Biology

测量时空的Ca Published: September 2, 2014 doi: 10.3791/51945

DOI

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Xiaohong Zhu¹, Aaron Taylor², Shenyu Zhang¹, Dayong Zhang^1,3, Ying Feng^1,4, Gaimei Liang^1,5, Jian-Kang Zhu^1,6

¹Department of Horticulture and Landscape Architecture, Purdue University, ²Bindley Bioscience Center, Purdue University, ³Institute of Biotechnology, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, ⁴College of Environmental & Resource Science, Zhejiang University, ⁵Dryland Agriculture Research Centre, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, ⁶Shanghai Center for Plant Stress Biology, Chinese Academy of Sciences

Summary

^的 Ca ^{2 +}信号调控植物中不同的生物过程。在这里，我们提出的方法用于监测非生物胁迫诱导的时空钙在拟南芥的细胞，并使用基因编码的^钙指标水母发光蛋白或Case12组织^{2 +}信号。

Abstract

发展与环境线索诱发^的 Ca ^{2 +}的波动在植物细胞中。刺激特定的空间-时间^的 Ca ^{2 +}的图案是由发起^的 Ca ^{2 +}信号传导级联的细胞^的 Ca ^{2 +}结合蛋白的检测。但是，我们仍然知之甚少如何刺激产生特定的^钙信号。 à ^钙离子信号的特殊性可能是由于^钙离子通道和/或转运活动的复杂调控响应给定的刺激。识别这些细胞成分和理解它们的功能，关键的是要使用的系统，允许^的 Ca ^{2 +}信号的灵敏和鲁棒记录同时在组织和细胞水平。基因编码的定位到不同的细胞^钙指标都规定了细胞^钙信号活细胞共聚焦成像的平台。在这里，我们描述的指令S为使用两^钙离子检测系统：基于水母发光蛋白FAS（薄膜粘合苗）发光^钙成像和case12基于活细胞共聚焦荧光^钙离子成像。使用FAS系统发光成像提供了一种简单，可靠和灵敏的检测的空间和时间^的 Ca ^{2 +}信号，在组织水平的，同时采用Case12活细胞的共聚焦成像提供同时检测胞质和核^的 Ca ^{2 +}信号中的较高的分辨率。

Introduction

植物细胞响应该坐标细胞动作经由信令环境。早期的细胞在应对环境刺激信号事件是一个短暂的^钙增加。的图案，或一过性升高签名中游离^的 Ca ^{2 +}浓度的特征在于，其振幅，频率和持续时间。不同的时空^钙签名规范不同的细胞活动^1。特定刺激，如热，冷，盐，干旱，光，或植物激素，可以微调膜本地化^的 Ca ^{2 +}通道和/或转运的时空活性，导致具体^的 Ca ^{2 +}的签名。虽然^钙离子转运都得到很好的特点，鲜为人知的是， ^钙离子通道在植物¹分子的身份和功能。对于突变体遗传筛选具有改变^的 Ca ^{2 +}响应强调刺激可能是一种有效APPRoach用于识别构成^的 Ca ^{2 +}的签名的组件。最近基于几个水母发光蛋白^的 Ca ^{2 +}检测系统已被开发，以促进遗传筛选的^钙响应于病原体攻击和非生物胁迫^2-4信令组件。

