항 CD20 항체를 16 시간 후, (d)는 0.25 μg의 / ㎖의 항 CD20 항체를 16 시간 후에, (예) 0.1 μg의 후 / ㎖의 항 CD20 항체를 16 시간 후 (f)를 0.05 ㎍ / ㎖의 항 CD20 항체를 16 시간, (g) 2.5 μg의이 ml의 항체 제어 / 16 시간 후.
그림 인간의 전체 혈액에 다른 세포주에 대하여 2. 용량 의존적으로 세포 독성. 라지는 CD20 양성 림프종 세포, 그리고 MC / CAR는 CD20 부정적인 세포주이었다. 전혈 세포 독성 수준은 α-CD20 항체 (항 CD20 항체)의 서로 다른 농도에 대해 도시 하였다.
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Discussion
WCA는 이상적으로 이러한 CDC와 ADCC 분석 9-11, 같은 및 전임상 동물 시험 전에 기존 대상 검사 한 후 사용 단일 셀 해상도 12-16,와 체외 안티 - 암 검진 도구에서 중요하다. 현재, 이러한 CDC 또는 ADCC 분석 1 차 대상 심사 분석은 모든 단순화 된 미디어 또는 버퍼 시스템에서 수행됩니다. 그러나 이러한 단순화 된 완충 시스템에서 효능을 보여 약물 후보는 항상 더 복잡한 전혈 시스템에서 효과적이지 않다. 따라서, WCA는 전통적인 타겟 상영 비싼 동물 연구 간의 격차 가양 줄이고, 따라서 동물 실험 또는 인간 임상 시험에서 예방 고장을 방지 할 수있다. WCA는 인간 전혈의 함량 약물 효능을 테스트하기 위해 전임상 연구에서 작업 연구자 유익 할 것이다. 유동 세포 계측법을 사용하여 죽은 자와 살아있는 세포를 계산하는 것은 적혈구 CE의 완전한 용해가 필요합니다순서 LLS가 표적 세포를 검출한다. 유동 세포 계측법 위에 WCA 기술의 장점은 적혈구의 용해없이 표적 세포를 식별 할 수 있다는 것이다. 그것은 완전히 혈액 샘플에서 모든 적혈구 세포를 용해하는 것은 곤란하고, 표적 세포는 또한 부분적으로 용해 과정 중에 용해된다.
스크리닝 패널 맞춤 암 치료, 주어진 종양 내 세포 이질성의 평가, 특정에 내성 세포의 식별에 방법을 포장, 개개 환자로부터 수득 라이브 일차 세포를 이용하여 생성 될 수 있다면 더욱 흥미로운 기회가 발생할 약물 치료. 인 접근법 의료 시스템 이동 "예방 및 환자의 필요에 중심 맞춤, 예측은,"약 (17, 18)의 미래이다. FDA, 질병 통제 센터 (CDC), NIH, 센터를 포함하여 미국 보건 복지부 내에서 많은 활동,메디 케어 및 메디 케이드 서비스 및 보건 자원 및 서비스 관리를위한 개인화 된 치료를 증진하는 조치를 지원하기 위해 존재한다. 맞춤 의학의 실현은 관련 생물학적 상태를 유지하면서 캡처 및 인간의 세포를 저장할 수있는 신뢰할 수있는 기술과 제품에 따라 달라집니다. 우리는 맞춤 의학 어플리케이션에 그 / 그녀의 자신의 혈액의 행렬에 암 환자의 종양 세포에 대한 약물을 선별 WCA를 적용 예견 할 수 있습니다.
프로토콜의 중요한 단계는 셀 어레이의 제제이다. 사용자가 셀 세척 단계에서 세포를 잃지 않고 상층 액을 모두 제거해야합니다. 또한 사용자는 액체 바이알에서 볼 수없는 경우 짧은 원심 분리 할 필요가있다. DNA 시약 용액을 제조 한 후에는 30 분 내에 세포와 함께 사용되어야한다.
셀 어레이의 형성 효율은 세포 유형에 의존한다. 보다가 있었다이 프로토콜 테스트 셀 (100) 유형; 그러나, 일부 특정 세포 유형 효율적 셀 어레이를 형성하지 않을 여전히 가능하다. 아니 셀 어레이 형성하면, DNA 시약의 높은 농도는 더 나은 셀 어레이 형성을 얻기 위하여 동일한 프로토콜을 수행하도록 권장한다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없습니다.
Acknowledgments
우리는이 일 [R33 CA174616-01A1]을 자금 NIH에서 국립 암 연구소 (National Cancer Institute)의 IMAT 프로그램을 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell attachment 96 well plate kits | Adheren | AP9601 | |
| Suspension Single cell array 8 well chamber slide | Adheren | SS0801 | |
| Adherent Single cell array 8 well chamber slide | Adheren | SS0802 | |
| Lymphoma cell line CD20+ | ATCC | CCL-86 | Raji cells |
| Lymphoma cell line CD20- | ATCC | CRL-8083 | MC/CAR |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Life Technologies | 11875-119 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo | SH30070.01HI | |
| Peni/Strep | Life Technologies | 15070063 | |
| Cytosolic dye | Life Technologies | C7025 | Cell Tracker Green |
| Rituxan (Biosimilar) | Eureka Therapeutics | ||
| Human whole blood | Allcells | WB001 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-10MG | |
| Automatic imaging system | Molecular Devices | Contact Vendor | Cell Reporter |
| Cell counting program | Molecular Devices | Contact Vendor | Cell Reporter |
References
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