Summary
كاليفورنيا 2+ إشارات تنظم العمليات البيولوجية المختلفة في النباتات. هنا نقدم النهج لرصد يسببها الإجهاد اللاحيوي الكالسيوم المكاني والزماني 2+ الإشارات في الخلايا والأنسجة باستخدام المشفرة وراثيا الكالسيوم 2+ مؤشرات Aequorin أو Case12 نبات الأرابيدوبسيس.
Abstract
العظة الإنمائية والبيئية تحفز الكالسيوم 2+ التقلبات في الخلايا النباتية. ومست المكانية والزمانية الكالسيوم 2+ أنماط التحفيز محددة من الكالسيوم 2+ ملزم البروتينات الخلوية التي تبدأ الكالسيوم 2+ يشير شلالات. ومع ذلك، ما زلنا لا نعرف إلا القليل حول كيفية التحفيز تتولد إشارات الكالسيوم معين 2+. ويمكن أن يعزى خصوصية إشارة الكالسيوم 2+ لتنظيم متطورة لأنشطة قنوات الكالسيوم 2+ و / أو الناقلين في استجابة لحافز معين. لتحديد هذه المكونات الخلوية وفهم وظائفها، لا بد من استخدام الأنظمة التي تسمح تسجيل حساسة وقوية من إشارات الكالسيوم 2+ في كل من الأنسجة الخلوية والمستويات. وقد وفرت المشفرة وراثيا الكالسيوم 2+ المؤشرات التي تستهدف مقصورات الخلوية المختلفة منبرا للخلية الحية التصوير متحد البؤر الخلوية من الكالسيوم 2+ الإشارات. نحن هنا وصف التعليمق لاستخدام اثنين من الكالسيوم 2+ أنظمة الكشف: aequorin FAS (فيلم الشتلات لاصق) التلألؤ الكالسيوم 2+ التصوير وcase12 استنادا الخلية الحية متحد البؤر مضان الكالسيوم 2+ التصوير القائم. التصوير التلألؤ باستخدام نظام FAS يوفر الكشف بسيطة وقوية وحساسة من المكانية والزمانية الكالسيوم 2+ إشارات على مستوى الأنسجة، في حين أن الخلية الحية التصوير متحد البؤر باستخدام Case12 يتيح الكشف المتزامن للعصاري خلوي والكالسيوم النووية 2+ إشارات بدقة عالية.
Introduction
في الخلية النباتية وتستجيب للبيئة عن طريق الإشارات التي تنسق أعمال الخلية. خلية مبكرة يشير الحدث في الاستجابة للمؤثرات البيئية هي عابرة زيادة الكالسيوم 2+. يتميز نمط، أو التوقيع على زيادة عابرة في حر تركيز الكالسيوم في 2+ من السعة، والتردد، والمدة. المكانية والزمانية التوقيعات الكالسيوم 2+ متميزة تنظم الأنشطة الخلوية المختلفة 1. محفزات معينة، مثل الحرارة والبرودة، والملح، والجفاف، والضوء، أو الهرمونات النباتية، قد صقل النشاط المكانية والزمانية من المترجمة الغشاء قنوات الكالسيوم 2+ و / أو النقل، مما أدى محددة كا 2+ التوقيعات. على الرغم من الكالسيوم 2+ النقل اتسمت أيضا، لا يعرف إلا القليل عن الهويات الجزيئية وظائف قنوات الكالسيوم 2+ في النباتات 1. شاشات الجينية للالمسوخ مع تغيير كا 2+ ردا على التأكيد على المحفزات قد تكون فعالة approach لتحديد المكونات التي تؤلف التوقيعات الكالسيوم 2+. وقد وضعت كا 2+ أنظمة الكشف مؤخرا العديد Aequorin استنادا التي تسهل شاشات الجينية للكا 2+ يشير مكونات ردا على مهاجمة مسببات الأمراض والإجهاد اللاحيوي 2-4.
