Summary
Ca 2 +-signalering regulerer forskellige biologiske processer i planter. Her præsenterer vi tilgange til overvågning af abiotisk stress induceret rumlige og tidslige Ca 2 +-signaler i Arabidopsis celler og væv ved hjælp af genetisk indkodede Ca 2 + indikatorer aequorin eller Case12.
Abstract
Developmental og miljømæssige signaler inducerer Ca 2 + udsving i planteceller. Stimulus-specifikke rumlige-temporale Ca 2 + mønstre sanses af cellulære Ca 2 +-bindende proteiner, der initierer Ca 2 + signaleringskaskader. Men vi stadig ved meget lidt om, hvordan stimulus specifik Ca2 + signaler genereres. Specificiteten af en Ca 2 +-signal kan tilskrives den sofistikerede regulering af aktiviteterne i Ca 2 + kanaler og / eller transportvirksomheder som reaktion på en given stimulus. At identificere disse cellulære komponenter og forstå deres funktioner, er det afgørende at anvende systemer, der tillader en følsom og robust optagelse af Ca 2 +-signaler på både væv og cellulære niveauer. Genetisk indkodede Ca 2 + indikatorer, der er målrettet til forskellige cellulære rum har givet en platform for levende celle konfokal billeddannelse af cellulære Ca 2 +-signaler. Her beskriver vi instruktions for anvendelsen af to Ca 2 + detektionssystemer: aequorin baserede FAS (film selvklæbende frøplanter) luminescens Ca 2 + billedbehandling og case12 baseret levende celler konfokal fluorescens Ca 2 + billeddannelse. Luminescensdatering billeddannelse ved hjælp af FAS-systemet giver en enkel, robust og følsom påvisning af rumlige og tidslige Ca 2 + signaler på vævet niveau, mens levende celler konfokal billeddannelse ved hjælp Case12 giver samtidig påvisning af cytosol og nukleare Ca 2 +-signaler i en høj opløsning.
Introduction
Plantecellen reagerer til miljøet via signalering, som koordinerer cellehandlinger. En tidlig cellesignalerende begivenhed i respons på stimuli af miljøet er en forbigående Ca2 + stigning. Mønstret eller underskrift af en forbigående stigning i fri Ca2 +-koncentration er kendetegnet ved sin amplitude, frekvens og varighed. Tydelige spatio-temporale Ca 2 + signaturer regulerer forskellige cellulære aktiviteter 1. Specifikke stimuli, såsom varme, kulde, salt, tørke, lys eller plante hormoner, kan finjustere spatio-temporale aktivitet af membran-lokaliserede Ca 2 + kanaler og / eller transportvirksomheder, hvilket resulterer i specifikke Ca 2 + underskrifter. Selvom Ca 2 + transportører er blevet godt karakteriseret, er lidt om de molekylære identiteter og funktioner af Ca 2 + kanaler i planter 1. Genetiske skærme for mutanter med ændret Ca2 + reaktion på stress stimuli kan være en effektiv ca.oach til at identificere de komponenter, der udgør Ca 2 + signaturer. For nylig flere aequorin baserede Ca 2 + detection systemer er blevet udviklet, der letter genetiske skærme for Ca 2 + signalering komponenter som reaktion på patogen angreb og abiotisk stress 2-4.