水母发光蛋白最早是用于检测钙在植物体内^离子信号在90年代初^5。从那时起，水母发光蛋白已经被定位到不同的细胞区室，如细胞质^5，核^6，叶绿体^7，液泡膜^8，线粒体⁹和基质^10，以及不同的细胞类型中的根来监视特定的Ca ²细胞⁺信号^11。基于水母发光蛋白^钙离子的测量揭示细胞应力刺激人口的空间和时间^的 Ca ^{2 +}的响应。然而，在大多数情况下，单个细胞的^钙离子的反应是unsynchroni捷思在响应组织^4。因此，水母发光蛋白^的 Ca ^{2 +}的记录不一定报告在个体细胞中的^钙信号。近年来，基因编码荧光蛋白（FP）为基础^的 Ca ^{2 +}的指标，如黄色卡默莱昂^（YCS）12和CASEs12 ¹³已被用于研究^的 Ca ^{2 +}具有高亚细胞分辨率的信号。 YCS是荧光共振能量转移（FRET）为基础^的 Ca ^{2 +}的指标，含有CFP和YFP的变体由钙挂钩^{2 +}结合蛋白钙调蛋白和钙调蛋白结合肽M13。钙调蛋白发生构象变化，因为它结合^的 Ca ^{2 +，}由此带来的CFP和YFP更加靠近，从而增加了能量转移（FRET增强）。随着时间的荧光共振能量转移的水平，大约为YFP对CFP信号强度的比值计算，反映了细胞内^钙离子动态。几个YC版本已被用于在植物中。 YC3.6为吨argeted到细胞质^14,15，核^16，线粒体^17，和质膜^18，和YC4.6和D4ER被定位到ER ^15,19，和D3cpv被靶向过氧化物酶体^20。转基因植物表达YCS允许不同类型的细胞不同的细胞内^钙离子动态的活细胞成像。例（大概钙 lcium 本身 nsor）是单圆置换荧光蛋白（cpFPs）窝藏钙调蛋白和钙调蛋白结合肽M13。结合后^的 Ca ^{2 +，}情况发生构象变化，从而导致增加的荧光强度。该案例的荧光响应和Ca ^{2 +}浓度之间的相关性使得细胞内^钙离子动力学来进行定量测定。在^钙 -饱和脂肪形式Case12变种12倍的增加荧光。N。 benthiminana植物瞬时EXPRessing Case12或拟南芥稳定表达病例12为材料，研究^钙信号在国防和非生物胁迫^4,21。异步时空^钙离子振荡，细胞应对病原体的攻击，或脱水的压力已经显露了Case12基于^钙离子成像。

在这里，我们提出的组织-和刺激基于水母发光蛋白发光成像特定的CA在拟南芥幼苗^离子动力，并为细胞内的共焦成像与核钙的详细说明，在拟南芥根细胞^离子的动态表达的FAS案例12发光成像可适于分析在完整植物或此处未描述的组织应力诱导^的 Ca ^{2 +}的动态，或筛选诱变的拟南芥属植物种群，对具有改变的应力诱导^的 Ca ^{2 +}信号的突变体。活细胞^的 Ca ^{2 +}成像设置可适于分析钙使用其他^钙指标内的不同亚细胞区室或在不同类型的细胞离子动力。

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Protocol

1，基于水母发光蛋白^钙成像使用FAS系统

准备苗木发光成像。消毒拟南芥植物表达水母发光蛋白含0.01％的Triton-100 10％的漂白粉溶液的种子。播下含有全强度MS（Murashige和Skoog基础盐混合物），1％蔗糖和1.2％琼脂的无菌种子在方形板（10×10厘米的正方形培养皿格）。代替板垂直地在分层后培养室中于4℃下进行2天（ 图1A）。
转移到苗木电影。在7-10天龄幼苗的生长板的顶部放置一个粘合膜（ 图1B）。轻轻地用手推片，以确保苗附着于膜（ 图1C）。剥离该膜轻轻使得幼苗保持粘附于膜（ 图1D和1E）
孵育辅苗。将在Adhered幼苗在含正方形板（10×10厘米）将15ml 2微克/毫升H-CTZ（腔肠素）的水。孵育秧苗在室温下搅拌4小时至过夜（ 图1F）。
准备发光成像。就拿拍出来的H-CTZ的解决方案，并剪下来的中间，形成两片。将每一块膜用苗面对两种不同的板块。留在暗处将板5分钟。
获得发光图像。在黑暗中，将两个板彼此相邻的发光成像系统（ 图1G）的阶段。后，立即同时加入20ml的刺激溶液于板获得图像。
分析发光图像。选择相同的显示范围为所有发光图像。作物感兴趣区域（ROI）的区域，并生成图像，JPEG文件（ 图2A）。另外，导出图像作为固相萃取格式的文件，并将其导入到ImageJ的图像分析软件。设置测量投资回报率的平均灰度值的计算。选择ROI区域的大小相同，并测量平均灰度和本数据作为柱状图（ 图2B）。