وقد استخدم Aequorin أول من كشف الكالسيوم 2+ إشارات في النباتات في وقت مبكر 1990s 5. منذ ذلك الحين، تم استهداف Aequorin إلى مقصورات الخلوية المختلفة، مثل السيتوبلازم 5، نواة 6، 7 البلاستيدات الخضراء، tonoplast 8، 9 الميتوكوندريا، و10 سدى، فضلا عن أنواع مختلفة من الخلايا في جذر لمراقبة خلية معينة كا 2 + إشارات 11. تكشف القياسات الكالسيوم Aequorin استنادا 2+ والمكانية والزمانية الكالسيوم 2+ استجابة من مجموعة من الخلايا التأكيد على المحفزات. ومع ذلك، في معظم الحالات، ردود 2+ الكالسيوم من الخلايا واحدة هي unsynchroniزيد في الأنسجة الاستجابة 4. لذا، وتسجيل Aequorin الكالسيوم 2+ لا تفيد بالضرورة إشارة 2+ الكالسيوم في الخلايا الفردية. في السنوات الأخيرة، المشفرة وراثيا بروتين فلوري (FP) القائم على الكالسيوم 2+ المؤشرات، مثل كمليون الأصفر (YCS) 12 و 13 CASEs12 استخدمت لدراسة كا 2+ يشير لقرار التحت خلوية عالية. YCS هي مضان نقل الطاقة الرنين (الحنق) القائم على الكالسيوم 2+ المؤشرات، التي تحتوي على CFP YFP والمتغيرات التي ترتبط كا 2+ -binding كالمودولين البروتين والببتيد كالمودولين ملزم M13. كالمودولين تخضع لعملية تغيير متعلق بتكوين جزئي كما يرتبط الكالسيوم 2+، مما يجلب CFP YFP وأقرب معا، مما يؤدي إلى زيادة نقل الطاقة (تعزيز الحنق). مستوى الحنق على مر الزمن، وتحسب تقريبا كنسبة من YFP إلى CFP شدة إشارة، يعكس الكالسيوم داخل الخلايا 2+ ديناميات. وقد استخدمت العديد من إصدارات البطاقة الصفراء في النباتات. كان YC3.6 رargeted إلى العصارة الخلوية 14،15، 16 النواة، الميتوكوندريا 17، وغشاء البلازما 18، وYC4.6 وD4ER استهدفت ER إلى 15،19، واستهدف D3cpv إلى peroxisomes 20. النباتات المعدلة وراثيا معربا عن YCS تسمح التصوير الخلية الحية من الكالسيوم 2+ ديناميات داخل مقصورات الخلوية المختلفة من أنواع مختلفة من الخلايا. الحالات (ويفترض الكالسيوم lcium حد ذاته nsor) هي بروتينات واحدة دائري مبدل الفلورسنت (cpFPs) بايواء وكالمودولين ملزم كالمودولين الببتيد M13. على الربط إلى الكالسيوم 2+، وحالات تخضع التغييرات متعلق بتكوين، مما يؤدي إلى زيادة كثافة مضان. العلاقة بين استجابة مضان كيس والكالسيوم تركيز الكالسيوم داخل الخلايا 2+ يسمح 2+ ديناميات المراد قياسها كميا. البديل Case12 تمت زيادة 12 أضعاف في مضان أشكال -saturated الكالسيوم 2+. N. النباتات benthiminana عابر EXPRاستخدمت essing Case12 أو النباتات نبات الأرابيدوبسيس التعبير عن ثابت 12 حالة لدراسة كا 2+ الإشارات في الدفاع والضغط 4،21 أحيائية. وقد كشف غير المتزامن الكالسيوم المكاني والزماني 2+ التذبذبات في خلايا الاستجابة للهجوم الممرض، أو للإجهاد الجفاف مع Case12 مقرها كاليفورنيا 2+ التصوير.
هنا، نقدم تعليمات مفصلة لAequorin التصوير التلألؤ على أساس من نسيجيا والمحفزات محدد الكالسيوم 2+ ديناميكية في شتلات نبات الأرابيدوبسيس، والتصوير متحد البؤر من عصاري خلوي والكالسيوم النووي 2+ ديناميكية في الخلايا الجذرية نبات الأرابيدوبسيس التي تعبر عن حالة 12. التلألؤ التصوير FAS يمكن تكييفها لتحليل الإجهاد الناجم عن الكالسيوم 2+ ديناميكية في النباتات أو الأنسجة غير الوارد وصفها هنا سليمة، أو لفحص mutagenized السكان نبات نبات الأرابيدوبسيس لالمسوخ مع الإجهاد الناجم غيرت الكالسيوم 2+ الإشارات. يمكن أن تتكيف الخلية الحية الكالسيوم 2+ الإعداد التصوير لتحليل الكالسيوم2+ ديناميات داخل مقصورات subcelluar مختلفة أو في أنواع مختلفة من الخلايا الأخرى باستخدام المؤشرات الكالسيوم 2+.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Aequorin القائم على الكالسيوم 2+ التصوير باستخدام نظام FAS
- إعداد الشتلات للتصوير التلألؤ. تعقيم البذور من النباتات نبات الأرابيدوبسيس معربا عن Aequorin مع 10٪ محلول التبييض التي تحتوي على 0.01٪ تريتون-100. زرع بذور معقمة على طبق مربع (10 × 10 سم مربع طبق بيتري مع الشبكة،) التي تحتوي على كامل قوتها MS (Murashige وسكوغ بصل خليط الملح)، 1٪ سكروز، و 1.2٪ أجار. مكان وحات عموديا في غرفة النمو بعد التقسيم الطبقي في 4 درجة مئوية لمدة 2 يوم (الشكل 1A).