Aequorin blev første gang brugt til at detektere Ca 2 +-signaler i planter i begyndelsen af 1990'erne 5. Siden da har aequorin blevet målrettet til forskellige cellulære rum, såsom cytoplasmaet 5 kerne 6, chloroplaster 7, tonoplast 8 mitokondrier 9 og stroma 10, såvel som til forskellige celletyper i roden at overvåge cellespecifik Ca 2 + signaler 11. Aequorin baserede Ca2 + målinger afslører den rumlige og tidsmæssige Ca 2 + svar af en population af celler til at understrege stimuli. Men i de fleste tilfælde Ca2 + reaktioner enkeltceller er unsynchroniZed i reagerer væv 4. Derfor er aequorin Ca2 + optagelse ikke nødvendigvis rapportere Ca 2 +-signalet i de enkelte celler. I de seneste år er genetisk kodet fluorescerende protein (FP) -baseret Ca2 + indikatorer, såsom gul cameleon (ycs) 12 og CASEs12 13 er blevet brugt til at studere Ca 2 +-signalering høj subcellulær opløsning. YCS er fluorescensresonansenergioverførsel (FRET) -baseret Ca 2 + indikatorer, som indeholder den fælles fiskeripolitik og YFP varianter forbundet af Ca 2 + -bindende protein calmodulin og calmodulin-bindende peptid M13. Calmodulin undergår en konformationsændring da det binder sig til Ca 2 +, hvilket bringer den fælles fiskeripolitik og YFP tættere sammen, hvilket resulterer i øget energioverførsel (forstærket FRET). Niveauet FRET over tid, beregnes omtrent som forholdet mellem YFP til FFP signalintensiteter afspejler intracellulær Ca2 + dynamik. Adskillige YC versioner er blevet anvendt i planter. YC3.6 var targeted til cytosolen 14,15, kerne 16, mitokondrier 17, og plasmamembranen 18 og YC4.6 og D4ER var rettet til skadestuen 15,19, og D3cpv var målrettet til de peroxisomer 20. Transgene planter, der udtrykker ycs tillader live-cell imaging af Ca 2 + dynamik inden for forskellige cellulære rum i forskellige celletyper. Sager (formodentlig Ca lcium selv nsor) er enkelt cirkulært permuteret fluorescerende proteiner (cpFPs) indeholdende et calmodulin og calmodulin-bindende peptid M13. Ved binding til Ca2 +, tilfælde undergår konformationsændringer, hvilket fører til en forøgelse af fluorescens intensitet. Korrelationen mellem taskens fluorescens respons og Ca 2 + koncentration tillader intracellulær Ca 2 + dynamik, der skal måles kvantitativt. Den Case12 variant har 12 gange øget fluorescens i Ca2 + Mættede former. N. benthiminana planter transient EXPREssing Case12 eller Arabidopsis planter stabilt udtrykker sag 12 blev brugt til at studere Ca 2 + signalering i forsvar og abiotisk stress 4,21. Asynkron rumlige og tidslige Ca 2 + svingninger i celler reagerer på patogen angreb, eller dehydrering stress er blevet afsløret med Case12 baserede Ca 2 + billeddannelse.
Her præsenterer vi detaljerede instruktioner til aequorin baseret luminescens billeddannelse af vævs- og stimuli specifik Ca 2 + dynamik i Arabidopsis kimplanter, og konfokal billeddannelse af cytosol og nuklear Ca 2 + dynamik i Arabidopsis rod celler, der udtrykker sag 12. Luminescence billeddannelse af FAS kan tilpasses til at analysere stress-induceret Ca2 + dynamik i intakte planter eller væv ikke er beskrevet her, eller til at screene mutageniserede Arabidopsis plante populationer mutanter med ændret stress induceret Ca2 +-signaler. Den levende celle Ca 2 + imaging setup kunne tilpasses til at analysere Ca2 + dynamik inden for forskellige subcelluar rum eller i forskellige celletyper ved hjælp af andre Ca 2 + indikatorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. aequorin Based Ca 2 + Imaging Brug FAS systemet
- Forbered stiklinger til luminescens billeddannelse. Steriliser frø af Arabidopsis planter udtrykker aequorin med 10% blegemiddel indeholdende 0,01% Triton-100. Sår sterile frø på en kvadratisk plade (10 x 10 cm kvadrat petriskål med gitter) indeholdende fuld styrke MS (Murashige og Skoog Basal Salt Blanding), 1% saccharose og 1,2% agar. Placer pladerne lodret i en vækst kammer efter stratificering ved 4 ° C i 2 dage (figur 1A).
- Overfør kimplanter på en film. Placer en klæbende film (figur 1B) på toppen af 7-10 dage gamle kimplanter, der vokser på pladen. Skub forsigtigt filmen ved hånden for at sikre, at frøplanter klæbe til filmen (Figur 1C). Skræl filmen forsigtigt, så de planter forblive klæbet til filmen (Figur 1D og 1E)
- Inkubér frøplanter med cofaktor. Placer endhered kimplanter onto firkantet plade (10 x 10 cm) indeholdende 15 ml 2 ug / ml h-CTZ (coelenterazin) i vand. Inkubér kimplanter ved stuetemperatur i 4 timer til natten over (figur 1F).
