Summary
全血細胞毒性アッセイ（WCA）は、蛍光顕微鏡および自動化された画像処理をハイスループット細胞測位技術を組み込むことによって開発された細胞毒性アッセイである。ここでは、抗CD20抗体で処置したリンパ腫細胞の定量的な細胞傷害性分析を提供するために、ヒト全血中でリアルタイムに分析することができる方法について説明します。
Abstract
全体的な細胞毒性の時間情報へのアクセスを可能にする生細胞ベースの全血の細胞毒性アッセイ（WCA）は、ハイスループット細胞測位技術で開発されている。標的腫瘍細胞集団は、最初の配列形式に固定化予めプログラム、および緑色蛍光の細胞質ゾル色素で標識されている。セルアレイを形成した後、抗体医薬品は、ヒト全血との組合せで添加される。ヨウ化プロピジウム（PI）は、細胞死を評価するために添加される。セル配列は、自動画像化システムを用いて分析される。細胞質ゾルの色素が標的腫瘍細胞集団にラベルを付けながら、PIは死んだ腫瘍細胞集団にラベルを付けます。従って、標的癌細胞の殺傷の割合は死んだ標的細胞の数の標的細胞の生存数を計算することによって定量することができる。この方法では、研究者は、時間依存性および用量依存性の細胞毒性の情報にアクセスすることができる。驚くべきことに、有害ラジオません化学物質が使用されている。 WCAは、ここで提示リンパ腫、白血病、および固形腫瘍細胞株を用いて試験された。したがって、WCAは研究者が、関連性の高いex vivoの状態で薬効を評価することができます。
Introduction
製薬業界における最近の進歩は、腫瘍細胞抗体パーソナライズ癌治療の特定の識別を実現する上で関心が高まってきた。しかし、いくつかの障害は、プロセスで遭遇している。前臨床開発中の抗がん活性を有する薬剤のわずか5％がフェーズII-III試験の1,2で十分な有効性を示した後にライセンスされています。多くの例では抗腫瘍薬3-5主としてそれらの異なる血液成分にヒトおよび実験動物では異なる挙動を示すことが示されているように（in vitroおよびin vivoの両方で ）前臨床戦略は最適以下である。
抗腫瘍薬物スクリーニングプラットフォームの必要性に対処するために費用のかかる動物実験および臨床試験前のチェックポイントを提供するために、ヒト全血の細胞毒性アッセイ（WCA）は、より関連性の生物学的環境において抗腫瘍薬の有効性を評価するために提案されている。ザ·全血の細胞毒性アッセイは、抗体およびヒト全血の他の薬物候補への個々の細胞の応答を評価するために用いることができる。
WCAは、ハイスループットおよびハイコンテントイメージング6でハイスループット細胞測位技術を組み込むことによって現像される。自動化されたイメージングシステムを利用することにより、生きている細胞および死細胞の両方の数を高精度に判定することができる。による標的細胞は、同一の焦点面上に固定されているという事実のため、WCAは、赤血球を除去することなく、リアルタイムでの定量的細胞毒性分析を提供することができる。また、自動イメージングシステムは、その指定した基準に達した場合にのみ、標的細胞（ 例えば 、蛍光標識された細胞、および細胞形態）などのいくつかの利点ゲートされ、処理さを提供する。また、一日あたり144のプレートを製造することができる。したがって、この撮像能力とスループットが高いcの実行を可能にするontentハイスループット実験を同時に。 WCAおよび自動画像化システムを組み合わせることにより、高スループット定量的細胞毒性分析は、複数の生物学的関連性環境内で達成することができる。
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Protocol
1.ターゲット細胞の調製
- 37°Cの時に（10％の熱不活性化ウシ胎児血清（FBS）、4nmのL-グルタミン、500 IU / mlペニシリン/ストレプトマイシンを、RPMI 1640培地）増殖培地中の標的細胞（ 例えば 、Raji細胞リンパ腫細胞）を維持5％CO 2インキュベーター中。
- 遠心分離機15ミリリットルチューブに標的細胞をペレット化するためのサンプル。遠心分離時間は、異なる細胞型によって変化する。 Raji細胞のための468×gで3分間遠心する。
- 最初の上清の表面に形成された気泡を吸引し、全上清を除去。
- チューブに10mlのPBSを追加します。再懸濁細胞塊を分割するには、上下に数回ソリューションをピペッティングすることにより細胞を。
- 遠心分離機468×gで3分間のサンプル。
- 上清の表面に形成された気泡を吸引し、全上清を除去。
細胞マイクロアレイの作製
- Obtain細胞付着の96ウェルプレートキットまたは単一セルアレイ8ウェルチャンバースライド（材料/試薬の表を参照）。
- キットからのDNA試薬にアクティベーターの1.2μlのを適用します。バイアルにキャップを、それを反転し、優しく溶液を混合する振る。
- ソリューションは、RTで20分間反応させる。
- （15mlチューブ中で）標的細胞ペレットを混合した溶液を塗布する。
- 500 nMの最終濃度緑色蛍光細胞質ゾル染料を追加します。
- オービタルシェーカー上でRTで30分間混合した溶液および色素で標的細胞をインキュベートする。
- 5mLのPBSで細胞を2回洗浄し、10mlの増殖培地中で細胞を再懸濁する。
- 各ウェルにステップ2.7から溶液100μlを適用します。血球計算盤を用いて細胞数を数える。細胞数はウェル当たり1×10 6の細胞に5×10 4の範囲であることを確認してください。