- نقل الشتلات على فيلم. وضع الفيلم لاصقة (الشكل 1B) في الجزء العلوي من 7-10 يوم الشتلات القديمة المتزايد على اللوحة. دفع بلطف الفيلم باليد للتأكد من أن الشتلات تلتزم فيلم (الشكل 1C). قشر الفيلم بلطف بحيث تظل شتلات انضمت إلى فيلم (الشكل 1D و1E)
- احتضان الشتلات مع العامل المساعد. وضع لالشتلات dhered على لوحة مربعة (10 × 10 سم) تحتوي على 15 مل من 2 ميكروغرام / مل ح CTZ (coelenterazine) في الماء. احتضان الشتلات في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 ساعة ليلة وضحاها (الشكل 1F).
- التحضير لتصوير التلألؤ. أخذ الفيلم من الحل H-CTZ وقطع عليه في منتصف أسفل، وتشكيل قطعتين. وضع كل قطعة من الفيلم مع الشتلات في مواجهة اثنين من لوحات مختلفة. ترك لوحات في الظلام لمدة 5 دقائق.
- الحصول على صور التلألؤ. في الظلام، ووضع لوحات اثنين بجانب بعضها البعض على الساحة من نظام التصوير التلألؤ (الشكل 1G). الحصول على صور فور بإضافة 20 مل من محلول محفزات لوحات في نفس الوقت.
- تحليل الصور التلألؤ. اختيار نفس النطاق لعرض جميع الصور التلألؤ. المحاصيل في المنطقة ذات الاهتمام (ROI) وتوليد الصور وملفات JPEG (الشكل 2A). بدلا من ذلك، تصدير الصور كما SPE شكل ملفات واستيرادها إلىيماغيج تحليل الصور البرمجيات. مجموعة القياسات لحساب قيمة الرمادية متوسط العائد على الاستثمار. حدد نفس حجم منطقة العائد على الاستثمار وقياس متوسط البيانات الرمادية والحاضر والرسوم البيانية (الشكل 2B).
2. الخلية الحية متحد البؤر كا 2+ التصوير
- إعداد الشتلات للتصوير متحد البؤر. تعقيم البذور من النباتات نبات الأرابيدوبسيس معربا عن case12 مع 10٪ محلول التبييض التي تحتوي على 0.01٪ تريتون. زرع بذور معقمة على لوحة تحتوي على أملاح MS قوة بالدوام الكامل، 1٪ سكروز، و 1.2٪ أجار. مكان وحات عموديا في غرفة النمو بعد التقسيم الطبقي في 4 درجة مئوية لمدة 2 ايام.
- غرف التصوير الإعداد
- تجميع لغرفة التصوير باستخدام الشرائح وساترة (الغرفة A). وضع قطعة من القطن والصوف غارقة في المياه على منتصف الشريحة. ثم نقل واحد أو اثنين الشتلات القديمة 5 أيام من لوحة على الجزء العلوي من المياه غارقة القطن والصوف. عصا قطع صغيرة من الطين إلى كل ركن من ساترة، ود مكان ساترة على الجزء العلوي من الشتلات لخلق فجوة (غرفة) بين ساترة والشريحة (الشكل 3A، اللوحة اليسرى). قم بتوصيل أحد طرفي الأنبوب البولي ايثيلين (0.58 مم) لحقنة 1 مل ووضع الطرف الآخر من الأنبوب المجاور على الفور إلى غرفة. عقد الأنابيب في مكان مع الشريط (الشكل 3A، اللوحة اليمنى).
- تجميع لغرفة التصوير باستخدام غرفة شبكي (الغرفة B).
- نشر طبقة رقيقة من السيليكون الشحوم حول اثنين من أنابيب البولي ايثيلين (0.58 مم) واضغط على الأنابيب المغلفة في القنوات على كل جانب من الغرفة شبكي (الشكل 3B يسار لوحة). نشر طبقة رقيقة من السيليكون الشحوم على سطح الغرفة التي تحتوي على الأخاديد أنبوب واضغط ساترة في الشحوم لاغلاق جانب واحد من افتتاح غرفة (قطع).
- نقل الشتلات من العمر خمسة أيام من لوحة في غرفة ووضع قطعة من القطن والصوف المنقوع مع الماء على س الأعلىو الشتلات. نشر سيليكون الشحوم على سطح الآخر من الغرفة، ثم اضغط ساترة آخر على رأس لختم. ربط نهاية واحدة من أنابيب إلى حقنة 1 مل. ترك نهاية الأنبوب الآخر المفتوحة (الشكل 3B اللوحة اليمنى).
- إعداد غرفة التصوير باستخدام غطاء زجاجي غرف (الغرفة C). تعقيم الزجاج غطاء غرف مع الايثانول 70٪ وترك الأمر على غطاء محرك السيارة حتى تجف. إضافة 0.6 مل أو 0.2 مل من كامل قوتها MS المتوسطة تحتوي على 1٪ سكروز و 0.5٪ phytagel في كل بئر من غرفة 2 جيدا أو الغرفة 8 جيدا (الشكل 3C اللوحة اليمنى)، على التوالي. تعقيم البذور وزرع بذور مباشرة في كوب غطاء غرف تحتوي على طبقة رقيقة من الجل واضحا والسماح لهم تنمو عموديا لمدة 5 أيام (الشكل 3C).
