Summary
Hele blod Cvtotoksisitetsmålinq (WCA) er en cytotoksisitet analyse utviklet ved å innlemme high-throughput celle posisjonering teknologi med fluorescens mikroskopi og automatisert bildebehandling. Her beskriver vi hvordan lymfomaceller behandlet med et anti-CD20-antistoff kan bli analysert i sanntid i humant fullblod for å tilveiebringe cellulær cytotoksisitet kvantitativ analyse.
Abstract
En levende cellebasert assay helblod cytotoksisitet (WCA) som gir tilgang til tidsmessige informasjon av den samlede celle cytotoksisitet er utviklet med high-throughput-celle posisjoneringsteknologi. De målrettede tumorcellepopulasjoner er først forhåndsprogrammert til immobilisering i en rekke format, og merket med grønne fluorescerende cytosoliske fargestoffer. Etter celle-matrise formasjonen, blir antistoff stoffer tilsettes i kombinasjon med humant helblod. Propidiumjodid (PI) blir deretter tilsatt for å vurdere celledød. Cellen matrise blir analysert med en automatisk avbildningssystem. Mens cytosolisk fargestoff etiketter målrettede tumorcellepopulasjoner, etiketter PI de døde tumorcellepopulasjoner. Således kan andelen av target cancer celledreping kvantifiseres ved beregning av antall overlevende målrettede celler til antallet døde målrettede celler. Med denne metoden forskerne er i stand til å få tilgang til tidsavhengig og doseavhengig celle cytotoksisitet informasjon. Bemerkelsesverdig, ingen farlig radiokjemikalier benyttes. Den WCA presenteres her har blitt testet med lymfom, leukemi, og solide tumorcellelinjer. Derfor lar WCA forskere for å vurdere medikament-effektivitet i en svært relevant ex vivo tilstanden.
Introduction
Nylige fremskritt innen den farmasøytiske industrien har ført til en økt interesse for å realisere de spesifikke identifikasjoner av tumorcelle antistoffer og personlige kreft behandlinger; imidlertid flere hindringer oppstått i prosessen. Kun 5% av agenter som har anticancer aktivitet i preklinisk utvikling er lisensiert etter å ha vist tilstrekkelig effekt i fase II-III testing 1,2. De prekliniske strategier (både in vitro og in vivo) som er suboptimal mange eksempler har vist at antitumorlegemidler oppfører seg forskjellig i mennesker og hos forsøksdyr hovedsakelig på grunn av deres forskjellige blodkomponenter 3-5.
For å møte behovet for en antitumormedikamentscreening plattformen og for å tilveiebringe en kontroll-punkt før kostbare dyreforsøk og kliniske forsøk, er en human fullblod analyse cytotoksisitet (WCA) foreslått for å evaluere antitumorlegemiddel effekt i en mer relevant biologisk miljø. Denhelblod cytotoksisitet Målingen kan brukes til å evaluere responsen av individuelle celler til antistoffer og andre legemiddelkandidater i humant helblod.
Den WCA er utviklet ved å innlemme high-throughput celle posisjonering teknologi med høy gjennomstrømming og høy-innhold bildebehandling 6. Ved å benytte et automatisert bildedanningssystem, kan antallet av både levende og døde celler bestemmes med en høy grad av presisjon. På grunn av det faktum at målcellene er immobilisert på den samme fokalplan, WCA er i stand til å gi kvantitative analyse cytotoksisitet i sanntid uten fjerning av røde blodceller. Videre gir den automatiske bildebehandlingssystemet flere fordeler som for eksempel at bare målceller som har nådd de angitte kriteriene (f.eks., Fluorescensmerkede celler og celle morfologi) er gated og bearbeides. Dessuten gjør det produksjonen av 144 plater per dag. Derfor tillater denne imaging evne og gjennomstrømning drift av high-content og high-throughput eksperimenter samtidig. Ved å kombinere WCA og automatisert bildesystem, kan høy gjennomstrømming kvantitativ celle cytotoksisitet analyser oppnås innenfor en mer biologisk relevant miljø.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Target Cell Forberedelse
- Oppretthold målceller (f.eks. Raji lymfomceller) i vekstmedium (RPMI 1640 kulturmedium, med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS), 4Nm L-glutamin, og 500 IE / ml penicillin / streptomycin) ved 37 o C i en 5% CO2-inkubator.
- Sentrifuger for å klumpe prøven målcellene i et 15 ml rør. Sentrifugetiden varierer med forskjellige celletyper; Sentrifuger i 3 minutter ved 468 xg i Raji-celler.
- Først Aspirer eventuelle bobler som dannes på overflaten av supernatanten, og fjerne hele supernatanten.