2，活细胞共聚焦^钙成像

准备苗木共聚焦成像。消毒拟南芥植物表达case12含0.01％的Triton 10％的漂白粉溶液的种子。母猪在含有全量MS盐类，1％蔗糖，1.2％琼脂平板无菌种子。代替板垂直地在分层后培养室中于4℃下进行2天。
安装成像钱伯斯
1. 装配使用幻灯片和盖玻片（室）的成像室。将一块浸透水的脱脂棉上滑动的中间。然后从板传送一个或两个5天龄幼苗到水浸泡药棉的顶部。坚持小块粘土的盖玻片，在每一个角落d将盖玻片上的幼苗创造盖玻片和载玻片之间的间隙（室）（ 图3A，左图）的顶部。聚乙烯管（0.58mL毫米直径）的一端连接至1ml注射器和放置管紧邻所述腔室的另一端。用胶带（ 图3A，右图）握住管到位。
2. 装配用有机玻璃室（B室）成像室。
  1. 散布一层薄薄的硅脂围绕两个聚乙烯管（0.58mL毫米直径），然后按涂覆管放置在有机玻璃室的每一侧的信道（ 图3B左面板）。散布一层薄薄的硅脂到包含所述管槽的腔室的表面上，按盖玻片入润滑脂，以密封腔室开口（切出）的一侧。
  2. 从板块转移日龄苗成室，并放置了一块脱脂棉用开水浸泡在顶部ØF表示苗子。传播硅脂到所述腔室的另一面，然后按上顶端以密封另一盖玻片。其中一个管的一端连接到1毫升注射器。离开其他管开放（ 图3B右面板）的端部。
3. 采用腔盖玻璃（C室）准备成像室。消毒腔盖玻璃用70％乙醇和离开它引擎盖上直到干燥。添加0.6毫升或0.2含1％蔗糖和0.5％植物凝胶成2孔腔的每个孔或8孔腔室（ 图3C右侧面板），分别为全强度MS培养基中。种子消毒，直接在含有一层薄薄的透明凝胶的墓室盖玻璃播下的种子，让他们上下5天（ 图3C）成长。
掌握用共聚焦显微镜图像。施加压力刺激，如盐，寒冷或过氧化物，慢慢注入大约200微升的150 mM氯化钠，冰栏ð水或1毫米的H _{2 O 2}获取图像，或轻轻地加刺激液500微升或100微升至2或8孔室的很好，分别前夕溶液进入室（厅A或B）。拍摄的图像将立即使用倒置尼康A1R共聚焦激光扫描显微镜20倍水浸泡镜片（数值孔径0.75）刺激后的解决方案。收集在4秒的间隔与488 nm和500的激发和发射波长的时间序列图像 - 550纳米，分别，并且在512×512像素的分辨率。
图像分析
使用尼康元素，投资回报是吸引每一个感兴趣的单元格（或区域）周围。每个感兴趣区域内的总强度是使用时间测量对话框（ImageJ的可以用来代替）随时间测量。总强度测量输出和数据图进行处理。 ^钙尖峰幅度定义为峰值强度减去休息的强度，持续时间为次起始和尖峰完成后，并作为两个尖峰相邻尖峰峰值之间的时间间隔周期E之间的时间。吨 -test用于比较的装置。