- الحصول على صور باستخدام مجهر متحد البؤر. لتطبيق محفزات الإجهاد، مثل الملح والبرد أو بيروكسيد، وضخ ببطء حوالي 200 ميكرولتر من 150 ملي كلوريد الصوديوم، والجليد كولونيلد الماء أو 1 ملم H 2 O 2 حل في غرفة (غرفة A أو B) قبيل الحصول على الصور أو إضافة بلطف 500 ميكرولتر أو 100 ميكرولتر من الحل حافزا لبئر غرفة 2- أو 8 جيدا، على التوالي . التقاط الصور على الفور بعد تطبيق الحل التحفيز باستخدام مقلوب مبائر نيكون A1R الليزر المسح الضوئي المجهر مع عدسة الغمر بالماء 20X (الفتحة العددية 0.75). جمع سلسلة زمنية من الصور في 4 فترات ثانية مع الإثارة وانبعاث موجات من 488 نانومتر و 500 حتي 550 نانومتر، على التوالي، وبدرجة وضوح 512 بكسل x 512.
- تحليل صورة
باستخدام عناصر نيكون، ووضعت رويس حول كل خلية (أو منطقة) من الفائدة. تم قياس كثافة الإجمالية داخل كل ROI مع مرور الوقت باستخدام مربع الحوار وقت القياس (يماغيج يمكن أن تستخدم بدلا من ذلك). تم تصدير مجموع قياسات كثافة ومعالجتها في DataGraph. تم تعريف كاليفورنيا 2+ ارتفاع السعة كما ذروة كثافة ناقص يستريح كثافة ومدة والعشرينالساعة الإلكترونية بين البدء والانتهاء من السنبلة، وفترة والفاصل الزمني بين قمم ارتفاع المجاورة اثنين من المسامير تي استخدمت -test لمقارنة الوسائل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
استخدمت مانيتول، كلوريد الصوديوم وH 2 O 2 كوكلاء للجفاف والملح والاكسدة المحفزات، على التوالي. للتحقق مما إذا أيون المعادن الثقيلة النحاس 2+ تنسجم مع أي من هذه المحفزات الإجهاد الثلاثة، قارنا الكالسيوم 2+ استجابة لكل المثيرات في وجود أو عدم وجود النحاس 2+. كما هو مبين في الشكل 2، وكشف FAS التصوير التلألؤ أن الشتلات Arabidoposis استجابت بشكل مختلف للجفاف والملح والاكسدة. للتركيز المنبهات درسنا في هذه الدراسة، التي يسببها 75 مم كلوريد الصوديوم أقوى الكالسيوم 2+ استجابة في الأوراق والجذور خلال 40 ثانية الأولى من التعرض (الشكل 2A وحة المتوسطة والشكل 2B)، في حين أن 1 ملم H 2 O 2 يسببها والكالسيوم 2+ استجابة قوية سواء في الأوراق والجذور خلال الأول والثاني 40 ثانية (الشكل 2A اللوحة اليمنى). حل 400 ملي مانيتول يسببها فقطكاليفورنيا 2+ استجابة في الجذور خلال 40S الأولى واشارات ضعيفة جدا في الأوراق أثناء الثاني 40 ثانية. مكعب 2+ المعززة بقوة سعة ومدة الكالسيوم 2+ الإشارات الناجمة عن كلوريد الصوديوم ومانيتول (الشكل 2A اللوحة اليسرى). يبدو أن النحاس كان 2+ الآثار المثبطة على H 2 O 2 يسببها الكالسيوم 2+ الإشارات، خفض كل من السعة والمدة (الشكل 2A اللوحة اليمنى و2B).
باستخدام Case12 النباتات معربا عن نبات الأرابيدوبسيس، قمنا بقياس الكالسيوم 2+ ديناميكية في العصارة الخلوية ونوى في وقت واحد. الوزن الجزيئي للCase12 هو 46 كيلو دالتون، والنباتات المعدلة وراثيا وبالتالي التعبير عن Case12 لها إشارات GFP في كل من العصارة الخلوية ونوى ورقة والخلايا الجذرية (الشكل 4A). واستخدمت مخصصة (الشكل 3A و 3B) أو غرف التجارية (الشكل 3C) لتصوير الخلايا الحية مع مبائرالمجهر. تطبيق 150 مم كلوريد الصوديوم إلى الشتلات في غرفة، لاحظنا التغيرات في كثافة مضان في كل من العصارة الخلوية ونواة الخلايا الفردية (الشكل 4B و C. التكميلية فيلم 1). باستخدام عناصر شيكل، (برنامج التصوير ونيكون الآلات شركة)، قمنا بقياس كثافة مضان في المناطق ذات الاهتمام (ROI) مع مرور الوقت. يتم عرض السعة ومدة ووتيرة من عصاري خلوي ونووي الكالسيوم 2+ التذبذب بيانيا في الشكل 4B. السعة وفترة الكالسيوم 2+ المسامير في السيتوبلازم والنواة تختلف اختلافا كبيرا بين الخلايا من نفس الجذر، وكذلك عبر الخلايا في الجذور مختلفة. كانت السعة وفترة عصاري خلوي كا 2+ المسامير 60.36 ± 45.22 AU (وحدة تعسفية) و58.24 ± 15.70 ثانية على التوالي. كانت السعة وفترة النووية الكالسيوم 2+ المسامير 316.26 ± 75.24 (AU) و61.71 ± 16.31 ثانية على التوالي. في المقابل،كانت مدة الكالسيوم 2+ المسامير عصاري خلوي والنووية مماثلة بين الخلايا، والتي كانت 17.43 ± 3.67 ثانية و 17.33 ± 2 ثانية على التوالي. السعة من الكالسيوم انخفضت 2+ المسامير على مر الزمن، والتي قد تكون بسبب تغيير الطائرة التنسيق و / أو فقدان استجابة لمحفزات الإجهاد بسبب غير مواتية في حالة المختبر. وتبين هذه النتائج أن الإجهاد يؤدي الملح الكالسيوم 2+ التذبذب في كل من السيتوبلازم والنواة.
