Summary
Ca2 + signalering reguleert diverse biologische processen in planten. Hier presenteren we benaderingen voor het toezicht op abiotische stress geïnduceerde ruimtelijke en temporele Ca2 + signalen in Arabidopsis cellen en weefsels met behulp van de genetisch gecodeerde Ca 2 +-indicatoren Aequorin of Case12.
Abstract
Ontwikkelings-en omgevingsfactoren veroorzaken Ca 2 + schommelingen in plantencellen. Stimulus-specifieke ruimtelijke en temporele Ca 2 + patronen worden waargenomen door cellulaire Ca2 +-bindende eiwitten die Ca 2 + signaleringscascades initiëren. We weten echter nog weinig over hoe stimulus specifieke Ca 2 +-signalen worden gegenereerd. De specificiteit van een Ca2 + signaal kan worden toegeschreven aan de verfijnde regulering van de activiteit van Ca2 + kanalen en / of transporteurs in reactie op een bepaalde stimulus. Om deze cellulaire componenten te identificeren en begrijpen van hun functies, is het cruciaal om systemen die een gevoelige en robuuste opname van Ca 2 +-signalen op zowel het weefsel en cellulaire niveau te gebruiken. Genetisch gecodeerd Ca 2 +-indicatoren die gericht zijn op verschillende cellulaire compartimenten hebben een platform voor live cell confocale beeldvorming van cellulaire Ca2 + signalen voorzien. Hier beschrijven we instructies voor het gebruik van twee Ca 2 + detectiesystemen: aequorin gebaseerd FAS (film lijm zaailingen) luminescentie Ca 2 + imaging en case12 gebaseerd live cell confocale fluorescentie Ca 2 + imaging. Luminescentie beeldvorming met behulp van de FAS-systeem biedt een eenvoudige, robuuste en gevoelige detectie van de ruimtelijke en temporele Ca 2 +-signalen op het weefsel niveau, terwijl de live cell confocale beeldvorming met behulp Case12 biedt gelijktijdige detectie van cytosol en nucleaire Ca 2 +-signalen met een hoge resolutie.
Introduction
De plant cel reageert op het milieu via signalering die cel acties coördineert. Een vroege signaaltransductie gebeurtenis in antwoord op omgevingsstimuli een voorbijgaande Ca2 + stijging. Het patroon, of de handtekening van een tijdelijke toename van vrije Ca 2 +-concentratie wordt gekenmerkt door zijn amplitude, frequentie en duur. Verschillende ruimtelijke en temporele Ca 2 + handtekeningen regelen verschillende cellulaire activiteiten 1. Specifieke stimuli, zoals hitte, kou, zout, droogte, licht, of plantenhormonen, kunnen fine-tunen van de ruimtelijke en temporele activiteit van gelokaliseerde Ca 2 +-kanalen en / of vervoerders, wat resulteert in specifieke Ca 2 + handtekeningen. Hoewel Ca 2 + transporters zijn goed gekarakteriseerd, is er weinig bekend over de moleculaire identiteit en de hoedanigheid van de Ca 2 +-kanalen in planten 1. Genetische screens voor mutanten met veranderde Ca2 + respons op stimuli benadrukken kan een effectieve ca. zijnOACH voor het identificeren van de componenten die Ca 2 + handtekeningen te componeren. Onlangs gebaseerd verscheidene aequorine Ca2 detectiesystemen ontwikkeld dat genetische screens vergemakkelijken Ca2 + signaleringscomponenten in reactie op pathogenen attack en abiotische stress 2-4.