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Representative Results

甘露糖醇，氯化钠和H _{2 O 2}被用作代理进行脱水，盐和氧化应激刺激，分别。检查，如果重金属离子铜^离子协同作用与任何这三个应力刺激，我们比较了^的 Ca ^{2 +}响应于在铜^离子的存在或不存在各刺激。如示于图2中 ，FAS发光成像显示，Arabidoposis苗反应不同脱水，盐和氧化应激。为刺激我们研究在本研究中的浓度，75mM氯化钠诱导的第40秒的曝光（ 图2A中间面板和图2B）的过程中在叶和根中的最强^的 Ca ^{2 +}的响应，而1 mM的H _{2 O 2}诱导的无论是在第一次和第二次40秒（ 图2A右面板）在叶和根的一个强有力^的 Ca ^{2 +}的响应。 400mM的甘露糖醇的溶液中仅诱导第二次40秒的过程中时，叶片的第一和40年代非常微弱的信号根^钙反应。 ^铜离子强烈增强的振幅和通过NaCl和甘露醇（ 图2A左面板）来触发^的 Ca ^{2 +}信号的持续时间。它显示了Cu ^{2 +}对H _{2 O 2}诱导^的 Ca ^{2 +}信号，减少幅度和持续时间（ 图2A右面板和2B）的抑制作用。

使用Case12表达拟南芥中，我们测得的钙在细胞浆^离子动力学和核同步。 Case12的分子量为46 kDa的，所以转基因植物表达Case12有两种胞质溶胶中的GFP信号和叶的细胞核和根细胞（ 图4A）。定制（ 图3A和3B）或商会（ 图3C）被用于活细胞成像与激光共聚焦显微镜。施加150 mM氯化钠的幼苗在腔室中，我们在两种细胞溶胶和各单电池（;补充电影1 图4B和C）的核观察到荧光强度的变化。使用NIS-Elements的（图像处理软件，尼康仪器公司），我们测得的荧光强度在感兴趣区域（ROI），随着时间的推移地区。的振幅，持续时间和胞质和核^的 Ca ^{2 +}振荡的频率以图形方式在图4B中给出。的振幅和周期的Ca ^{2 +}的尖峰在细胞质和细胞核变化很大不同细胞中的不同的根相同的根的细胞，间以及。的细胞质^的 Ca ^{2 +}尖峰振幅和周期分别为60.36±45.22 AU（任意单位）和58.24±15.70秒，分别。核^钙尖峰的振幅和周期分别为316.26±75.24（非盟）和61.71±16.31秒，分别。与此相反，在的细胞质和细胞核^钙尖峰时间分别为细胞，分别为17.43±3.67秒和17.33±2秒之间相似。的Ca ^{2 +}的振幅峰值随时间降低，这可能是由于焦平面和/或响应的损失的变化要强调的，因为在体外条件不利的刺激。这些结果表明，盐胁迫触发^的 Ca ^{2 +}振荡同时在细胞质和细胞核中。

图1：基于水母发光蛋白FAS系统，用于测量时空^钙离子动力响应应力刺激。 A）成长拟南芥幼苗垂直于含MS培养基，B中板，C），对苗木的最高层（C），D，E）发布粘接薄膜（B）。F）的温育苗附着于薄膜用H-CTZ的2微克/毫升水中搅拌4小时。G）的切膜拦腰并把每一块成不同空盘。留在暗处将板5分钟。同时适用于控制和刺激方案（请务必在幼苗完全覆盖），并立即采集图像。比例尺为5厘米。

图2比较时空的Ca ^{2 +}的第10天幼苗不同应力刺激的反应。 A）的时间序列苗发光图像进行400毫米的甘露醇和400毫米甘露醇加1毫_氯化铜（一，左图），75毫米氯化钠和75毫米氯化钠加1毫氯化亚铜图2（A，中图），以及1毫米H _{2 O 2}或1毫米的H _{2 O 2}加1 mM的_氯化铜（一，右图）。 A的上部和下部板是第一40秒和秒40秒，分别期间获得的发光图像。强度比例尺为从低（黑）增加发光信号的高电平（白）。B）的条形图苗的平均发光强度的响应于所指示的压力刺激。