- Forbered luminescens billeddannelse. Tag filmen ud af h-CTZ løsning, og skære det ned i midten, danner to stykker. Placer hvert stykke film med frøplanter står op i to forskellige plader. Lad pladerne i mørke i 5 min.
- Acquire luminescens billeder. I mørke, placere to plader ved siden af hinanden på den fase af luminescens billeddannende system (figur 1G). Anskaf billeder umiddelbart efter tilsætning af 20 ml stimuli løsning til pladerne samtidig.
- Analyser luminescens billeder. Vælg det samme display interval for alle luminescens billeder. Beskær område af interesse (ROI) og generere billederne som JPEG-filer (figur 2A). Alternativt kan eksportere billederne som SPE-format filer og importere dem ind iImageJ billede analyse software. Sæt målinger til beregning af middelværdien grå værdi ROI. Vælg den samme størrelse ROI område og måle de gennemsnitlige grå og præsentere data som søjlediagrammer (figur 2B).
2. Levende Cell Konfokal Ca2 + Imaging
- Forbered stiklinger til konfokal billeddannelse. Steriliser frø af Arabidopsis planter udtrykker case12 med 10% blegemiddel indeholdende 0,01% Triton. Sår sterile frø på en plade indeholdende full styrke MS-salte, 1% saccharose og 1,2% agar. Placer pladerne lodret i en vækst kammer efter stratificering ved 4 ° C i 2 dage.
- Opsætning Imaging Chambers
- Saml en billeddannende kammer ved hjælp af et dias og dækglas (Afdeling A). Læg et stykke vand gennemblødt vat på midten af diaset. Derefter overfører én eller to 5 dage gamle kimplanter fra pladen på toppen af vand gennemvædet vat. Stick små stykker af ler til hvert hjørne af et dækglas, end sted dækglas på toppen af kimplanter at skabe et hul (kammer) mellem dækglasset og dias (figur 3A, venstre panel). Tilslut den ene ende af polyethylen rør (diameter 0,58 mm) til en 1 ml sprøjte og placer den anden ende af røret umiddelbart støder op til kammeret. Hold slangen på plads med tape (figur 3A, højre panel).
- Saml en billeddannende kammer ved hjælp af en plexiglas kammer (kammer B).
- Spred et tyndt lag silikonefedt omkring to polyethylen rør (0,58 mm i diameter), og tryk på de coatede rør i kanaler på hver side af plexiglas kammer (figur 3B venstre panel). Spred et tyndt lag af silikone fedt på overfladen af det kammer, der indeholder rør riller og trykke et dækglas i fedt for at forsegle den ene side af åbningen kammer (skæres ud).
- Overfør en fem dage gammel sætteplante fra pladen ind i kammeret og lægge et stykke vat vædet med vand på den øverste of kimplante. Spred silikonefedt på anden overflade af kammeret, og tryk på en anden dækglas på toppen for at forsegle. Tilslut enden af et af rørene til en 1 ml sprøjte. Lad enden af det andet rør åben (figur 3B højre panel).
- Forbered en billeddannende kammer ved hjælp af en kamre dækglas (Afdeling C). Steriliser kamre dækglas med 70% ethanol og overlade det på kølerhjelmen indtil tør. Tilføj 0,6 ml eller 0,2 ml af fuld styrke MS-medium indeholdende 1% saccharose og 0,5% phytagel i hver brønd i en 2-brønds kammer eller en 8-brønds kammer (figur 3C højre panel), hhv. Sterilisere frø og sår frøene direkte i et kamre dækglas indeholder et tyndt lag klar gel og lad dem vokse vertikalt i 5 dage (figur 3C).