Aequorine werd eerst gebruikt voor het detecteren Ca2 + signalen in planten in de vroege jaren 1990 5. Sindsdien aequorine is gericht op verschillende cellulaire compartimenten, zoals het cytoplasma 5, 6 nucleus, chloroplasten 7, tonoplast 8, 9 mitochondria en stroma 10, alsmede verschillende celtypen in de root celspecifieke Ca 2 monitoren + signalen 11. Aequorin gebaseerd Ca 2 + metingen onthullen de ruimtelijke en temporele Ca2 + respons van een populatie van cellen op stimuli benadrukken. In de meeste gevallen, de Ca2 + responsen van afzonderlijke cellen unsynchronized in de reagerende weefsel 4. Daarom garandeert Aequorin Ca 2 + opname niet noodzakelijk verslag van de Ca 2 + signaal in individuele cellen. In de afgelopen jaren, genetisch gecodeerde fluorescent eiwit (FP) gebaseerde Ca2 + indicatoren, zoals geel kameleon (YC) 12 en gevallen12 13 zijn gebruikt om Ca 2 + studeren signalerend met hoge subcellulaire resolutie. YCS zijn fluorescentie resonantie energie-overdracht (FRET) gebaseerde Ca 2 +-indicatoren, met GVB en YFP varianten toegevoegd door de Ca 2 + -bindende eiwit calmoduline en-calmoduline bindingspeptide M13. Calmoduline ondergaat een vormverandering als het bindt aan Ca 2 +, daardoor brengt GVB en YFP dichter bij elkaar, wat resulteert in een verhoogde energie-overdracht (verbeterde FRET). De FRET level tijd, ruwweg berekend als de verhouding van YFP de GVB signaalintensiteiten, weerspiegelt de intracellulaire Ca2 + dynamiek. Verschillende YC versies zijn gebruikt in planten. YC3.6 was targeted naar het cytosol 14,15, kern 16, mitochondria 17 en plasmamembraan 18, en YC4.6 en D4ER waren gericht naar de ER 15,19, en D3cpv was gericht op de peroxisomen 20. Transgene planten die YCS laat de live-cell imaging van Ca 2 + dynamiek binnen de verschillende cellulaire compartimenten van verschillende celtypen. CASEs (vermoedelijk Ca lcium se nsor) zijn enkel circulair gepermuteerde fluorescerende eiwitten (cpFPs) drager zijn van een calmoduline en-calmoduline bindingspeptide M13. Na binding aan Ca2 + CASEs conformationele veranderingen ondergaan, leidend tot een toename van fluorescentie-intensiteit. De correlatie tussen fluorescentie respons van de behuizing en Ca2 + concentratie maakt intracellulair Ca2 + dynamiek kwantitatief te meten. De Case12 variant heeft 12-voudige toename van fluorescentie in de Ca 2 + -saturated vormen. N. benthiminana planten kortstondig expressing Case12 of Arabidopsis planten stabiel tot expressie Case 12 werden gebruikt om Ca 2 + signalering studeren in de verdediging en abiotische stress 4,21. Asynchrone ruimtelijke en temporele Ca 2 +-oscillaties in de cellen reageren op pathogeen aanval, of om uitdroging van stress zijn geopenbaard met Case12 gebaseerd Ca 2 + imaging.
Hier, gedetailleerde instructies voor Aequorin gebaseerd luminescentie beeldvorming van weefsel-en stimuli specifieke Ca 2 + dynamiek in Arabidopsis zaailingen, en voor confocale beeldvorming van cytosol en nucleaire Ca presenteren we 2 + dynamiek in Arabidopsis wortel cellen die zaak 12 luminescentie beeldvorming van FAS uiten kan worden aangepast aan de stress geïnduceerde Ca2 + dynamiek analyseren intacte planten of weefsels hier niet beschreven, of aan gemutageniseerde Arabidopsis plantpopulaties screenen voor mutanten met veranderde stress veroorzaakte Ca 2 +-signalen. De live cell Ca 2 + imaging setup kan worden aangepast aan Ca analyseren2+ dynamiek binnen de verschillende subcelluar compartimenten of in verschillende celtypes met andere Ca 2 +-indicatoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Aequorin Based Ca 2 + Imaging Met behulp van de FAS-systeem
- Bereid zaailingen voor luminescentie beeldvorming. Steriliseren zaden van Arabidopsis planten die Aequorin met 10% bleekwater oplossing met 0,01% Triton-100. Zaai de steriele zaden op een vierkante plaat (10 x 10 cm vierkante Petrischaal met rooster) met volle sterkte MS (Murashige en Skoog basaal zoutmengsel), 1% sucrose en 1,2% agar. Plaats platen verticaal in een groeikamer na stratificatie bij 4 ° C gedurende 2 dagen (Figuur 1A).
- Breng de zaailingen op een film. Een zelfklevende folie (Figuur 1B) bovenop 7-10 dagen oude zaailingen groeien op de plaat. Duw de film van de hand om ervoor te zorgen dat de zaailingen zich houden aan de film (figuur 1C). Schil de film voorzichtig zodat de zaailingen blijven gehandeld op grond van de film (figuur 1D en 1E)
- Incubeer de zaailingen met cofactor. Leg het eendhered zaailingen op de vierkante plaat (10 x 10 cm) die 15 ml van 2 ug / ml h-CTZ (coelenterazine) in water. Incubeer de zaailingen bij kamertemperatuur gedurende 4 uur gedurende de nacht (Figuur 1F).