الرقم 1. Aequorin القائمة على نظام FAS لقياس المكانية والزمانية الكالسيوم 2+ ديناميات ردا على التأكيد على المحفزات. A) شتلات نبات الأرابيدوبسيس تنمو عموديا على لوحة تحتوي على MS سائل الإعلام. B، C) ضع لاصقة فيلم (B) على رأس شتلات (C). D، E) F) احتضان الشتلات انضمت إلى فيلم مع 2 ميكروغرام / مل من H-CTZ في الماء لمدة 4 ساعة. G) قطع الفيلم في منتصف أسفل ووضع كل قطعة في مختلف لوحة فارغة. ترك لوحات في الظلام لمدة 5 دقائق. تقدم التحكم في وقت واحد والحلول المحفزات (تأكد يتم تغطية الشتلات تماما)، والحصول على صور الفور. شريط المقياس 5 سم.
الشكل 2. مقارنة بين المكانية والزمانية الكالسيوم 2+ رد 10 شتلة يوم لمحفزات الإجهاد المختلفة. أ) السلاسل الزمنية من الصور التلألؤ الشتلات يتعرض إلى 400 ملي و 400 ملي مانيتول مانيتول زائد 1 ملي CuCl 2 (A، اللوحة اليسرى)، 75 مم كلوريد الصوديوم وكلوريد الصوديوم 75 ملم زائد 1 ملي CuCl2 (A، لوحة الوسطى)، و 1 ملي H 2 O 2 أو 1 ملم H 2 O 2 زائد 1 ملي CuCl 2 (A، اللوحة اليمنى). الألواح العلوية والسفلية من A هي صور التلألؤ المكتسبة خلال أول 40 ثانية والثانية 40 ثانية، على التوالي. يدل على وجود شريط مقياس كثافة بزيادة قدرها إشارات من التلألؤ منخفضة (أسود) إلى الأعلى (أبيض). B) بار الرسم البياني لمتوسط كثافة التلألؤ من الشتلات في استجابة للمثيرات التوتر المشار إليها.
الرقم 3. إعداد خلية حية تجربة التصوير متحد البؤر. أ) يبني غرفة مخصصة مع شريحة، ساترة مع أربع قطع من الطين والقطن والصوف. يتم وضع اثنين من الشتلات القديمة 5 أيام على الشريحة. وضعت واحدة من نهاية الأنبوب البولي ايثيلين المقبل إلى غرفة تجميعها وثابتة مععلى قطعة من الشريط أثناء توصيل الطرف الآخر إلى 1 مل حقنة. B) شريحة مخصصة المصنوعة من زجاج شبكي لديها غرفة مفتوحة في الوسط واثنين من القنوات التي ترتبط ضفتي القناة. وضعت واحدة ساترة على الجزء العلوي من الشرائح وتوضع أنبوبين polyethlene في القناة. ساترة ويتم إصلاح الأنابيب في موقف مع سيليكون الشحوم. يتم توصيل نهاية واحد من الأنابيب إلى حقنة 1 مل ونهاية أنبوب آخر لا يزال مفتوحا. يتم وضع الشتلات القديمة 5 أيام في غرفة ويتم وضع coveslip على الجزء العلوي من الشتلات ومختومة مع سيليكون الشحوم. يتم وضع الشريحة plexigalss مع الغرفة تجميعها على مسرح المجهر. تزرع C) شتلات نبات الأرابيدوبسيس في بئرين (يسار) أو 8 آبار (يمين) من الزجاج غطاء غرف تحتوي على طبقة رقيقة من 0.6٪ من phytagel في MS وسائل الاعلام.