- Anskaf billeder ved hjælp af en konfokal mikroskop. At anvende stress stimuli, såsom salt, kulde eller peroxid, langsomt injiceres omkring 200 ul 150 mM NaCl, is-cold vand eller 1 mM H 2 O 2-opløsning i kammeret (kammer A eller B) lige før erhverve billeder eller forsigtigt tilsættes 500 ul eller 100 ul af stimulus løsning på brønd af en 2 eller 8-brønds kammer, henholdsvis . Tag billeder umiddelbart efter påføring af stimulus løsning med en inverteret Nikon A1R konfokal laser scanning mikroskop med en 20X vand nedsænkning linse (blændetal 0,75). Saml en serie af billeder tid på 4 sek intervaller med excitation og emission bølgelængder af 488 nm og 500 til 550 nm, og ved en pixel opløsning på 512 x 512.
- Image Analysis
Ved hjælp af Nikon Elements blev ROIs om hver celle (eller arealet) af interesse. Samlet intensitet inden for hver ROI blev målt over tid ved hjælp af Time Measurement dialogboksen (ImageJ kunne bruges i stedet). Totale intensitet målinger blev eksporteret og behandlet i DataGraph. Ca 2 + spike amplitude blev defineret som topintensitet minus hvilepuls intensitet, varighed som the tid mellem indledningen og afslutningen af et spyd, og periode som tidsintervallet mellem tilstødende spike toppe af to pigge. t-test blev anvendt til at sammenligne midlerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mannitol, NaCl og H 2 O 2 blev anvendt som stedfortrædere for dehydrering, salt og oxidativt stress stimuli hhv. For at kontrollere om tungmetalion Cu2 + synergizes med nogen af disse tre stress stimuli, vi sammenlignede Ca2 + reaktionerne på hver stimuli i nærvær eller fravær af Cu2 +. Som vist i figur 2, afslørede FAS luminescens billeddannelse at Arabidoposis kimplanter reagerede forskelligt på dehydrering, salt og oxidativt stress. For koncentrationen af stimuli vi undersøgt i denne undersøgelse, 75 mM NaCI inducerede den stærkeste Ca2 + respons i blade og rødder i løbet af den første 40 sek eksponering (figur 2A midterste panel og figur 2B), mens 1 mM H 2 O 2 induceret en stærk Ca 2 + respons både i blade og rødder i den første og anden 40 sekunder (figur 2A højre panel). Opløsningen af 400 mM mannitol kun induceretCa 2 + svar i rødder i de første 40'erne og meget svage signaler i blade under den anden 40 sek. Cu2 + kraftigt forbedret amplituder og varigheden af Ca 2 +-signaler udløst af NaCl og mannitol (figur 2A venstre panel). Det fremgår, at Cu2 + havde hæmmende effekt på H 2 O 2-induceret Ca2 +-signaler, hvilket reducerer både amplitude og varighed (figur 2A højre panel og 2B).
Brug Case12 udtrykker Arabidopsis planter målte vi Ca 2 + dynamik i cytosolen og kerner samtidig. Molekylvægt Case12 er 46 kDa, derfor transgene planter, der udtrykker Case12 har GFP signaler i både cytosolen og kerner af blade og rod celler (figur 4A). Tilpasset (figur 3A og 3B) eller kommercielle kamre (figur 3C) blev anvendt til levende celler med en konfokalmikroskop. Anvendelse af 150 mM NaCl til kimplanter i kammeret, vi observerede ændringer i fluorescens intensitet i både cytosolen og kernen i de enkelte celler (figur 4B og C Supplerende Movie 1). Brug af NIS-elementer (Imaging software, Nikon Instruments Inc.), målte vi fluorescensintensiteten i områder af interesse (ROI) over tid. Amplituden, varighed og hyppighed af cytosol og nuklear Ca2 + svingning er præsenteret grafisk i figur 4B. Amplituden og perioden for Ca2 + spidser i cytoplasma og kerner varierer meget fra celler af den samme rod, såvel som på tværs af celler i forskellige rødder. Amplitude og periode af cytosoliske Ca2 + spikes var 60,36 ± 45,22 AU (vilkårlig enhed) og 58,24 ± 15,70 sek hhv. Amplitude og periode af nukleare Ca 2 + spikes var 316,26 ± 75,24 (AU) og 61,71 ± 16,31 sek hhv. I modsætning hertilvarigheden af cytosoliske og nukleare Ca 2 + pigge var ens mellem celler, som var 17,43 ± 3,67 sek og 17,33 ± 2 sek hhv. Amplituden af Ca2 + pigge faldt over tid, hvilket kan skyldes ændringen af brændplanet og / eller et tab af reaktion på stress stimuli på grund af en ugunstig in vitro-tilstand. Disse resultater viser, at salt stress udløser Ca2 + svingning i både cytoplasma og kernen.