- RTでインキュベーションの10〜15分後、静かに200から30で二回のサンプルを洗う未結合の細胞を除去する0μlの増殖培地。
注：約5-10μlの増殖培地は、洗浄後に各ウェルに残っています。
3.全血細胞毒性アッセイ
- 各サンプルウェルにヒト全血180μlのを追加します。
- ミリリットル/ 5mgのに抗CD20抗体溶液を得、そして作るために連続希釈を行い50、20、10、5、2,1、1.5 mlチューブ中の抗CD20抗体溶液を0.5μg/ mlであった。よく三重を作る各サンプルに抗CD20抗体の各濃度の20μlのを追加します。
- 各ウェルに500 nMでの最終濃度でヨウ化プロピジウムを追加する。
- 16時間、5％CO 2、37℃で、得られたプレートをインキュベート。
- 画像スライドまたは8X倍率に自動撮像システム96ウェルプレート上の細胞。
- 結果を定量化するために自動撮像システムの細胞計数プログラムを使用します。
NOTE：自動撮像システムのソフトウェアは、単純な提供細胞計数のためのステップバイステップの操作。このソフトウェアを使用するプロトコルは、プロバイダのウェブサイトで見つけることができます。 - ソフトウェアのメインページから[レビュー結果]を選択します。
- [サンプルのために保存したファイル]を選択します。
- 最初のゲートは、FITCその後ゲートが強度> 20を意味TxRed、> 50強さを意味します。
- [プレートの概要]を選択します。
- [エクスポートテーブル]を選択します。
注：プログラムのパーセンテージ細胞殺傷式を以下に示す：
％の標的細胞の死滅=（緑と赤の両方の染色された細胞の数/細胞の＃は緑色に染色）* 100％
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Representative Results
抗CD20抗体およびリンパ腫細胞（Raji細胞およびMC / CAR）は、全血の細胞毒性アッセイ（WCA）7,8を実証するためのモデル系として選択した。 MC / CAR細胞がその膜上のCD20の低コピー数を有していたRaji細胞では、細胞表面上のCD20の高いコピー数を有していた。標的細胞は、最初に緑色蛍光細胞質色素で緑色に染色し、96ウェルプレート上に配列した。万 - 5万標的リンパ腫細胞を、各ウェル中に固定化した。新たに採取したヒト全血180μlを各ウェルに添加した。抗CD20抗体は、その後、濃度勾配を有する96ウェルプレートの各ウェルに添加した。 37℃でのインキュベーションの16時間後、細胞数を、緑色蛍光細胞および赤色蛍光細胞の数を分析することによって、自動撮像素子を介して定量的に評価した。標的リンパ腫細胞がすべて同じ焦点面に配列しているため、各細胞の蛍光もレモずに直接検出されたウェル内の血液細胞をヴィング。
図1に示すように、（生きている、死んだの両方）の標的のRajiリンパ腫細胞の検出を行った。 図1の緑色のドットが示され、標的細胞数を示した。彼らはPIで蛍光赤色に染色されたので、 図1における死細胞（赤い点）は、赤蛍光の強度を通じて定量的に分析した。抗体細胞毒性は（緑の点）提示細胞への死細胞の割合（両方緑と赤に染色）を介して分析した。抗CD20抗体の濃度は、濃度が低下したような蛍光赤色ドット数が減少した。
各抗体濃度は、三重に独立して試験した。各抗体濃度について、ウェル当たり400以上の標的細胞は、平均値および細胞毒性の結果の標準偏差を提供するために画像化した。 400データ点はPEで、我々のデータに基づくr個の抗体濃度は、p値<0.01で統計結果が得られた。用量依存性の薬物効率を図2に得られた。CD20抗原の低コピー数とMC / CAR細胞はコントロール細胞株として使用した。 0.12μgの/ mlのEC 50値は、補体依存性細胞傷害アッセイ（CDC）または抗体依存性細胞傷害性（を含む規則的な抗体の細胞毒性アッセイで得られた値との範囲内であったRajiリンパ腫細胞に対するWCA結果が得られたADCC）アッセイ。9-11
全血で測定された図1の抗体ベースの細胞毒性。Raji細胞は、緑色の細胞質色素で標識した後、固定化した。 PIは、細胞死にアクセスするために添加した。死細胞は、PIによって赤く染色した。様々なconcentrat抗CD20抗体のイオンは、全血を加えながら添加した。 （a）は、2.5 / mlの抗CD20抗体16時間後、（b）は、1μg/ mlの抗CD20抗体を16時間後に、後の（c）を0.5μg/ mlの抗CD20抗体で16時間、（d）は0.25μgの/ mlの抗CD20抗体を16時間後に、（e）は0.1 / mlの抗CD20抗体で16時間後、（f）は、0.05 / mlの抗CD20抗体で16時間後、（g）の2.5 / mlの16抗体をコントロール時間後。
図2.ヒト全血における異なる細胞株に対する用量依存性細胞傷害を。Raji細胞はCD20陽性リンパ腫細胞であり、MC / CARは、CD20陰性細胞株であった。全血細胞毒性のレベルは、α-CD20抗体（抗CD20抗体）の種々の濃度を示した。
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Discussion