图3设置活细胞共聚焦成像实验。 A）定制室建有幻灯片，盖玻片用四块粘土和脱脂棉。两个5天的幼苗放置在幻灯片。的聚乙烯管的一端被放在旁边的装配室和固定一个个的磁带，而另一端被连接到1ml注射器。乙）定制的滑动用有机玻璃制成具有开放的腔室中的中间，并且被连接到信道的两侧的两个通道。一盖玻片放置在载玻片的顶部和两个聚乙烯管被放置在信道。盖玻片和管被固定在用硅润滑脂的位置。管中的一个的一端连接到1ml注射器和另一管的端部保持打开状态。 5天老苗置于室和coveslip放在苗的顶部和硅脂密封。与装配腔的plexigalss载玻片放置在显微镜的阶段。℃）的拟南芥幼苗生长在两口井（左）或8个孔（右）含有的植物凝胶为0.6％，在MS一层薄薄的腔盖玻璃的媒体。

图4胞质和核^的 Ca ^{2 +}振荡响应于盐胁迫。 A）的共聚焦图像显示，Case12表现在细胞质和根细胞（左图）和转基因植物表达Case12叶细胞（右图）的细胞核。右侧面板上的图像的叶绿体自发荧光红和Case12。的B绿色荧光）的盐胁迫（150毫米氯化钠）引起的^钙离子振荡在细胞质中（上图）和细胞核（下图）的合并图像根细胞。所测量的小区的位置由与上面板的数字的箭头表示。

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Discussion

我们已经展示了FAS系统记录拟南芥幼苗的时空^钙离子的响应。这FAS ^钙记录系统提供了一个可能被适用于测量通过钙除了在此处提出的非生物胁迫的刺激各种刺激引起^离子动力简便，灵敏，强健的方法。使用这个系统，我们可以很容易地在整株水平比较组织或刺激特定的时空^钙离子动态。 FAS的高灵敏度允许使用低强度刺激的用于检查^的 Ca ^{2 +}的反应，这是为了避免造成物理损伤细胞的工件时，高强度的应力时非常重要的。 7到10天龄的拟南芥幼苗表现出组织或刺激特异性^的 Ca ^{2 +}的反应，虽然苗在不同生理阶段可具有不同的敏感性和特异性响应于给定的刺激。因此，它是优选使用7-10天龄的幼苗，以增加吞吐量FAS测量的，其中约100个苗，可以粘附到一块薄膜。连同容易和简单的性能，高的灵敏度和重现性，该FAS系统也可适于用于筛选的EMS诱变的突变体改变^的 Ca ^{2 +}的响应。对于筛选目的，关键是要具有良好生长在平板上，并附着在薄膜上均匀的苗。薄膜粘附苗H-CTZ的四五个小时的潜伏期通常是足够的水母发光蛋白的重建。具有孔用粘接膜是优选的，因为apoaequorin和辅因子的反应需要氧气。对于组织或刺激特异性^的 Ca ^{2 +}响应的比较，使用幼苗组最初是从同一影片是至关重要的，因为苗和/或重组的条件可能影响功能的水母发光蛋白的总量的状态。当这些requiremeNTS都满足，发光响应的差异成比例的组织或刺激特异性^的 Ca ^{2 +}的响应。

水母发光蛋白^的 Ca ^{2 +}信号的基础的测量反映细胞群体的响应。但是，考虑到细胞类型和/或细胞在组织中，以刺激的不同的可访问性的异质性，水母发光蛋白的结果的基础^的 Ca ^{2 +}测量不等同于任何一种细胞的行为。了解^钙离子动力在细胞水平要求，可与亚细胞分辨率检测的^钙指标。荧光蛋白的活细胞的共聚焦成像（FP）为基础^的 Ca ^{2 +}的指标提供了一种先进^的 Ca ^{2 +}检测系统，用于记录细胞内Ca ^{2 +}动力学与在期望的组织细胞的分辨率。在这里，用活细胞共聚焦成像和FP型^钙离子的指标，我们记录了细胞内^钙离子钙指标具有不同特性的植物已经实现。相较于YCS，单绿色荧光蛋白为基础的^钙指标具有一定的优势：1。Case12不需要YFP和CFP过滤器设置或许多假设和衡量FRET ²²需要复杂的计算。 Case12具有单一的激发/发射最大值，并且可以使用标准的GFP过滤器组容易地检测到。 2 Case12是生理pH值下稳定，是一个比较小的蛋白质（46 kDa的）。当在植物中表达的，非靶向Case12出现在细胞质以及细胞核，所以Case12的转基因植物可用于同时跟踪胞质和核^钙动力学。记者的一个缺点是，它是一种非比例的指标，所以荧光水平也受到那些无关^的 Ca ^{2 +}浓度的因素，例如表达水平Case12和当地的pH值。然而，Case12是足以确定细胞内Ca ^{2 +}浓度为材料与不同的遗传背景之间在细胞质中的时空^钙动力学和细胞器的相同的实验条件下进行比较。在未来，新的GFP基于^钙指标具有更高的信号-噪声比，快的动力学和更大的反应，像GCaMP3 ²⁴和GCaMP5 ²⁵中的动物表现出，可以用于记录细胞是更好的指标或亚细胞^的 Ca ^{2 +}动力学中植物。