- Bereid je voor op luminescentie beeldvorming. Neem de film uit de h-CTZ oplossing en snijd het in het midden, de vorming van twee stukken. Leg elk stuk van de film met zaailingen zijde naar boven in twee verschillende platen. Laat de platen in het donker gedurende 5 minuten.
- Acquire luminescentie afbeeldingen. In het donker plaats de twee platen naast elkaar op het stadium van het luminescentiebeeldvorming (figuur 1G). Acquire beelden onmiddellijk na toevoeging van 20 ml van stimuli oplossing aan de platen tegelijk.
- Analyseer luminescentie afbeeldingen. Kies dezelfde weergave bereik voor alle luminescentie afbeeldingen. Snijd de regio van belang (ROI) en het genereren van de beelden als JPEG-bestanden (Figuur 2A). Als alternatief, exporteren de beelden als SPE-bestanden en ze te importeren in deImageJ beeldanalyse software. Set metingen voor de berekening van de gemiddelde grijswaarde van ROI. Selecteer dezelfde grootte van ROI gebied en meet de gemiddelde grijze en presenteren van gegevens als staafdiagrammen (figuur 2B).
2 live cell confocale Imaging Ca 2 +
- Bereid zaailingen voor confocale beeldvorming. Steriliseren zaden van Arabidopsis planten die case12 met 10% bleekwater oplossing met 0,01% Triton. Zaai de steriele zaden op een plaat met full kracht MS-zouten, 1% sucrose en 1,2% agar. Plaats platen verticaal in een kweekkamer na stratificatie bij 4 ° C gedurende 2 dagen.
- Setup Imaging Chambers
- Monteer een imaging kamer met een glijbaan en dekglaasje (kamer A). Leg een stuk water gedrenkt watten op het midden van de dia. Daarna brengt een of twee 5 dagen oude zaailingen van de plaat op de bovenkant van water gedrenkt watten. Plak kleine stukjes klei elke hoek van een dekglaasje, eend plaats dekglaasje bovenop zaailingen een spleet (ruimte) tussen het dekglaasje en schuif (figuur 3A, linkerpaneel) creëren. Sluit een uiteinde van polyethyleen buis (0,58 mm diameter) met een 1 ml spuit en plaats het andere uiteinde van buis direct naast de kamer. Houd de slang vast met tape (Figuur 3A, rechter paneel).
- Monteer een imaging kamer met behulp van een kamer van plexiglas (kamer B).
- Een dun laagje siliconenvet ongeveer twee polyethyleenbuizen (0,58 mm diameter) en druk op de gecoate buizen in de kanalen aan elke zijde van de kamer van plexiglas (Figuur 3B linkerpaneel). Een dun laagje siliconen vet op het oppervlak van de kamer die de buis groeven bevat en op een dekglaasje aan het vet een zijde van de kamer opening (uitgesneden) te verzegelen.
- De overdracht van een vijf dagen oude zaailing van de plaat in de kamer en leg een stukje watten gedrenkt met water op de top of de zaailing. Verspreid siliconenvet op het andere oppervlak van de kamer, en de druk op een andere dekglaasje op de top te dichten. Sluit het uiteinde van een van de buizen een 1 ml spuit. Laat het uiteinde van de andere buis open (figuur 3B rechter paneel).
- Bereid een imaging kamer met behulp van een chambered afdekglas (kamer C). Steriliseer de chambered deksel glas met 70% ethanol en laat het op de motorkap tot het droog is. Voeg 0,6 ml of 0,2 ml onverdund MS medium bevattende 1% sucrose en 0,5% Phytagel in elk putje van een 2-well ruimte of 8-well kamer (Figuur 3C rechter paneel), respectievelijk. Steriliseren zaden en zaaien direct in een chambered deksel glas met een dunne laag van heldere gel en laat ze verticaal groeien gedurende 5 dagen (Figuur 3C).