WCAは、理想的にはそのようなCDCおよびADCCアッセイ9-11、などと前臨床動物試験の前に、伝統的なターゲットの上映の後に利用され、単一細胞の解像度12-16、を用いたin vitro抗がんスクリーニングツールにおいて重要である。現在、CDCまたはADCCアッセイの一次標的スクリーニングアッセイは、すべての単純化されたメディアまたは緩衝液系中で実施される。しかしながら、これらの簡略化緩衝系において有効性を示す薬剤候補は、常に、より複雑な全血系には有効でない。したがって、WCAは、従来のターゲットスクリーニングおよび高価な動物実験の間のギャップを埋める偽陽性を減らすため、動物実験やヒト臨床試験における予防可能な障害を防ぐことができる。 WCAは、ヒト全血の内容に薬効を試験するために、前臨床試験に取り組む研究者にとって有益であろう。フローサイトメトリーを使用して死んだと生細胞をカウントすると、赤血球CEの完全な溶解を必要とする標的細胞を検出するために、LLS。フローサイトメトリー上WCA技術の利点は、赤血球の溶解なしに標的細胞を同定することができることである。それは完全に血液試料中の全ての赤血球を溶解することが困難であり、標的細胞はまた、部分的に溶解手順中に溶解される。
スクリーニングパネルは、パーソナライズされた癌治療、所定の腫瘍内の細胞の不均一性を評価し、所定に耐性である細胞の同定への道を開く、個々の患者から得られた生きた初代細胞を使用して生成することができればさらにエキサイティングな機会が生じる薬物治療。あるアプローチに医療システムの移動」の予防と患者のニーズを中心にパーソナライズされた、予測は、「医学17,18の未来である。 FDAは、疾病管理センター、NIH、センターを含む米国保健社会福祉省内の多数のイニシアチブ、メディケアおよびメディケイド·サービス、および健康リソースとサービスの管理のためにパーソナライズされたケアを促進するためのイニシアチブをサポートするために存在する。オーダーメイド医療の実現には、関連する生物学的状態でそれらを維持しながら、任意のヒト細胞を捕捉して保持することができます信頼性の高い技術や製品に依存します。我々は、個別化医療用途のための彼/彼女の自身の血液のマトリックス中に、癌患者の腫瘍細胞に対する薬剤をスクリーニングするためにWCAを適用することを予見することができる。
プロトコルにおける重要なステップは、セルアレイの調製物である。ユーザーは、細胞洗浄工程の間に細胞を失うことなく、上清のすべてを除去する必要がある。また、ユーザは、液体がバイアル中に見ることができない場合、短い遠心分離を行う必要がある。 DNA試薬溶液を調製したら、それは30分以内に細胞と共に使用されなければならない。
セルアレイ形成効率は、細胞型に依存する。より多くのがありましたこのプロトコルで試験した細胞の100種類。しかし、いくつかの特定の細胞型を効率的にセルのアレイを形成しないことは可能である。無セルアレイフォームした場合、DNA試薬のより高い濃度は、より良いセルアレイ形成を得るために同じプロトコルを実行することをお勧めします。
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Disclosures
著者は、競合する経済的利益を持っていません。
Acknowledgments
我々は、この作品[R33 CA174616-01A1]を資金調達NIHから国立癌研究所のIMATプログラムに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell attachment 96 well plate kits | Adheren | AP9601 | |
| Suspension Single cell array 8 well chamber slide | Adheren | SS0801 | |
| Adherent Single cell array 8 well chamber slide | Adheren | SS0802 | |
| Lymphoma cell line CD20+ | ATCC | CCL-86 | Raji cells |
| Lymphoma cell line CD20- | ATCC | CRL-8083 | MC/CAR |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Life Technologies | 11875-119 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo | SH30070.01HI | |
| Peni/Strep | Life Technologies | 15070063 | |
| Cytosolic dye | Life Technologies | C7025 | Cell Tracker Green |
| Rituxan (Biosimilar) | Eureka Therapeutics | ||
| Human whole blood | Allcells | WB001 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-10MG | |
| Automatic imaging system | Molecular Devices | Contact Vendor | Cell Reporter |
| Cell counting program | Molecular Devices | Contact Vendor | Cell Reporter |
References