- Tilsett 10 ml av PBS til røret. Re-suspendere cellene ved å pipettere løsningen opp og ned flere ganger for å bryte opp celleklumpen.
- Sentrifuger prøven i 3 minutter ved 468 x g.
- Aspirere eventuelle bobler som dannes på overflaten av supernatanten, og fjerne hele supernatanten.
2. Utarbeidelse av Cell Mikromatriser
- Obtain celleadhesjonen 96 brønners plate kits eller enkeltcellegruppe 8 godt kammer lysbilder (se tabell over materialer / reagenser).
- Påfør 1,2 mL av Activator til DNA reagens fra settet. Lukk glasset, snu den, og rist for å blande løsningen.
- Tillat løsningen å reagere i 20 minutter ved RT.
- Påfør den blandede oppløsningen til målcellene pellet (i 15 ml tube).
- Tilsett grønne fluorescens cytosoliske fargestoffer ved en sluttkonsentrasjon på 500 nM.
- Inkuber målcellene med den blandede løsning og fargestoffet i 30 minutter ved RT på en orbital shaker.
- Vask cellene to ganger med 5 ml PBS, og resuspender cellene i 10 ml vekstmedium.
- Påfør 100 pl av oppløsningen fra trinn 2.7 i hver brønn. Telle celle nummer ved hjelp av en hemacytometer. Sørg for at celle tall varierer mellom 5 × 4 til 1 oktober × 10 6 celler per brønn.
- Etter 10-15 minutter inkubering ved romtemperatur, forsiktig vaskes to ganger med prøvene 200-300 ul vekstmedier for å fjerne eventuelle ikke-bundne celler.
MERK: Om 5-10 mL vekstmedier forblir i hver brønn etter vask.
3. Whole Blood cytotoksisitetsanalyser
- Legg 180 ul av humant helt blod til hver prøve godt.
- Skaff Anti-CD20-antistoff løsning ved 5 mg / ml, og utføre seriell fortynning for å gjøre 50, 20, 10, 5, 2, 1, 0,5 ug / ml av anti-CD20-antistoff oppløsning i 1,5 ml rør. Tilsett 20 pl av hver konsentrasjon av anti-CD20-antistoff til hver prøve brønn som triplikater.
- Legg propidiumjodid ved en sluttkonsentrasjon på 500 nM til hver brønn.
- Inkuber den resulterende plate ved 37 ° C med 5% CO2 i 16 timer.
- Bilde cellene på lysbilder eller 96 brønners plater med en automatisk bildesystem med 8X forstørrelse.
- Bruk celletelling program av den automatiske bildesystem for å kvantifisere resultatene.
MERK: Programvaren på den automatiske bildebehandlingssystem gir enkeltrinn-for-trinn-operasjoner for celletelling. Protokollen for å bruke denne programvaren finner du på leverandørens hjemmeside. - Velg [anmeldelse Resultater] fra hovedsiden av programvaren.
- Velg [Fil lagret for Samples].
- Første gate FITC bety intensitet> 50, deretter gate TxRed bety intensitet> 20.
- Velg [Plate Oversikt].
- Velg [Eksport Tables].
NB: Den prosentvise celledreping formel av programmet er vist nedenfor:
% Target celledreping = (# av celler farget både grønn og rød / # av celler farget grønn) * 100%
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anti-CD20-antistoffer og lymfomceller (Raji-celler og MC / CAR) ble valgt som modellsystem for å demonstrere helblod cytotoksisitet assay (WCA) 7,8. Raji-celler hadde høyt kopiantall av CD20 på celleoverflaten, mens MC / CAR-celler hadde lavt kopiantallet av CD20 på deres membran. Målrettede celler ble først farget grønn med grønn fluorescens cytosoliske fargestoffer og kledd på 96-brønns plate. 10.000 - 50.000 mål-lymfomceller ble immobilisert i hver brønn. 180 pl av ferskt trukket humant helblod ble tilsatt i hver brønn. Anti-CD20-antistoff ble deretter tilsatt i hver brønn av en 96-brønners plate med graderte konsentrasjoner. Etter 16 timer med inkubering ved 37 ° C, ble celletall vurderes kvantitativt gjennom den automatiske kamera ved å analysere antallet grønne fluorescente celler og røde fluorescerende celler. Siden målet lymfomceller ble alle oppstilt på samme fokalplan, ble fluorescensen av hver celle påvises selv uten direkte Remotreråvare blodcellene i brønnen.