Figur 1. aequorin baserede FAS system til måling af fysisk-temporale Ca 2 + dynamik som reaktion på stress stimuli. A) Grow Arabidopsis kimplanter lodret på en plade indeholdende MS-medier. B, C) Placer en klæbende film (B) på toppen af kimplanter (C). D, E) F) Inkuber kimplanter klæbet til filmen med 2 ug / ml h-CTZ i vand i 4 timer. G) Skær filmen på midten og placere hvert stykke i en anden tom plade. Lad pladerne i mørke i 5 min. Ansøg samtidigt styre og stimuli løsninger (sørg kimplanterne helt dækket), og erhverve billeder med det samme. Skalaen bar er 5 cm.
Figur 2. Sammenligning af fysisk-temporale Ca2 + respons på 10 døgn kimplanter til forskellige stress stimuli. A) En serie af luminescens billeder af kimplanter tid udsættes for 400 mM mannitol og 400 mM mannitol plus 1 mM CuCl2 (A, venstre panel), 75 mM NaCI og 75 mM NaCI plus 1 mM CuCI2 (A, midterste panel) og 1 mM H 2 O 2 eller 1 mM H 2 O 2 plus 1 mM CuCl2 (A, højre panel). Øvre og nedre paneler af A, er luminescens billeder erhvervet under første 40 sek og andet 40 sek hhv. En intensitet skala bar indikerer en stigning af luminescens-signaler fra lav (sort) til høj (hvid). B) søjlediagram over gennemsnittet luminescensintensitet af kimplanter som reaktion på de angivne stress stimuli.
Figur 3. Opsætning af en levende celle konfokal imaging eksperiment. A) En skræddersyet kammer er bygget med et dias, dækglas med fire stykker af ler og vat. To 5 dage gamle kimplanter er placeret på diaset. Den ene ende af et polyethylenrør er placeret ved siden af den samlede kammeret og fastgøres meda stykker tape, mens den anden ende er forbundet til en 1 ml sprøjte. B) En skræddersyet slide fremstillet med plexiglas har en åbent kammer i midten og to kanaler, der er forbundet til de to sider af kanalen. Et dækglas anbringes på toppen af slæden og to polyethylenskum Rørene anbringes i kanalen. Dækglasset og rør er fastgjort i den position med siliconefedt. I slutningen af et af rørene er forbundet til en 1 ml sprøjte og enden af et andet rør forbliver åben. En 5 dage gamle kimplanter er placeret i kammeret, og en coveslip er lagt på toppen af kimplanter og forseglet med silikonefedt. Den plexigalss dias med den samlede kammeret er placeret på scenen af mikroskopet. C) Arabidopsis kimplanter dyrkes i to brønde (venstre) eller 8 brønde (til højre) det kamre dækglas indeholdende et tyndt lag på 0,6% af phytagel i MS medier.
