Summary
Hela blod cytotoxicitetsanalys (WCA) är en cytotoxicitetsanalys utvecklats genom att införliva hög genomströmning cell positionering teknik med fluorescensmikroskopi och automatiserad bildbehandling. Här beskriver vi hur lymfomceller behandlade med en anti-CD20-antikropp kan analyseras i realtid i humant helblod för att tillhandahålla kvantitativ cellulär cytotoxicitet analys.
Abstract
En live cellbaserade helblod cytotoxicitetsanalys (WCA) som ger tillgång till temporal uppgifter av den totala cellcytotoxicitet utvecklas med hög genomströmning cellpositioneringsteknik. De riktade tumörcellpopulationer först förprogrammerad att immobilisering i en array format och märkta med gröna fluorescerande cytosoliska färgämnen. Efter cellanordningen bildningen är antikroppsläkemedel läggs i kombination med humant helblod. Propidiumjodid (PI) tillsätts sedan för att bedöma celldöd. Cellanordningen analyseras med ett automatiskt bildsystem. Medan cytosoliskt färgämne etiketter riktade tumörcellpopulationer, PI märker de döda tumörcellpopulationer. Sålunda kan den procentuella andelen av mål-cancercelldödande kvantifieras genom beräkning av antalet överlevande målsökta cellerna till antalet döda målceller. Med denna metod, forskare kan få tillgång till tidsberoende och dosberoende cellcytotoxicitet information. Anmärkningsvärt, inget farligt radiokemikalier används. Den WCA presenteras här har testats med lymfom, leukemi och solida tumörcellinjer. Därför låter WCA forskare för att bedöma läkemedlets effektivitet i en mycket relevant ex vivo skick.
Introduction
De senaste framstegen inom läkemedelsindustrin har lett till ett ökat intresse för att uppnå de särskilda identifiering av tumörcellsantikroppar och anpassade cancerbehandlingar; dock flera hinder påträffas i processen. Endast 5% av medel som har anticanceraktivitet i preklinisk utveckling är licensierade efter att ha visat tillräcklig effekt i fas II-III-testning 1,2. De prekliniska strategier (både in vitro och in vivo) är suboptimala så många exempel har visat att antitumörläkemedel beter sig annorlunda i mänskligt och hos försöksdjur huvudsakligen på grund av deras olika blodkomponenter 3-5.
För att möta behovet av en antitumör drug screening plattform och för att ge en check-point innan kostsamma djurförsök och kliniska prövningar, är ett humant helblod cytotoxicitetsanalys (WCA) som föreslås för utvärdering antitumör läkemedlets effektivitet på ett mer relevant biologisk miljö. Denhelblod cytotoxicitetsanalys kan användas för att utvärdera svaret av individuella celler till antikroppar och andra läkemedelskandidater i humant helblod.
Den WCA utvecklas genom att införliva hög genomströmning cell positioneringsteknik med hög genomströmning och hög halt avbildning 6. Genom att använda ett automatiserat avbildningssystem kan antalet av både levande och döda celler bestämmas med en hög grad av precision. På grund av det faktum att målceller immobiliseras på samma fokalplan, är WCA kunna tillhandahålla kvantitativ cytotoxicitet analys i realtid utan att avlägsna röda blodkroppar. Dessutom ger det automatiska avbildningssystemet flera fördelar såsom att endast målceller som nått de angivna kriterier (t.ex.., Fluorescerande celler och cell morfologi) är gated och bearbetas. Dessutom möjliggör det framställning av 144 plattor per dag. Följaktligen här bildkapacitet och genomströmning möjliggör körning av high-cINNEHÅLL och hög kapacitet experiment samtidigt. Genom att kombinera WCA och automatiserade bildsystemet, kan hög genomströmning kvantitativ cellcytotoxicitet analys uppnås inom en mer biologiskt relevant miljö.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mål Cell Förberedelse
- Upprätthålla målceller (t.ex.. Raji lymfomceller) i tillväxtmedium (RPMI 1640 odlingsmedium med 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS), 4 nM L-glutamin, och 500 lU / ml penicillin / streptomycin) vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator.
- Centrifugera provet för pelletering av målceller i en 15 ml tub. Centrifugeringstiden varierar med olika celltyper; centrifugera i 3 min vid 468 xg under Raji celler.
- Först aspirera eventuella bubblor som bildas på ytan på den flytande, och ta bort hela supernatanten.
- Tillsätt 10 ml PBS till röret. Återuppslamma cellerna genom att pipettera lösningen upp och ner flera gånger för att bryta upp cell klump.