- Verwerven van beelden met behulp van een confocale microscoop. Om stress stimuli, zoals zout, koud of peroxide toepassen injecteer langzaam ongeveer 200 ui 150 mM NaCl, ice-cold water of 1 mM H 2 O 2-oplossing in de kamer (kamer A of B) vlak voor het ophalen van afbeeldingen of zacht voeg 500 ul of 100 ul stimulus oplossing voor het putje van een 2 of 8-well kamer, respectievelijk . Maak foto's onmiddellijk na het aanbrengen van de stimulus-oplossing met behulp van een omgekeerde Nikon A1R confocale laser scanning microscoop met een 20X water immersie objectief (numerieke apertuur 0.75). Verzamel een tijdreeks afbeeldingen 4 sec intervallen met excitatie en emissie golflengten van 488 nm en 500-550 nm, respectievelijk, en met een resolutie van 512 x 512.
- Beeldanalyse
Met Nikon Elements, ROI's werden getrokken rond elke cel (of het oppervlak) van belang. Totaal intensiteit in elk ROI gemeten tijd met het dialoogvenster tijdmeting box (ImageJ kunnen in plaats daarvan worden gebruikt). Totale intensiteit metingen werden uitgevoerd en verwerkt in Datagraph. Ca 2 + spike amplitude werd gedefinieerd als de piek intensiteit min rusten intensiteit, duur als the tussen aanvang en de voltooiing van een piek, en zolang de tijdsinterval tussen aangrenzende piek pieken van twee pieken. t-test werd gebruikt om de gemiddelden te vergelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mannitol, NaCl en H 2 O 2 werden gebruikt als proxies voor uitdroging, zout en oxidatieve stress stimuli, respectievelijk. Om te controleren of de zware metaalionen CU2 + synergie met een van deze drie stressstimuli vergeleken we de Ca2 + voor iedere stimuli in de aanwezigheid of afwezigheid van Cu2 +. Zoals getoond in figuur 2, FAS luminescentiebeeldvorming gebleken dat Arabidoposis zaailingen anders reageerde op uitdroging, zout en oxidatieve stress. Voor de concentratie van stimuli we onderzocht in deze studie, 75 mM NaCl veroorzaakte de sterkste Ca2 + respons in bladeren en wortels tijdens de eerste 40 seconden blootstelling (Figuur 2A middenpaneel en figuur 2B), en 1 mM H 2 O 2 induceerde een sterke Ca2 + respons zowel in bladeren en wortels in de eerste en tweede 40 seconden (Figuur 2A rechter paneel). De oplossing van 400 mM mannitol alleen geïnduceerdCa 2 + respons in de wortels tijdens de eerste jaren '40 en de zeer zwakke signalen in de bladeren tijdens de tweede 40 sec. Cu2 + sterk verhoogd de amplitudes en de duur van Ca2 + signalen veroorzaakt door NaCl en mannitol (Figuur 2A linkerpaneel). Het blijkt dat Cu2 had remmende effecten op H 2 O 2 geïnduceerde Ca2 +-signalen, waardoor zowel de amplitude en duur (figuur 2A en 2B rechter paneel).
Met behulp Case12 uiten Arabidopsis planten, we gemeten Ca 2 + dynamiek in het cytosol en de kernen tegelijk. Molecuulgewicht van Case12 is 46 kDa, dus transgene planten die Case12 hebben GFP signalen in zowel het cytosol en kernen van blad en wortel-cellen (Figuur 4A). Maat (figuur 3A en 3B) of kamers van koophandel (Figuur 3C) werden gebruikt voor live-cell imaging met een confocalemicroscoop. Toepassing van 150 mM NaCl om de zaailing in de kamer, we waargenomen veranderingen van de fluorescentie-intensiteit in zowel het cytosol en de kern van de afzonderlijke cellen (Figuur 4B en C; aanvullend Film 1). Met behulp van NIS-elementen (Imaging software, Nikon Instruments Inc), meten we de fluorescentie-intensiteit in de regio van belang (ROI) in de tijd. De amplitude, duur en frequentie van het cytosol en nucleaire Ca 2 + oscillatie worden grafisch weergegeven in Figuur 4B. De amplitude en de duur van Ca2 + pieken in het cytoplasma en kernen varieert sterk tussen cellen van dezelfde stam, als tussen cellen in verschillende wortels. De amplitude en periode van cytosolische Ca 2 + spikes waren 60.36 ± 45.22 AU (willekeurige eenheid) en 58.24 ± 15.70 sec, respectievelijk. De amplitude en de periode van de nucleaire Ca 2 + spikes waren 316,26 ± 75,24 (AU) en 61.71 ± 16.31 sec, respectievelijk. In contrast, deduur van het cytosol en nucleaire Ca 2 + spikes waren vergelijkbaar tussen de cellen, die 17.43 ± 3.67 sec en 17,33 ± 2 sec, respectievelijk waren. De amplitude van Ca2 + spikes verminderden in de tijd, die door zijn om de verandering van het brandvlak en / of verlies van respons op stimuli vanwege een ongunstige in vitro toestand benadrukken. Deze resultaten tonen dat zoutstress veroorzaakt Ca2 oscillatie in zowel het cytoplasma en de kern.