这里所描述的水母发光蛋白和Case12检测系统提供无损体内的方法时空^钙离子动力学在整个苗期和亚细胞水平，分别测量。在这两种系统中，活体的状态或生长条件可能会影响钙的幼苗或细胞^{2 +}的响应。如果物理学LLY损坏或无法在一个良好的状态生长，细胞可以具有弱甚至没有^的 Ca ^{2 +}的响应。此外，空间和时间^的 Ca ^{2 +}信号的持续时间也受到了幼苗在测量过程中的条件。发光或荧光信号可以随时间而减少由于刺激诱导的损伤，和/或激光诱导的光损伤在共焦成像的情况下。虽然不能避免刺激诱导的损伤，光毒性可以通过限制激光照射的强度和/或频率降低。此外，基于水母发光蛋白^钙记录系统需要重建的步骤。该中断CTZ到细胞和/或apoaequorin与CTZ的反应扩散的因素会影响被直接相关^的 Ca ^{2 +}浓度的发光信号。因此CTZ的浓度，以及在持续时间和CTZ培养条件需要为最佳的灵敏度和reproducibil进行优化性。遗传编码^的 Ca ^{2 +}指示剂可以不准确地报告细胞^的 Ca ^{2 +}浓度为其它原因，包括非预期靶向于特定的亚细胞区室，温度敏感性，或记者与蜂窝内Ca2 +信号用机械²³的干扰。我们发现，水母发光蛋白或Case12表达的植物都没有明显的形态或条件的表型，例如改变的抗逆性。因此，这是不可能的，这些基因编码的^钙指标产生重大干扰与^钙在植物体内的信号。

总之，我们在这里提出的使用2 ^的 Ca ^{2 +}检测系统的详细说明同时在整个植物幼苗和亚细胞水平的测量空间和时间上^的 Ca ^{2 +}信号。这两个系统可以被用于确定组织（或细胞类型）或刺激特定^的 Ca ^{2 +}具有高灵敏度的动态模式和重现性。因此，它们可用于阐明背后^的 Ca ^{2 +}信号传导响应于各种环境线索的基因网络的有力工具。

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Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm x 10 cm square Petri dish	VWR	60872-310
Adhesive film	VWR	60941-062
Polyethylene tubing	PerkinElmer	9908265
1 ml syringe	VWR	53548-000
Silicone grease	Beckman	335148
2-well chambered cover glass	Nalge Nunc international	155379
8-well chambered cover glass	Nalge Nunc international	155409
Luminescence imaging system	Princeton Instruments	N/A
Inverted confocal laser-scanning microscope	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon A1R
Imaging software	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon Elements
DataGraph	Visual Data Tools Inc	N/A	DataGraph 3.1.1 is the newest version
Coelenterazine	NanoLight Technolgies	#301B NF-BCTZ-FB
All purpose bleach	Any local store	N/A
Triton X-100	Fisher	BP151500
MS salt	Phytotechnology Labs	M524-50L
Sucrose	VWR	BDH8029-12KG
Agar	Sigma	A1296-5KG
Phytagel	Sigma	P8169-1KG