Figur 4. cytosol- og nuklear Ca2 + svingning som reaktion på salt stress. A) Konfokale billeder viser, at Case12 udtrykkes i cytoplasmaet og kerner af rodcellerne (venstre panel) og bladceller (højre panel) af transgene planter, der udtrykker Case12. Billedet til højre panel er en fusioneret billede af rød autofluorescens af kloroplaster og grøn fluorescens Case12. B) Salt stress (150 mM NaCl) inducerede Ca2 + svingning i cytosolen (øverste panel) og kerner (nederste panel) af rodcellerne. Steder af de målte celler er angivet med pile med tal på panelet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har vist et FAS system til registrering af den rumlige-temporale Ca 2 + svar fra Arabidopsis frøplanter. Dette FAS Ca2 + optagelse system giver en simpel, følsom og robust fremgangsmåde, der kan tilpasses til måling af Ca2 + dynamik udløst af forskellige stimuli foruden de abiotisk stress stimuli, der er præsenteret her. Ved hjælp af dette system, kan vi nemt sammenligne vævs- eller stimuli-specifikke rumlige-tidsmæssige Ca 2 + dynamik på helplanteniveau. Den høje følsomhed FAS tillader brug af lav intensitet stimuli for behandlingen af Ca2 + responser, hvilket er vigtigt for at undgå artefakter forårsaget af fysiske skader på celler, når høj intensitet stress anvendes. Syv til 10 dage gamle Arabidopsis kimplanter viste væv eller stimuli-specifikke Ca2 + respons, selvom kimplanter på forskellige fysiologiske stadier kan have forskellig følsomhed og specificitet som reaktion på en given stimulus. Derfor er detforetrækkes at anvende 7-10 dage gamle kimplanter for at øge gennemløbet af FAS målinger, hvor omkring 100 kimplanter kan klæbet på et stykke af filmen. Sammen med let og enkelt ydelse, høj følsomhed og reproducerbarhed kan FAS systemet også tilpasses til screening EMS mutageniserede mutanter til ændrede Ca2 + reaktioner. Til screening, er det afgørende at have ensartede frøplanter, der er godt dyrkes på pladen og klæbet på filmen. Fire til fem timers inkubation af klæbet frøplanter med h-CTZ er normalt tilstrækkeligt til opløsning af aequorin. Brug af den klæbende film med huller er at foretrække, fordi omsætningen af apoaequorin og cofaktor kræver ilt. Til sammenligning af væv eller stimuli-specifikke Ca2 + reaktioner, ved hjælp af grupper af kimplanter oprindeligt fra den samme film er kritisk, fordi tilstanden af kimplanter og / eller rekonstituering tilstand kan påvirke den samlede mængde af funktionel aequorin. Når disse KRAVNTS er opfyldt, forskellen på luminescens reaktion er proportional med den vævs- eller stimulus-specifikke Ca 2 + svar.
Aequorin baseret måling af Ca 2 + signaler afspejler reaktion af en population af cellerne. I betragtning af den uensartede celletyper og / eller anderledes tilgængelighed af celler i væv til stimuli, resultaterne af aequorin baserede Ca2 + målinger ikke ensbetydende med, at opførslen af en hvilken som helst celle. Forståelse Ca2 + dynamik på det cellulære niveau kræver en Ca2 +-indikator, som kan detekteres med subcellulær opløsning. Levende celler konfokal billeddannelse af fluorescens protein (RP) -baseret Ca 2 + indikatorer giver en avanceret Ca2 + afsløring system til registrering af cellulære Ca 2 + dynamik med cellulær opløsning i et ønsket væv. Her, ved hjælp af levende celler konfokal billedbehandling og FP-baserede Ca 2 + indikatorer, indspillet vi subcellulære Ca2 + + indikatorer er blevet implementeret i anlæg med forskellige karakteristika. Sammenlignet med YCS, enkelt GFP-baserede Ca2 + indikator har nogle fordele: 1. Case12 kræver ikke YFP og FFP filtersæt eller de mange antagelser og komplicerede beregninger, der er nødvendige for at måle FRET 22. Case12 har enkelt excitation / emission maxima og let kan afsløres ved hjælp af standard GFP-filter sæt. 2. Case12 er stabil under fysiologisk pH, og er et relativt lille protein (46 kDa). Når det udtrykkes i planter, forekommer ikke-målrettet Case12 i cytoplasmaet samt kerner, så Case12 transgene planter kan anvendes til at spore cytosoliske og nukleare Ca2 + dynamik samtidigt. En ulempe ved denne reporter er, at det er en ikke-ratiometrisk indikator, så niveauer af fluorescens påvirkes også af faktorer, der er relateret til Ca2 +-koncentration, såsom ekspressionsniveauet afCase12 og lokale pH. Alligevel Case12 er tilstrækkelig til at bestemme cellulær Ca2 +-koncentration til sammenligning af rumlige-tidsmæssige Ca2 + dynamik i cytoplasmaet og organeller mellem materialer med forskellige genetiske baggrunde under de samme eksperimentelle betingelser. I fremtiden nye GFP baserede Ca 2 + indikatorer med højere signal-støjforhold, hurtige kinetik og større respons, ligesom GCaMP3 24 og GCaMP5 25 påvist i dyr, kunne være bedre indikatorer for registrering cellulær eller subcelluar Ca 2 + dynamik i planter.