Figuur 1 Aequorin gebaseerd FAS-systeem voor het meten van de ruimtelijke en temporele Ca 2 + dynamieken in respons op stimuli benadrukken. A) Kweek Arabidopsis zaailingen verticaal op een plaat met MS-medium. B, C) Een kleeffolie (B) aan de bovenzijde van zaailingen (C). D, E) F) Incubeer zaailingen gehecht aan de film met 2 ug / ml h-CTZ in water gedurende 4 uur. G) Snij de film door het midden en plaats elk stuk in een ander lege bord. Laat de platen in het donker gedurende 5 minuten. Solliciteer tegelijk bedienen en stimuli oplossingen (zorg ervoor dat de zaailingen worden volledig bedekt), en onmiddellijk te verwerven beelden. De schaal bar is 5 cm.
Figuur 2 Vergelijking van de ruimtelijke en temporele Ca2 + respons van 10 dagen, zaailingen van verschillende stress-stimuli. A) Een tijdreeks van luminescentie beelden van zaailingen blootgesteld aan 400 mM mannitol en 400 mM mannitol plus 1 mM CuCl 2 (A, linker paneel), 75 mM NaCl en 75 mM NaCl en 1 mM CuCl2 (A, middelste paneel), en 1 mM H 2 O 2 of 1 mM H 2 O 2 plus 1 mM CuCl2 (A, rechter paneel). Bovenste en onderste panelen van A zijn luminescentie beelden tijdens de eerste 40 seconden en de tweede 40 seconden, respectievelijk verworven. Een intensiteitsschaal geeft aan een toename van luminescentie signalen van laag (zwarte) naar hoog (wit). B) Staafdiagram gemiddelde luminescentie-intensiteit van zaailingen in reactie op de aangegeven stressstimuli.
Figuur 3 Instellen van een live cell confocale beeldvorming experiment. A) Een aangepaste kamer wordt gebouwd met een glijbaan, dekglaasje met vier stukken van klei en watten. Twee 5 dagen oude zaailingen worden op de dia geplaatst. Een uiteinde van een polyethyleen buis geplaatst naast de samengestelde kamer en vasteeen stukken tape terwijl het andere uiteinde is verbonden met een 1 ml injectiespuit. B) Een aangepaste glijbaan met plexiglas een open kamer in het midden en twee kanalen die zijn verbonden met beide zijden van het kanaal. Een dekglaasje wordt bovenop de dia gebracht en twee polyethlene buizen in het kanaal geplaatst. Dekglaasje en buizen worden gefixeerd in de positie met siliconenvet. Het einde van een van de buizen is verbonden met een 1 ml spuit en het einde van een buis open blijft. Een 5 dagen oude zaailingen geplaatst in de kamer en een coveslip wordt bovenop de zaailing geplaatst en afgedicht met siliconenvet. De plexigalss dia met gemonteerde kamer rust op het stadium van de microscoop. C) Arabidopsis zaailingen worden gekweekt in twee putjes (links) of 8 putjes (rechts) van de chambered dekglaasje met een dunne laag van 0,6% Phytagel in MS media.