الرقم 4. عصاري خلوي والكالسيوم النووي 2+ التذبذب ردا على الإجهاد الملحي. A) تظهر الصور متحد البؤر التي يعبر Case12 في سيتوبلازم وأنوية خلايا الجذر (اللوحة اليسرى) وخلايا ورقة (اللوحة اليمنى) من النباتات المعدلة وراثيا معربا عن Case12. الصورة على اللوحة اليمنى هي الصورة المدمجة من تألق ذاتي الأحمر من البلاستيدات الخضراء ومضان أخضر من Case12. B) الملح الإجهاد (150 ملي مول كلوريد الصوديوم) التي يسببها الكالسيوم 2+ التذبذب في العصارة الخلوية (اللوحة العليا) ونوى (اللوحة السفلى) من خلايا الجذر. يشار مواقع الخلايا تقاس السهام مع الأرقام على لوحة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لقد أثبت نظام FAS لتسجيل المكانية والزمانية الكالسيوم 2+ استجابة شتلات نبات الأرابيدوبسيس. يوفر هذا FAS الكالسيوم 2+ نظام تسجيل مقاربة بسيطة وحساسة وقوية التي يمكن تكييفها لقياس الكالسيوم 2+ ديناميات الناجمة عن المنبهات المختلفة بالإضافة إلى محفزات الإجهاد غير الحيوية التي يتم تقديمها هنا. باستخدام هذا النظام، يمكننا بسهولة مقارنة نسيجيا أو مؤثرات معينة المكانية والزمانية الكالسيوم 2+ ديناميكية على مستوى المصنع بأكمله. حساسية عالية من FAS يسمح باستخدام محفزات كثافة منخفضة لدراسة استجابات الكالسيوم 2+، وهو أمر مهم لتفادي القطع الأثرية الناجمة عن الأضرار المادية للخلايا عند استخدام كثافة عالية الإجهاد. سبعة إلى 10 أيام شتلات نبات الأرابيدوبسيس القديمة أظهرت الأنسجة أو مؤثرات معينة كا 2+ ردا على ذلك، على الرغم من الشتلات في المراحل الفسيولوجية المختلفة قد يكون حساسية وخصوصية مختلفة في استجابة لحافز معين. ولذلك فمنيفضل استخدام الشتلات القديمة 7-10 يوم لزيادة الإنتاجية من القياسات FAS، التي يمكن من خلالها الالتزام نحو 100 شتلة على قطعة واحدة من الفيلم. جنبا إلى جنب مع أداء سهلة وبسيطة، وحساسية عالية والتكاثر، ويمكن أيضا أن تتكيف النظام FAS لفحص المسوخ EMS mutagenized للاستجابات الكالسيوم 2+ تغييرها. لفحص الأغراض، فمن الأهمية بمكان أن يكون موحدة الشتلات التي تزرع بشكل جيد على لوحة والالتزام على الفيلم. أربع إلى خمس ساعات حضانة فيلم الالتزام الشتلات مع H-CTZ هي عادة ما تكون كافية لإعادة تشكيل aequorin. استخدام الفيلم لاصقة مع الثقوب هو الأفضل لأن رد فعل apoaequorin والعامل المساعد يتطلب الأكسجين. للمقارنة بين الأنسجة أو مؤثرات معينة الردود الكالسيوم 2+، وذلك باستخدام مجموعة من الشتلات في الأصل من نفس الفيلم أمر بالغ الأهمية لأن الدولة الشتلات و / أو إعادة حالة قد تؤثر على المبلغ الإجمالي للaequorin ظيفية. عندما تكون هذه requiremeيتم استيفاء اليلة، والفرق من استجابة التلألؤ يتناسب مع نسيجيا أو التحفيز محددة كا 2+ استجابة.
Aequorin قياس مقرها إشارات الكالسيوم 2+ تعكس استجابة من السكان من الخلايا. ومع ذلك، وبالنظر إلى عدم تجانس أنواع الخلايا و / أو الوصول مختلفة من الخلايا في الأنسجة إلى محفزات، ونتائج Aequorin تستند الكالسيوم 2+ القياسات لا تساوي سلوك أي خلية واحدة. فهم ديناميات الكالسيوم 2+ على المستوى الخلوي يتطلب الكالسيوم 2+ مؤشر يمكن أن يتم الكشف عن لقرار التحت خلوية. خلية الحية التصوير متحد البؤر مضان من البروتين (FP) القائم على توفر الكالسيوم مؤشرات 2+ على الكالسيوم 2+ نظام الكشف المتقدم لتسجيل الخلوية كا 2+ ديناميات مع قرار الخلوي في الأنسجة المطلوب. هنا، وذلك باستخدام خلايا حية التصوير متحد البؤر والكالسيوم مؤشرات 2+ استنادا FP-، سجلنا التحت خلوية كا 2+ FP-2+ تم تنفيذها في النباتات ذات خصائص مختلفة. مقارنة YCS، واحد قائم على GFP الكالسيوم 2+ المؤشر لديه بعض المزايا: لا يتطلب 1. Case12 YFP والحراجية مجموعات مرشح أو العديد من الافتراضات والحسابات المعقدة اللازمة لقياس الحنق 22. Case12 ديه واحد الإثارة / ماكسيما الانبعاثات ويمكن الكشف بسهولة باستخدام معيار مجموعة مرشح GFP. 2. Case12 مستقرة تحت درجة الحموضة الفسيولوجية، وهو بروتين صغير نسبيا (46 كيلو دالتون). عندما أعرب في النباتات، يظهر غير المستهدفة Case12 في السيتوبلازم وكذلك نوى، حتى النباتات المعدلة وراثيا Case12 يمكن استخدامها لتتبع عصاري خلوي والنووية الكالسيوم 2+ ديناميكية في نفس الوقت. ومن عيوب هذا المراسل هو أنه مؤشر غير ratiometric، لذلك تتأثر مستويات مضان أيضا من العوامل التي لا علاقة لها تركيز الكالسيوم 2+، مثل مستوى التعبير عنCase12 ودرجة الحموضة المحلية. ومع ذلك، Case12 غير كافية لتحديد تركيز الكالسيوم 2+ الخلوي لمقارنة المكانية والزمانية الكالسيوم 2+ ديناميكية في السيتوبلازم والعضيات بين المواد مع خلفيات وراثية مختلفة تحت نفس الظروف التجريبية. في المستقبل، GFP جديد يقوم الكالسيوم 2+ المؤشرات مع أعلى نسبة الإشارة إلى الضوضاء، وزيادة حركية سريعة الاستجابة، مثل GCaMP3 24 و 25 GCaMP5 تظاهروا في الحيوانات، ويمكن أن تكون مؤشرات أفضل لتسجيل الخلوية أو subcelluar الكالسيوم 2+ في ديناميات النباتات.