- Centrifugera provet för 3 min vid 468 x g.
- Aspirera eventuella bubblor som bildas på ytan på den flytande, och ta bort hela supernatanten.
2. Beredning av cellarrayer
- Obtain fästcell 96 och plattsatser eller enstaka cell array 8 samt kammar diabilder (se tabell över material / reagenser).
- Applicera 1,2 ul av aktivator till DNA-reagenset ur satsen. Cap flaskan, vänd den och försiktigt skaka för att blanda lösningen.
- Låt lösningen reagera under 20 min vid RT.
- Applicera den blandade lösningen till målceller pellet (i 15 ml rör).
- Lägg gröna fluorescens cytosoliska färgämnen vid en slutlig koncentration av 500 nM.
- Inkubera målcellerna med den blandade lösningen och färgämnet för 30 min vid RT på en orbital skakanordning.
- Tvätta cellerna två gånger med 5 ml PBS och återsuspendera cellerna i 10 ml tillväxtmedium.
- Applicera 100 ìl av lösningen från steg 2,7 till varje brunn. Räkna antalet celler med hjälp av en hemacytometer. Se till cell nummer varierar mellan 5 x 4-01 oktober x 10 6 celler per brunn.
- Efter 10-15 minuters inkubering vid RT, försiktigt tvätta proverna två gånger med 200 till 300 il tillväxtmedier för att avlägsna eventuella obundna celler.
OBS: Om 5-10 ul tillväxtmedier kvar i varje brunn efter tvätt.
3. helblod cytotoxicitetsanalyser
- Lägg 180 pl humant helblod till varje provbrunn.
- Erhålla anti-CD20-antikropp-lösning vid 5 mg / ml, och utför serieutspädning för att göra 50, 20, 10, 5, 2, 1, 0,5 | ig / ml av anti-CD20-antikropp-lösning i 1,5 ml rör. Tillsätt 20 ìl av varje koncentration av anti-CD20-antikropp till varje prov väl göra tre exemplar.
- Lägg Propidiumjodid vid en slutlig koncentration av 500 nM till varje brunn.
- Inkubera den resulterande plattan vid 37 ° C med 5% CO2 under 16 h.
- Bild cellerna på bilderna eller 96 brunnar med automatisk bildsystem med 8X förstoring.
- Använder cellräkningsprogrammet av den automatiska bildsystem för att kvantifiera resultaten.
OBS: Programvaran i det automatiska bildsystem ger enkelsteg-för-steg-operationer för cellräkning. Protokollet för att använda denna programvara finns på operatörens webbplats. - Välj [Review Resultat] från huvudsidan av programvaran.
- Välj [File Saved för proven].
- Första porten FITC medelintensitet> 50, då grinden TxRed medelintensitet> 20.
- Välj [Plate Översikt].
- Välj [Export Tables].
OBS: Den procentuella celldödande formel av programmet visas nedan:
% Mål celldöd = (# av celler som färgats både grön och röd / # av celler färgas grön) * 100%
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anti-CD20-antikroppar och lymfomceller (Raji-celler och MC / CAR) valdes som ett modellsystem för att demonstrera helblod cytotoxicitetsanalys (WCA) 7,8. Raji-celler hade högt kopietal av CD20 på cellytan, medan MC / CAR-celler hade lågt kopietal av CD20 på deras membran. Målinriktade cellerna först färgades gröna med grön fluorescens cytosoliska färgämnen och uppradade på 96-brunnar. 10.000 - 50.000 mål- lymfomceller immobiliserades i varje brunn. 180 | il av nytaget humant helblod tillsattes till varje brunn. Anti-CD20-antikropp tillsattes sedan i varje brunn i en 96-brunnsplatta med lutning koncentrationer. Efter 16 timmars inkubering vid 37 ° C, var cell nummer bedömdes kvantitativt genom automatisk kameran genom att analysera antalet gröna fluorescerande celler och fluorescerande röda celler. Eftersom målet lymfomceller var alla klädd i samma fokalplan ades fluorescensen hos varje cell detekteras direkt även utan removing blodcellerna i brunnen.
Som visas i figur 1, var upptäckten av de riktade Raji lymfomceller (både levande och döda) utförs. Gröna prickar i figur 1 visade antalet målceller presenteras. Döda celler (röda prickar) i figur 1 analyserades kvantitativt genom intensiteten i det röda fluorescens eftersom de färgades fluorescerande röd med PI. Antikropps cytotoxicitet analyserades genom förhållandet av döda celler (målat både grön och röd) till cellerna som presenteras (gröna punkter). Antalet fluorescerande röda prickar minskade när koncentrationen av anti-CD20-antikropp minskas i koncentration.