Figuur 4 cytosolische en nucleaire Ca2 + oscillatie in reactie op zoutstress. A) confocale beelden tonen dat Case12 wordt uitgedrukt in het cytoplasma en kernen van wortelcellen (linker paneel) en blad-cellen (rechter paneel) van transgene planten die Case12. Het beeld op het rechter paneel is een samengevoegde afbeelding van rode autofluorescentie van de chloroplasten en groene fluorescentie van Case12. B) Zout stress (150 mM NaCl) geïnduceerde Ca2 + oscillatie in het cytosol (bovenste paneel) en kernen (onderste paneel) van wortelcellen. Locaties van de gemeten cellen worden aangegeven met pijlen met nummers op paneel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hebben een FAS-systeem gedemonstreerd voor het opnemen van de ruimtelijke en temporele Ca2 + respons van Arabidopsis zaailingen. Deze FAS Ca2 + opnamesysteem een eenvoudige, gevoelige en robuuste benadering die kan worden aangepast voor het meten Ca2 + dynamica veroorzaakt door verschillende stimuli naast de abiotische stress stimuli die hier worden gepresenteerd. Met behulp van dit systeem kunnen we gemakkelijk weefsel-of stimuli-specifieke ruimtelijke en temporele Ca 2 + dynamiek te vergelijken bij de hele plant. De hoge gevoeligheid van FAS maakt het gebruik van lage intensiteit stimuli voor de behandeling Ca2 + respons, wat belangrijk is voor het vermijden van artefacten veroorzaakt door fysische schade aan cellen bij hoge intensiteit spanning wordt gebruikt. Zeven tot 10 dagen oude Arabidopsis zaailingen toonden weefsel of stimuli-specifieke Ca2 + respons, hoewel zaailingen in verschillende fysiologische stadia verschillende sensitiviteit en specificiteit kunnen hebben reactie op een bepaalde stimulus. Daarom isvoorkeur 7-10 dagen oude zaailingen om de doorvoer van FAS metingen, waarbij ongeveer 100 zaailingen kunnen worden gehecht aan een stuk film te verhogen. Samen met gemakkelijke en eenvoudige prestaties, een hoge gevoeligheid en reproduceerbaarheid, kon het FAS-systeem ook aangepast worden voor het screenen EMS gemutagéniseerd mutanten voor veranderde Ca 2 + reacties. Voor screening doeleinden, is het cruciaal om een uniforme zaailingen die goed worden geteeld op het bord en gehecht aan de film hebben. Vier tot vijf uur incubatie van de film gehandeld zaailingen met h-CTZ is meestal voldoende voor de reconstructie van aequorine. De zelfklevende film met gaten voorkeur vanwege reactie van apoaequorine en cofactor vereist zuurstof. Voor de vergelijking van weefsel of stimuli-specifieke Ca2 + responsen middels groepen zaailingen afkomstig uit dezelfde film is essentieel omdat de toestand van zaailingen en / of de reconstitutie toestand kan de totale hoeveelheid functioneel aequorine beïnvloeden. Wanneer deze requiremegen is voldaan, het verschil in luminescentie reactie evenredig is met de weefselspecifieke of stimulus-specifieke Ca2 + respons.
Aequorine-gebaseerde meting van Ca2 + signalen weerspiegelen de respons van een populatie van cellen. Echter, gezien de heterogeniteit van celtypen en / of de verschillende toegankelijkheid van cellen in het weefsel van de stimuli, de resultaten van de aequorine-gebaseerde Ca2 + metingen niet gelijk aan het gedrag volgens een cel. Inzicht Ca2 + dynamiek op celniveau is een Ca2 + indicator die kan worden gedetecteerd met subcellulaire resolutie. Confocale live cell imaging van fluorescentie-eiwit (FP) gebaseerde Ca 2 +-indicatoren biedt een geavanceerde Ca 2 + detectie systeem voor het opnemen van cellulaire Ca 2 + dynamiek met cellulaire resolutie in een gewenste weefsel. Hier, met behulp van confocale live cell imaging en FP gebaseerde Ca 2 +-indicatoren, noteerden we subcellulaire Ca2 + + indicatoren zijn geïmplementeerd planten met verschillende kenmerken. Vergeleken met YCS, single-GFP gebaseerde Ca 2 +-indicator heeft een aantal voordelen: 1 Case12 niet YFP en CFP filter sets of de vele aannames en complexe berekeningen die nodig zijn om FRET 22 meten vereisen. Case12 heeft enkele excitatie / emissie maxima en kan gemakkelijk worden gedetecteerd met standaard GFP filterset. 2 Case12 stabiel onder fysiologische pH, en is een relatief klein eiwit (46 kDa). Uitgedrukt in planten lijkt ongerichte Case12 in het cytoplasma en de kern, zodat Case12 transgene planten kunnen worden gebruikt om cytosolische en nucleaire Ca2 + dynamiek tegelijkertijd volgen. Een nadeel van deze reporter is dat het een niet-ratiometrische indicator, zodat fluorescentie niveaus worden ook beïnvloed door factoren die geen verband houden met Ca2 + concentratie, zoals het expressieniveau vanCase12 en lokale pH. Niettemin Case12 voldoende cellulaire Ca2 +-concentratie voor de vergelijking van ruimtelijke en temporele Ca2 + dynamiek in het cytoplasma en organellen tussen materialen met verschillende genetische achtergronden onder dezelfde meetcondities te bepalen. In de toekomst nieuwe GFP gebaseerde Ca2 + indicatoren met hogere signaal-ruisverhouding, snelle kinetiek en grotere respons, zoals GCaMP3 24 en GCaMP5 25 aangetoond bij dieren, kan beter indicatoren voor het opnemen of subcelluar cellulaire Ca2 + dynamiek planten.