أنظمة الكشف Aequorin وCase12 الموصوفة هنا توفر غير تدميري في الجسم الحي النهج لقياس المكانية والزمانية الكالسيوم 2+ ديناميكية في الشتلات كاملة ومستويات التحت خلوية، على التوالي. في كلا النظامين، يمكن للظروف الحالة الفسيولوجية أو النمو يؤثر على الكالسيوم 2+ ردود الشتلات أو الخلايا. إذا physicaLLY تضررت أم لا تزرع في حالة جيدة، يمكن أن الخلايا لديها ضعيفة أو حتى لا كا 2+ الردود. وبالإضافة إلى ذلك، تتأثر مدة المكانية والزمانية الكالسيوم 2+ إشارات أيضا شروط الشتلات خلال القياسات. قد يقلل الإشارات التلألؤ أو مضان مع مرور الوقت بسبب الضرر الناجم عن المحفزات، و / أو الصور الأضرار التي يسببها الليزر في حالة التصوير متحد البؤر. على الرغم من أن الضرر الناجم عن التحفيز لا يمكن تجنبها، ويمكن تخفيض الضيائية عن طريق الحد من كثافة و / أو تواتر التعرض ليزر. بالإضافة إلى ذلك، يتطلب Aequorin مقرها كاليفورنيا 2+ نظام تسجيل خطوة إعادة. ان العوامل التي تقطع نشر CTZ إلى الخلية و / أو رد فعل apoaequorin مع CTZ تؤثر إشارات التلألؤ التي ترتبط مباشرة إلى تركيز الكالسيوم 2+. وبالتالي فإن تركيز CTZ، فضلا عن مدة وشروط CTZ الحضانة تحتاج إلى أن يكون الأمثل لأفضل حساسية وreproducibilإيتي. المشفرة وراثيا الكالسيوم 2+ المؤشرات قد تقرير غير دقيق الخلوية تركيزات الكالسيوم 2+ لأسباب أخرى، بما في ذلك غير مقصودة تستهدف لمقصورات التحت خلوية محددة، حساسية درجة الحرارة، أو التدخل لمراسل مع CA2 الخلوي + يشير الماكينات 23. وجدنا أن Aequorin أو Case12 النباتات التعبير ليس لها الظواهر المورفولوجية أو مشروطة واضحة مثل غيرت تحمل الإجهاد. لذلك فمن غير المرجح أن هذه المشفرة وراثيا الكالسيوم 2+ مؤشرات لها تدخلات رئيسية مع الكالسيوم 2+ يشير في النباتات.
وباختصار، فإننا نقدم هنا تعليمات مفصلة لاستخدام اثنين من الكالسيوم 2+ أنظمة كشف لقياس الكالسيوم المكاني والزماني 2+ إشارات في كل من الشتلات مصنع كامل والمستويات التحت خلوية. يمكن استخدام هذين النظامين لتحديد الأنسجة (أو نوع من الخلايا) أو الكالسيوم المحفزات الخاصة 2+ أنماط الديناميكية مع حساسية عالية والتكاثر. لذا هم أدوات قوية لتوضيح شبكات الجينات التي تكمن وراء كا 2+ إشارات ردا على منبهات البيئية المختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm x 10 cm square Petri dish | VWR | 60872-310 | |
| Adhesive film | VWR | 60941-062 | |
| Polyethylene tubing | PerkinElmer | 9908265 | |
| 1 ml syringe | VWR | 53548-000 | |
| Silicone grease | Beckman | 335148 | |
| 2-well chambered cover glass | Nalge Nunc international | 155379 | |
| 8-well chambered cover glass | Nalge Nunc international | 155409 | |
| Luminescence imaging system | Princeton Instruments | N/A | |
| Inverted confocal laser-scanning microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon A1R |
| Imaging software | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Elements |
| DataGraph | Visual Data Tools Inc | N/A | DataGraph 3.1.1 is the newest version |
| Coelenterazine | NanoLight Technolgies | #301B NF-BCTZ-FB | |
| All purpose bleach | Any local store | N/A | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151500 | |
| MS salt | Phytotechnology Labs | M524-50L | |
| Sucrose | VWR | BDH8029-12KG | |
| Agar | Sigma | A1296-5KG | |
| Phytagel | Sigma | P8169-1KG |
References
- Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. Calcium signals: the lead currency of plant information processing. Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).