De aequorin og Case12 detection systemer er beskrevet her giver destruktiv in vivo metoder til måling af fysisk-temporale Ca 2 + dynamik på hele sætteplante og subcellulære niveauer, hhv. I begge systemer, kan fysiologiske tilstand eller vækstbetingelser påvirke Ca 2 + reaktioner frøplanter eller celler. Hvis physically beskadiget eller ikke dyrkes i en god stand, kan celler har svage eller slet ingen Ca 2 + svar. Desuden er varigheden af rumlige og tidslige Ca 2 +-signaler også påvirket af betingelserne for kimplanter under målingerne. Luminescens eller fluorescenssignaler kan falde over tid som følge af stimuli-induceret skade og / eller laser-induceret foto-skader i tilfælde af konfokal billeddannelse. Selv om stimulus-induceret skade ikke kan undgås, kan fototoxicitet reduceres ved at begrænse intensiteten og / eller hyppigheden af laser eksponering. Desuden aequorin baseret Ca2 + optagelse system kræver rekonstituering trin. Faktorer, der afbryder udbredelsen af CTZ til cellen og / eller reaktion apoaequorin med CTZ ville påvirke luminescens-signaler, der er relateret direkte til Ca 2 + koncentration. Derfor er koncentrationen af CTZ, samt varigheden af og betingelserne for CTZ inkubation skal optimeres for bedste følsomhed og reproducibiltet. Genetisk indkodede Ca 2 + indikatorer kan unøjagtigt rapportere cellulære Ca 2 + koncentrationer af andre grunde, herunder utilsigtet målretning til specifikke subcellulære rum, temperatur følsomhed eller indblanding af reporteren med den cellulære Ca2 + signalering maskiner 23. Vi fandt, at aequorin eller Case12 udtrykker planter har ingen indlysende morfologiske eller betingede fænotyper såsom ændret stresstærskel. Derfor er det usandsynligt, at disse genetisk indkodede Ca 2 + indikatorer har store indgreb i Ca 2 + signalering i planter.
Sammenfattende præsenterer vi her en detaljeret vejledning for anvendelse af to Ca 2 + afsløring systemer til måling rumlige og tidslige Ca 2 +-signaler på både hele planten sætteplante og subcellulære niveauer. Disse to systemer kan anvendes til at bestemme væv (eller celletype), eller stimuli-specifik Ca2 + dynamiske mønstre med høj følsomhed ogreproducerbarhed. Derfor er de stærke værktøjer til at belyse gen netværk, der ligger til grund for Ca 2 +-signalering som reaktion på forskellige miljømæssige signaler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm x 10 cm square Petri dish | VWR | 60872-310 | |
| Adhesive film | VWR | 60941-062 | |
| Polyethylene tubing | PerkinElmer | 9908265 | |
| 1 ml syringe | VWR | 53548-000 | |
| Silicone grease | Beckman | 335148 | |
| 2-well chambered cover glass | Nalge Nunc international | 155379 | |
| 8-well chambered cover glass | Nalge Nunc international | 155409 | |
| Luminescence imaging system | Princeton Instruments | N/A | |
| Inverted confocal laser-scanning microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon A1R |
| Imaging software | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Elements |
| DataGraph | Visual Data Tools Inc | N/A | DataGraph 3.1.1 is the newest version |
| Coelenterazine | NanoLight Technolgies | #301B NF-BCTZ-FB | |
| All purpose bleach | Any local store | N/A | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151500 | |
| MS salt | Phytotechnology Labs | M524-50L | |
| Sucrose | VWR | BDH8029-12KG | |
| Agar | Sigma | A1296-5KG | |
| Phytagel | Sigma | P8169-1KG |
References
- Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. Calcium signals: the lead currency of plant information processing. Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).