Som vist i figur 1, ble deteksjonen av de målrettede Raji-lymfomceller (både levende og døde) utført. Grønne prikker i Figur 1 indikerte antall målceller som presenteres. Døde celler (røde prikker) i figur 1 ble analysert kvantitativt ved intensiteten av den røde fluorescens fordi de var farget rødt fluorescerende med PI. Antistoff cytotoksisitet ble analysert gjennom forholdet mellom døde celler (både farget grønn og rød) til cellene som er presentert (grønne prikker). Antallet fluorescerende røde prikker redusert som konsentrasjonen av anti-CD20-antistoff ble redusert i konsentrasjon.
Hvert antistoff konsentrasjonen ble testet uavhengig i tre paralleller. For hver antistoffkonsentrasjon, ble mer enn 400 målceller pr brønn avbildes for å gi middelverdien og standardavviket for cytotoksisitet resultater. Basert på våre data, med 400 datapunkter per antistoff konsentrasjon, vi innhentet statistiske resultater med p-verdi <0,01. Den dose-avhengige medikamenteffektivitet ble erholdt i figur 2. De MC / CAR-celler med lavt kopiantallet av CD20-antigenet ble anvendt som en kontrollcellelinje. En EC50 verdi på 0,12 ug / ml ble oppnådd for den WCA resultat mot Raji-lymfomceller, som var i området med verdien erholdt i de vanlige antistoff cytotoksisitetsanalyser inkludert komplementavhengig cytotoksisitet assay (CDC) eller antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet ( ADCC) assay. 9-11
Figur 1. Antistoffbasert cytotoksisiteten målt i helblod. Raji-celler ble merket med en grønn cytosoliske fargestoff og deretter immobilisert. PI ble også tilsatt for å få tilgang til celledød. Døde celler ble farget rødt av PI. Varierende Konsentraterioner av anti-CD20-antistoff ble tilsatt under tilsetning av helblod. (A) 2,5 ug / ml anti-CD20-antistoff etter 16 timer, (b) 1 ug / ml anti-CD20-antistoff etter 16 timer, (c) 0,5 ug / ml anti-CD20-antistoff etter 16 timer, (d) 0,25 ug / ml anti-CD20-antistoff etter 16 timer, (e) 0,1 ug / ml anti-CD20-antistoff etter 16 timer, (f) 0,05 ug / ml anti-CD20-antistoff etter 16 timer, (g) 2,5 ug / ml kontroll-antistoffet 16 hr etter.
Figur 2. Doseavhengig cytotoksisitet mot ulike cellelinjer i humant fullblod. Raji var en CD20 positive lymfom celler, og MC / BIL var en CD20 negative cellelinjer. Nivået av helblod cytotoksisitet ble vist for forskjellig konsentrasjon av α-CD20-antistoff (anti-CD20-antistoff).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
WCA er en kritisk in vitro anti-kreft-screening verktøy med enkelt celle oppløsning 12-16, ideelt sett benyttes etter tradisjonelle mål screenings som CDC og ADCC analyser 9-11, og før prekliniske dyreforsøk. Foreløpig er primære målet utvelgelsesassays som CDC eller ADCC analyser alle utført i en forenklet media eller et buffersystem. Men legemiddelkandidater som viser effekt i disse forenklede buffersystem er ikke alltid effektive i mer komplekse fullblods system. Derfor kan WCA bro over gapet mellom tradisjonelle målet screenings og kostbare dyrestudier, redusere falske positiver, og dermed hindre at forebygges feil i dyreforsøk eller i kliniske studier. Den WCA vil være fordelaktig for forskere som arbeider med de prekliniske studier for å teste stoffet effekt i innholdet i humant fullblod. Telle de døde og levende celler ved hjelp av flowcytometri krever den komplette lyse av røde blod ceLLS for å oppdage målceller. Fordelen med WCA teknikk flowcytometri er at den kan identifisere målceller uten lysis av røde blodceller. Det er vanskelig å fullstendig å lysere alle de røde blodceller i blodprøven, og mål-celler blir også delvis lysert i lyseringsprosedyren.
Enda mer spennende muligheter oppstår dersom screening paneler kan genereres ved hjelp av levende primære celler hentet fra den enkelte pasient, som banet veien til personlig kreft behandlinger, evaluering av celle heterogenitet innenfor en gitt svulst, og identifisering av celler som er resistente mot en gitt medikamentell behandling. Flytte helsevesenet til en tilnærming som er "personlig, prediktiv, forebyggende og sentrert på pasientens behov" er fremtidens medisin 17,18. Mange tiltak innenfor det amerikanske Department of Health and Human Services, inkludert FDA, Centers for Disease Control, NIH, Centersfor Medicare og Medicaid Services, og Health Resources og Services Administration eksisterer for å støtte initiativ for å fremme personlig omsorg. Realisering av personlig medisin avhenger pålitelige teknologier og produkter som kan fange og holde eventuelle menneskelige celler og samtidig opprettholde dem i et relevant biologisk tilstand. Vi kan forutse påføre WCA å screene medikamenter mot kreft pasientens kreftceller i matrisen av hans / hennes eget blod for personlig medisin applikasjoner.