- Hutchinson, L., Kirk, R. High drug attrition rates--where are we going wrong. Nat Rev Clin Oncol. 8, 189-1890 (2011).
- Moreno, L., Pearson, A. D. Attrition rates be reduced in cancer drug discovery. Informa healthcare. 8, 363-368 (2013).
- Seok, J., et al. Inflammation and Host Response to Injury, Large Scale Collaborative Research Program. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3507-3512 (2013).
- Suntharalingam, G., et al. Cytokine storm in a phase 1 trial of the anti-CD28 monoclonal antibody TGN1412. N Engl J Med. 355, 1018-1028 (2006).
- Eastwood, D., et al. Monoclonal antibody TGN1412 trial failure explained by species differences in CD28 expression on CD4+ effector memory T-cells. Br J Pharmacol. 161, 512-526 (2010).
- Hsiao, S. C., Liu, H., Holstlaw, T. A., Liu, C., Francis, C. Y., Francis, M. B. Real time assays for quantifying cytotoxicity with single cell resolution. PLoS One. 8, 10-1371 (2013).
- Wang, S. Y., Weiner, G. Rituximab: a review of its use in non-Hodgkin’s lymphoma and chronic lymphocytic leukemia. Expert Opin Biol Ther. 8, (2008).
- Dalle, S., Thieblemont, C., Thomas, L., Dumontet, C.
- Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14, 181-196 (1968).
- Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. J Immunol Methods. 64, (1983).
- Gerlier, D., Thomasset, N. J. Use of MTT colorimetric assay to measure cell activation. Immunol Methods. 94, 57-63 (1986).
- Toriello, N. M., et al. Integrated microfluidic bioprocessor for single-cell gene expression analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (2008).
- Douglas, E. S., Hsiao, S. C., Onoe, H., Bertozzi, C. R., Francis, M. B., Mathies, R. A. DNA-barcode directed capture and electrochemical metabolic analysis of single mammalian cells on a microelectrode array. Lab on a Chip. 9, 2010-2015 (2008).
- Mayr, L. M., Bojanic, D.
- Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends in Biotechnology. 28, 237-245 (2010).
- Coelho, J., P, L., Quinn, S., Murphy, R. F. Automated image analysis for high-content screening and analysis. J Biomol Screen. 15, 726-734 (2010).
- Sundberg, S. A. High-throughput and ultra-high-throughput screening: solution- and cell-based approaches. Current Opinion in Biotechnology. 11, 47 (2000).
- Simmons, L. A. Personalized medicine is more than genomic medicine: confusion over terminology impedes progress towards personalized healthcare. PERS MED. 9, 85 (2012).