De Aequorin en Case12 detectiesystemen hier beschreven bieden destructieve in vivo benaderingen voor het meten van de ruimtelijke en temporele Ca 2 + dynamiek op de hele zaailing en subcellulaire niveau, respectievelijk. In beide systemen, kan de fysiologische toestand of groeiomstandigheden invloed op de Ca 2 + reacties van de zaailingen of cellen. Als Physically beschadigd of niet gegroeid in een goede staat, kunnen cellen hebben zwakke of zelfs geen Ca 2 + reacties. Bovendien zijn de duur van het ruimtelijke en temporele Ca2 + signalen ook beïnvloed door de omstandigheden van de zaailing tijdens de metingen. De luminescentie of fluorescentiesignalen kunnen tijd afnemen door stimuli-geïnduceerde schade en / of laser-geïnduceerde foto-schade bij confocale beeldvorming. Hoewel van stimulus geïnduceerde schade niet kan worden vermeden, kan fototoxiciteit worden verminderd door het beperken van de intensiteit en / of frequentie van de blootstelling laser. Bovendien aequorine-gebaseerde Ca2 + opname-stelsel een reconstitutie stap. Factoren die de diffusie van CTZ de cel en / of reactie van apoaequorine met CTZ onderbreken zou hebben luminescentiesignalen die direct gerelateerd zijn aan Ca2 + concentratie. Daarom is de concentratie van CTZ, alsook de omgeving en de CTZ incubatie moeten worden geoptimaliseerd voor de beste gevoeligheid en reproducibilteit. Genetisch gecodeerde Ca2 + indicatoren kunnen onnauwkeurig bericht cellulaire Ca2 + concentraties om andere redenen, waaronder onbedoelde richten naar specifieke subcellulaire compartimenten, temperatuurgevoeligheid, of interferentie van de reporter met de cellulaire Ca2 + machines 23. We vonden dat Aequorin of Case12 uiten planten hebben geen duidelijke morfologische of voorwaardelijke fenotypes, zoals veranderde stresstolerantie. Daarom is het onwaarschijnlijk dat deze genetisch gecodeerde Ca2 + indicatoren grote verstoringen van Ca2 + signalering in planten.
Samengevat, geven we hier gedetailleerde instructies voor het gebruik van twee Ca2 + detectiesystemen voor het meten ruimtelijke en temporele Ca2 + signalen op zowel de hele plant zaailing en subcellulaire niveaus. Beide systemen kunnen worden gebruikt om weefsel (of celtype) of stimuli-specifieke Ca2 + dynamische patronen met een hoge gevoeligheid te bepalen enreproduceerbaarheid. Daarom zijn ze krachtige tools voor het ophelderen van de gen-netwerken die Ca 2 + signalering ten grondslag liggen naar aanleiding van verschillende omgevingsfactoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm x 10 cm square Petri dish | VWR | 60872-310 | |
| Adhesive film | VWR | 60941-062 | |
| Polyethylene tubing | PerkinElmer | 9908265 | |
| 1 ml syringe | VWR | 53548-000 | |
| Silicone grease | Beckman | 335148 | |
| 2-well chambered cover glass | Nalge Nunc international | 155379 | |
| 8-well chambered cover glass | Nalge Nunc international | 155409 | |
| Luminescence imaging system | Princeton Instruments | N/A | |
| Inverted confocal laser-scanning microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon A1R |
| Imaging software | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Elements |
| DataGraph | Visual Data Tools Inc | N/A | DataGraph 3.1.1 is the newest version |
| Coelenterazine | NanoLight Technolgies | #301B NF-BCTZ-FB | |
| All purpose bleach | Any local store | N/A | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151500 | |
| MS salt | Phytotechnology Labs | M524-50L | |
| Sucrose | VWR | BDH8029-12KG | |
| Agar | Sigma | A1296-5KG | |
| Phytagel | Sigma | P8169-1KG |
References
- Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. Calcium signals: the lead currency of plant information processing. Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).