- Pan, Z., Zhao, Y., Zheng, Y., Liu, J., Jiang, X., Guo, Y. A high-throughput method for screening Arabidopsis mutants with disordered abiotic stress-induced calcium signal. J. Genet. Genomics. 39 (5), 225-235 (2012).
- Ranf, S., et al. Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana. Mol. Plant. 5 (1), 115-130 (2012).
- Zhu, X., Feng, Y., Liang, G., Liu, N., Zhu, J. K. Aequorin-based luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Mol. Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
- Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).
- Van der Luit, A. H., Olivari, C., Haley, A., Knight, M. R., Trewavas, A. J. Distinct calcium signalling pathways regulate calmodulin gene expression in tobacco. Plant Physiol. 121 (3), 705-714 (1999).
- Johnson, C. H., et al. Circadian oscillations of cytosolic and chloroplastic free calcium in plants. Science. 269 (5232), 489-503 (1995).
- Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signature after acclimation. Plant Cell. 8 (3), 489-503 (1996).
- Logan, D. C., Knight, M. R. Mitochondrial and cytosolic calcium dynamics are differentially regulated in plants. Plant Physiol. 133 (1), 21-24 (2003).
- Mehlmer, N., Parvin, N., Hurst, C. H., Knight, M. R., Teige, M., Vothknecht, U. C. A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot. 63 (4), 1751-1761 (2012).
- Kiegle, E., Moore, C. A., Haseloff, J., Tester, M. A., Knight, M. R. Cell-type-specific calcium responses to drought, salt and cold in the Arabidopsis root. Plant J. 23 (2), 267-278 (2000).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat. Protoc. 1 (3), 1057-1065 (2006).
- Souslova, E., et al. Single fluorescent protein-based Ca2+ sensors with increased dynamic range. BMC. Biotechnol. 7, 37-46 (2007).
- Tanaka, K., Swanson, S., Gilroy, S., Stacey, G. Extracellular nucleotides elicit cytosolic free calcium oscillations in Arabidopsis. Plant Physiol. 154 (2), 705-719 (2010).
- Iwano, M., et al. Fine-tuning of the cytoplasmic Ca2+ concentration is essential for pollen tube growth. Plant Physiol. 150 (3), 1322-1334 (2009).
- Sieberer, B., Chabaud, M., Timmers, A., Monin, A., Fournier, J., Barker, D. A nuclear-targeted Cameleon demonstrates intranuclear Ca2+ spiking in Medicago truncatula root hairs in response to rhizobial nodulation factors. Plant Physiol. 151 (3), 1197-1206 (2009).
- Loro, G., Drago, I., Pozzan, T., Lo Schiavo, F., Zottini, M., Costa, A. Targeting of Cameleons to different subcellular compartments reveals a strict cytoplasmic/mitochondrial Ca2+ handling relationship in plant cells. Plant J. 71 (1), 1-13 (2012).
- Krebs, M., et al. FRET-based genetically encoded sensors allow high-resolution live cell imaging of Ca2+ dynamics. Plant J. 69 (1), 181-192 (2012).
- Bonza, M. C., Loro, G., Behera, S., Wong, A., Kudla, J., Costa, A. Analyses of Ca2+ accumulation and dynamics in the endoplasmic reticulum of Arabidopsis root cells using a genetically encoded Cameleon sensor. Plant Physiol. 163 (3), 1230-1241 (2013).
- Costa, A., et al. H2O2 in plant peroxisomes: An in vivo analysis uncovers a Ca2+ dependent scavenging system. Plant J. 62 (5), 760-772 (2010).
- Zhu, X., Caplan, J., Mamillapalli, P., Czymmek, K., Dinesh-Kumar, S. P. Function of endoplasmic reticulum calcium ATPase in innate immunity-mediated programmed cell death. EMBO J. 29 (5), 1007-1018 (2010).
- Roszik, J., Lisboa, D., Szöllosi, J., Vereb, G. Evaluation of intensity-based ratiometric FRET in image cytometry--approaches and a software solution. Cytometry A. 75 (9), 761-767 (2009).
- Kotlikoff, M. I. Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology. J. Physiol. 578 (Pt 1), 55-67 (2007).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