- Pan, Z., Zhao, Y., Zheng, Y., Liu, J., Jiang, X., Guo, Y. A high-throughput method for screening Arabidopsis mutants with disordered abiotic stress-induced calcium signal. J. Genet. Genomics. 39 (5), 225-235 (2012).
- Ranf, S., et al. Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana. Mol. Plant. 5 (1), 115-130 (2012).
- Zhu, X., Feng, Y., Liang, G., Liu, N., Zhu, J. K. Aequorin-based luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Mol. Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
- Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).
- Van der Luit, A. H., Olivari, C., Haley, A., Knight, M. R., Trewavas, A. J. Distinct calcium signalling pathways regulate calmodulin gene expression in tobacco. Plant Physiol. 121 (3), 705-714 (1999).
- Johnson, C. H., et al. Circadian oscillations of cytosolic and chloroplastic free calcium in plants. Science. 269 (5232), 489-503 (1995).
- Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signature after acclimation. Plant Cell. 8 (3), 489-503 (1996).
- Logan, D. C., Knight, M. R. Mitochondrial and cytosolic calcium dynamics are differentially regulated in plants. Plant Physiol. 133 (1), 21-24 (2003).
- Mehlmer, N., Parvin, N., Hurst, C. H., Knight, M. R., Teige, M., Vothknecht, U. C. A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot. 63 (4), 1751-1761 (2012).
- Kiegle, E., Moore, C. A., Haseloff, J., Tester, M. A., Knight, M. R. Cell-type-specific calcium responses to drought, salt and cold in the Arabidopsis root. Plant J. 23 (2), 267-278 (2000).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat. Protoc. 1 (3), 1057-1065 (2006).
- Souslova, E., et al. Single fluorescent protein-based Ca2+ sensors with increased dynamic range. BMC. Biotechnol. 7, 37-46 (2007).
- Tanaka, K., Swanson, S., Gilroy, S., Stacey, G. Extracellular nucleotides elicit cytosolic free calcium oscillations in Arabidopsis. Plant Physiol. 154 (2), 705-719 (2010).
- Iwano, M., et al. Fine-tuning of the cytoplasmic Ca2+ concentration is essential for pollen tube growth. Plant Physiol. 150 (3), 1322-1334 (2009).
- Sieberer, B., Chabaud, M., Timmers, A., Monin, A., Fournier, J., Barker, D. A nuclear-targeted Cameleon demonstrates intranuclear Ca2+ spiking in Medicago truncatula root hairs in response to rhizobial nodulation factors. Plant Physiol. 151 (3), 1197-1206 (2009).
- Loro, G., Drago, I., Pozzan, T., Lo Schiavo, F., Zottini, M., Costa, A. Targeting of Cameleons to different subcellular compartments reveals a strict cytoplasmic/mitochondrial Ca2+ handling relationship in plant cells. Plant J. 71 (1), 1-13 (2012).
- Krebs, M., et al. FRET-based genetically encoded sensors allow high-resolution live cell imaging of Ca2+ dynamics. Plant J. 69 (1), 181-192 (2012).
- Bonza, M. C., Loro, G., Behera, S., Wong, A., Kudla, J., Costa, A. Analyses of Ca2+ accumulation and dynamics in the endoplasmic reticulum of Arabidopsis root cells using a genetically encoded Cameleon sensor. Plant Physiol. 163 (3), 1230-1241 (2013).
- Costa, A., et al. H2O2 in plant peroxisomes: An in vivo analysis uncovers a Ca2+ dependent scavenging system. Plant J. 62 (5), 760-772 (2010).
- Zhu, X., Caplan, J., Mamillapalli, P., Czymmek, K., Dinesh-Kumar, S. P. Function of endoplasmic reticulum calcium ATPase in innate immunity-mediated programmed cell death. EMBO J. 29 (5), 1007-1018 (2010).
- Roszik, J., Lisboa, D., Szöllosi, J., Vereb, G. Evaluation of intensity-based ratiometric FRET in image cytometry--approaches and a software solution. Cytometry A. 75 (9), 761-767 (2009).
- Kotlikoff, M. I. Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology. J. Physiol. 578 (Pt 1), 55-67 (2007).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