De kritiske trinnene i protokollen er de preparater av celleoppstillingen. Brukerne trenger å fjerne alt av supernatanten uten å miste cellene i løpet av cellevasketrinn. I tillegg brukerne trenger å gjøre en kort sentrifugering dersom væsken ikke kan sees i ampullene. Når DNA reagensoppløsning er utarbeidet, må det brukes med cellene i 30 min.
Cellen rekke dannelse effektivitet er celletype avhengig. Det har vært mer enn100 typer celler testet med denne protokollen; Det er imidlertid fortsatt mulig at noen spesifikke celletyper ikke vil danne cellegruppe effektivt. Hvis ingen celle array-former, er en høyere konsentrasjon av DNA reagent anbefales å utføre den samme protokollen for å få bedre cellegruppe formasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker National Cancer Institute IMAT program fra NIH for finansiering dette arbeidet [R33 CA174616-01A1].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell attachment 96 well plate kits | Adheren | AP9601 | |
| Suspension Single cell array 8 well chamber slide | Adheren | SS0801 | |
| Adherent Single cell array 8 well chamber slide | Adheren | SS0802 | |
| Lymphoma cell line CD20+ | ATCC | CCL-86 | Raji cells |
| Lymphoma cell line CD20- | ATCC | CRL-8083 | MC/CAR |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Life Technologies | 11875-119 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo | SH30070.01HI | |
| Peni/Strep | Life Technologies | 15070063 | |
| Cytosolic dye | Life Technologies | C7025 | Cell Tracker Green |
| Rituxan (Biosimilar) | Eureka Therapeutics | ||
| Human whole blood | Allcells | WB001 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-10MG | |
| Automatic imaging system | Molecular Devices | Contact Vendor | Cell Reporter |
| Cell counting program | Molecular Devices | Contact Vendor | Cell Reporter |
References
- Hutchinson, L., Kirk, R. High drug attrition rates--where are we going wrong. Nat Rev Clin Oncol. 8, 189-1890 (2011).
- Moreno, L., Pearson, A. D. Attrition rates be reduced in cancer drug discovery. Informa healthcare. 8, 363-368 (2013).
- Seok, J., et al. Inflammation and Host Response to Injury, Large Scale Collaborative Research Program. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3507-3512 (2013).
- Suntharalingam, G., et al. Cytokine storm in a phase 1 trial of the anti-CD28 monoclonal antibody TGN1412. N Engl J Med. 355, 1018-1028 (2006).
- Eastwood, D., et al. Monoclonal antibody TGN1412 trial failure explained by species differences in CD28 expression on CD4+ effector memory T-cells. Br J Pharmacol. 161, 512-526 (2010).
- Hsiao, S. C., Liu, H., Holstlaw, T. A., Liu, C., Francis, C. Y., Francis, M. B. Real time assays for quantifying cytotoxicity with single cell resolution. PLoS One. 8, 10-1371 (2013).
- Wang, S. Y., Weiner, G. Rituximab: a review of its use in non-Hodgkin’s lymphoma and chronic lymphocytic leukemia. Expert Opin Biol Ther. 8, (2008).
- Dalle, S., Thieblemont, C., Thomas, L., Dumontet, C.
- Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14, 181-196 (1968).
- Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. J Immunol Methods. 64, (1983).
- Gerlier, D., Thomasset, N. J. Use of MTT colorimetric assay to measure cell activation. Immunol Methods. 94, 57-63 (1986).
- Toriello, N. M., et al. Integrated microfluidic bioprocessor for single-cell gene expression analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (2008).
- Douglas, E. S., Hsiao, S. C., Onoe, H., Bertozzi, C. R., Francis, M. B., Mathies, R. A. DNA-barcode directed capture and electrochemical metabolic analysis of single mammalian cells on a microelectrode array. Lab on a Chip. 9, 2010-2015 (2008).
- Mayr, L. M., Bojanic, D.
- Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends in Biotechnology. 28, 237-245 (2010).
- Coelho, J., P, L., Quinn, S., Murphy, R. F. Automated image analysis for high-content screening and analysis. J Biomol Screen. 15, 726-734 (2010).
- Sundberg, S. A. High-throughput and ultra-high-throughput screening: solution- and cell-based approaches. Current Opinion in Biotechnology. 11, 47 (2000).
- Simmons, L. A. Personalized medicine is more than genomic medicine: confusion over terminology impedes progress towards personalized healthcare. PERS MED. 9, 85 (2012).