Varje antikroppskoncentrationen testades oberoende av varandra i tre exemplar. För varje antikroppskoncentration, var mer än 400 målceller per brunn avbildas för att ge medelvärdet och standardavvikelsen för cytotoxicitet resultat. Baserat på våra data, med 400 datapunkter per antikroppskoncentration, vi erhållits statistiska resultat med p-värde <0,01. Den dosberoende drogeffektivitet erhölls i figur 2. MC / CAR-celler med lågt kopietal av CD20-antigenet användes som en kontroll-cellinje. Ett EC50 värde på 0,12 g / ml erhölls för WCA resultat mot Raji lymfomceller, som var i området med det värde som erhålls i de regelbundna antikropps cytotoxicitetsanalyser inklusive komplementberoende cytotoxicitetsanalys (CDC) eller antikroppsberoende cellulär cytotoxicitet ( ADCC) analys. 9-11
Figur 1. Antikroppsbaserade cytotoxicitet mäts i helblod. Raji-celler märktes med en grön cytosoliskt färgämne och därefter immobiliseras. PI tillsattes också för att få tillgång till celldöd. Döda celler färgades röd av PI. Varierande Koncentratjoner av anti-CD20-antikropp tillsattes med tillsats av helblod. (A) 2,5 pg / ml anti-CD20-antikropp 16 h efter, (b) 1 | ig / ml anti-CD20-antikropp 16 h efter, (c) 0,5 pg / ml anti-CD20-antikropp 16 h efter, (d) 0,25 ^ g / ml anti-CD20-antikropp 16 h efter, (e) 0,1 pg / ml anti-CD20-antikropp 16 h efter, (f) 0,05 | ig / ml anti-CD20-antikropp 16 h efter, (g) 2,5 pg / ml kontroll-antikropp 16 h efter.
Figur 2. Dosberoende cytotoxicitet mot olika cellinjer i humant helblod. Raji var en CD20 positiva lymfomceller, och MC / bil var en CD20 negativ cellinjer. Nivån av helblod cytotoxicitet visades för annan koncentration av α-CD20-antikropp (anti-CD20-antikropp).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
WCA är en kritisk in vitro anti-cancerscreeningmetod med en enda cell upplösning 12-16, helst utnyttjas efter traditionella målgrupp filmvisningar såsom CDC och ADCC-analyser 9-11, och före prekliniska djurförsök. För närvarande är primära målgruppscreeninganalyser såsom CDC eller ADCC analyser allt utfört i en förenklad media eller ett buffertsystem. Emellertid drogkandidater som visar effekten i dessa förenklade buffertsystem är inte alltid effektiva i den mer komplexa hela blodsystemet. Därför kan WCA brygga klyftan mellan traditionella målgrupp filmvisningar och kostsamma djurstudier, minska falska positiva, och på så sätt förhindra att de kan förebyggas misslyckanden i djurförsök eller i kliniska prövningar. Den WCA kommer att gynna de forskare som arbetar med de prekliniska studier för att testa läkemedlets effektivitet i innehållet i humant helblod. Räkna de döda och levande celler med hjälp av flödescytometri kräver fullständig lys av röda blod cells i syfte att detektera målceller. Fördelen med WCA teknik över flödescytometri är att den kan identifiera målceller utan lys av röda blodkroppar. Det är svårt att fullständigt lysera alla de röda blodkropparna i blodprovet, och målceller är även delvis lyseras under lys förfarandet.
Ännu mer spännande möjligheter uppstår om screening paneler kan skapas med hjälp av de levande primära celler som erhållits från enskilda patienter, vilket banar väg för personliga cancerbehandlingar, utvärdering av cell heterogenitet inom en given tumör, och identifiering av celler som är resistenta mot en viss läkemedelsbehandling. Flytta sjukvården till ett synsätt som är "personligt, förutsägande, förebyggande och inriktas på behoven hos patienten" är framtiden för medicinen 17,18. Många initiativ inom US Department of Health och Human Services, inklusive FDA, Centers for Disease Control, NIH, Centersför Medicare och Medicaid Services, och Världshälsoresurser och Services Administration finns för att stödja initiativ för att främja personlig vård. Förverkligandet av personlig medicin beror på tillförlitlig teknik och produkter som kan fånga och hålla alla mänskliga celler samtidigt behålla dem på ett relevant biologiskt tillstånd. Vi kan förutse att tillämpa WCA att screena läkemedel mot cancer patients tumörceller i matrisen av hans / hennes eget blod för personlig medicin applikationer.