- Pan, Z., Zhao, Y., Zheng, Y., Liu, J., Jiang, X., Guo, Y. A high-throughput method for screening Arabidopsis mutants with disordered abiotic stress-induced calcium signal. J. Genet. Genomics. 39 (5), 225-235 (2012).
- Ranf, S., et al. Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana. Mol. Plant. 5 (1), 115-130 (2012).
- Zhu, X., Feng, Y., Liang, G., Liu, N., Zhu, J. K. Aequorin-based luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Mol. Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
- Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).
- Van der Luit, A. H., Olivari, C., Haley, A., Knight, M. R., Trewavas, A. J. Distinct calcium signalling pathways regulate calmodulin gene expression in tobacco. Plant Physiol. 121 (3), 705-714 (1999).
- Johnson, C. H., et al. Circadian oscillations of cytosolic and chloroplastic free calcium in plants. Science. 269 (5232), 489-503 (1995).
- Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signature after acclimation. Plant Cell. 8 (3), 489-503 (1996).
- Logan, D. C., Knight, M. R. Mitochondrial and cytosolic calcium dynamics are differentially regulated in plants. Plant Physiol. 133 (1), 21-24 (2003).
- Mehlmer, N., Parvin, N., Hurst, C. H., Knight, M. R., Teige, M., Vothknecht, U. C. A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot. 63 (4), 1751-1761 (2012).
- Kiegle, E., Moore, C. A., Haseloff, J., Tester, M. A., Knight, M. R. Cell-type-specific calcium responses to drought, salt and cold in the Arabidopsis root. Plant J. 23 (2), 267-278 (2000).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat. Protoc. 1 (3), 1057-1065 (2006).
- Souslova, E., et al. Single fluorescent protein-based Ca2+ sensors with increased dynamic range. BMC. Biotechnol. 7, 37-46 (2007).
- Tanaka, K., Swanson, S., Gilroy, S., Stacey, G. Extracellular nucleotides elicit cytosolic free calcium oscillations in Arabidopsis. Plant Physiol. 154 (2), 705-719 (2010).
- Iwano, M., et al. Fine-tuning of the cytoplasmic Ca2+ concentration is essential for pollen tube growth. Plant Physiol. 150 (3), 1322-1334 (2009).
- Sieberer, B., Chabaud, M., Timmers, A., Monin, A., Fournier, J., Barker, D. A nuclear-targeted Cameleon demonstrates intranuclear Ca2+ spiking in Medicago truncatula root hairs in response to rhizobial nodulation factors. Plant Physiol. 151 (3), 1197-1206 (2009).
- Loro, G., Drago, I., Pozzan, T., Lo Schiavo, F., Zottini, M., Costa, A. Targeting of Cameleons to different subcellular compartments reveals a strict cytoplasmic/mitochondrial Ca2+ handling relationship in plant cells. Plant J. 71 (1), 1-13 (2012).
- Krebs, M., et al. FRET-based genetically encoded sensors allow high-resolution live cell imaging of Ca2+ dynamics. Plant J. 69 (1), 181-192 (2012).
- Bonza, M. C., Loro, G., Behera, S., Wong, A., Kudla, J., Costa, A. Analyses of Ca2+ accumulation and dynamics in the endoplasmic reticulum of Arabidopsis root cells using a genetically encoded Cameleon sensor. Plant Physiol. 163 (3), 1230-1241 (2013).
- Costa, A., et al. H2O2 in plant peroxisomes: An in vivo analysis uncovers a Ca2+ dependent scavenging system. Plant J. 62 (5), 760-772 (2010).
- Zhu, X., Caplan, J., Mamillapalli, P., Czymmek, K., Dinesh-Kumar, S. P. Function of endoplasmic reticulum calcium ATPase in innate immunity-mediated programmed cell death. EMBO J. 29 (5), 1007-1018 (2010).
- Roszik, J., Lisboa, D., Szöllosi, J., Vereb, G. Evaluation of intensity-based ratiometric FRET in image cytometry--approaches and a software solution. Cytometry A. 75 (9), 761-767 (2009).
- Kotlikoff, M. I. Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology. J. Physiol. 578 (Pt 1), 55-67 (2007).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