De kritiska steg i protokollet är förberedelserna i cellanordningen. Användarna måste ta bort alla supernatanten utan att förlora cellerna under celltvättsteg. Dessutom användarna behöver göra en kort centrifugering om vätskan inte syns i flaskorna. När DNA-reagenslösningen har upprättats, ska den användas med cellerna inom 30 min.
Cell array bildning effektiviteten är celltyp beroende. Det har varit mer än100 typer av celler som testats med detta protokoll; emellertid är det fortfarande möjligt att vissa specifika celltyper som inte kommer att bilda cellanordningen effektivt. Om inga cellgruppformer, är en högre koncentration av DNA-reagens rekommenderas att utföra samma protokoll för att få bättre cell array bildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar National Cancer Institute IMAT programmet från NIH för finansieringen av denna verk [R33 CA174616-01A1].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell attachment 96 well plate kits | Adheren | AP9601 | |
| Suspension Single cell array 8 well chamber slide | Adheren | SS0801 | |
| Adherent Single cell array 8 well chamber slide | Adheren | SS0802 | |
| Lymphoma cell line CD20+ | ATCC | CCL-86 | Raji cells |
| Lymphoma cell line CD20- | ATCC | CRL-8083 | MC/CAR |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Life Technologies | 11875-119 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo | SH30070.01HI | |
| Peni/Strep | Life Technologies | 15070063 | |
| Cytosolic dye | Life Technologies | C7025 | Cell Tracker Green |
| Rituxan (Biosimilar) | Eureka Therapeutics | ||
| Human whole blood | Allcells | WB001 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-10MG | |
| Automatic imaging system | Molecular Devices | Contact Vendor | Cell Reporter |
| Cell counting program | Molecular Devices | Contact Vendor | Cell Reporter |
References
- Hutchinson, L., Kirk, R. High drug attrition rates--where are we going wrong. Nat Rev Clin Oncol. 8, 189-1890 (2011).
- Moreno, L., Pearson, A. D. Attrition rates be reduced in cancer drug discovery. Informa healthcare. 8, 363-368 (2013).
- Seok, J., et al. Inflammation and Host Response to Injury, Large Scale Collaborative Research Program. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3507-3512 (2013).
- Suntharalingam, G., et al. Cytokine storm in a phase 1 trial of the anti-CD28 monoclonal antibody TGN1412. N Engl J Med. 355, 1018-1028 (2006).
- Eastwood, D., et al. Monoclonal antibody TGN1412 trial failure explained by species differences in CD28 expression on CD4+ effector memory T-cells. Br J Pharmacol. 161, 512-526 (2010).
- Hsiao, S. C., Liu, H., Holstlaw, T. A., Liu, C., Francis, C. Y., Francis, M. B. Real time assays for quantifying cytotoxicity with single cell resolution. PLoS One. 8, 10-1371 (2013).
- Wang, S. Y., Weiner, G. Rituximab: a review of its use in non-Hodgkin’s lymphoma and chronic lymphocytic leukemia. Expert Opin Biol Ther. 8, (2008).
- Dalle, S., Thieblemont, C., Thomas, L., Dumontet, C. Monoclonal antibodies in clinical oncology. Anticancer Agents Med Chem. 8, 523-532 (2008).
- Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14, 181-196 (1968).
- Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. J Immunol Methods. 64, (1983).
- Gerlier, D., Thomasset, N. J. Use of MTT colorimetric assay to measure cell activation. Immunol Methods. 94, 57-63 (1986).
- Toriello, N. M., et al. Integrated microfluidic bioprocessor for single-cell gene expression analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (2008).
- Douglas, E. S., Hsiao, S. C., Onoe, H., Bertozzi, C. R., Francis, M. B., Mathies, R. A. DNA-barcode directed capture and electrochemical metabolic analysis of single mammalian cells on a microelectrode array. Lab on a Chip. 9, 2010-2015 (2008).
- Mayr, L. M., Bojanic, D. Novel trends in high-throughput screening. Current opinion in pharmacology. 9, 580 (2009).
- Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends in Biotechnology. 28, 237-245 (2010).
- Coelho, J., P, L., Quinn, S., Murphy, R. F. Automated image analysis for high-content screening and analysis. J Biomol Screen. 15, 726-734 (2010).
- Sundberg, S. A. High-throughput and ultra-high-throughput screening: solution- and cell-based approaches. Current Opinion in Biotechnology. 11, 47 (2000).
- Simmons, L. A. Personalized medicine is more than genomic medicine: confusion over terminology impedes progress towards personalized healthcare. PERS MED. 9, 85 (2012).
