Biology

מדידת מרחב ובזמן Ca Published: September 2, 2014 doi: 10.3791/51945

DOI

Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

Xiaohong Zhu¹, Aaron Taylor², Shenyu Zhang¹, Dayong Zhang^1,3, Ying Feng^1,4, Gaimei Liang^1,5, Jian-Kang Zhu^1,6

¹Department of Horticulture and Landscape Architecture, Purdue University, ²Bindley Bioscience Center, Purdue University, ³Institute of Biotechnology, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, ⁴College of Environmental & Resource Science, Zhejiang University, ⁵Dryland Agriculture Research Centre, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, ⁶Shanghai Center for Plant Stress Biology, Chinese Academy of Sciences

Summary

איתות ^{2 +} Ca מסדירה תהליכים ביולוגיים מגוונים בצמחים. כאן אנו מציגים גישות לניטור לחץ אביוטי המושרה Ca מרחב ובזמן ^{2 +} אותות בתאי ארבידופסיס ורקמות באמצעות Ca ^{2 +} אינדיקטורים מקודד גנטי Aequorin או Case12.

Abstract

רמזים התפתחותית וסביבתיים לגרום Ca ^{2 +} תנודות בתאי צמח. Ca ^{2 +} דפוסי מרחב וזמן גירוי ספציפי חשו על ידי חלבוני Ca ^{2 +} מחייב סלולריים שליזום Ca ^{2 +} מפלי איתות. עם זאת, אנחנו עדיין יודעים מעט על איך גירוי האותות ^{2 +} Ca הספציפי נוצרים. הספציפיות של אות Ca ^{2 +} ניתן לייחס לרגולציה המתוחכמת של הפעילויות של הערוצים ו / או מובילי Ca ^{2 +} בתגובה לגירוי נתון. לזהות מרכיבים תאיים אלה ולהבין את תפקידם, זה קריטי לשימוש במערכות המאפשרות הקלטה רגישה וחזקה של אותות ^{2 +} Ca בשתי הרקמות ורמות תאיות. Ca ^{2 +} אינדיקטורים מקודד גנטי שממוקדות לתאים סלולריים שונים סיפקו פלטפורמה להדמית confocal תא חי של Ca ^{2 +} אותות סלולריים. כאן אנו מתארים הוראהים לשימושם של שני Ca ^{2 +} מערכות גילוי: aequorin FAS (שתילי דבק סרט) הדמיה הארה Ca ^{2 +} וcase12 הקרינה confocal תא חי המבוססת הדמיה Ca ^{2 +} מבוסס. הדמיה הארה באמצעות מערכת FAS מספקת זיהוי פשוט, חזק ורגיש של ^{2 +} אותות מרחב ובזמן Ca ברמת הרקמה, תוך הדמיה confocal תא חי באמצעות Case12 מספקת זיהוי בו זמני של cytosolic ^{ו2 +} אותות Ca גרעיניים ברזולוציה גבוהה.

Introduction

תא הצמח מגיב לסביבה באמצעות איתות שהוא מתאם את פעולות תא. תא מוקדם איתות אירוע בתגובה לגירויים סביבתיים הוא עליית Ca ^{2 +} ארעית. הדפוס, או החתימה של עלייה זמנית בריכוז Ca ^{2 +} חינם מאופיין במשרעת, התדירות, ומשך הזמן שלה. חתימות ^{2 +} Ca מרחב ובזמן שונים מסדירות את הפעילות סלולרית שונה ^1. גירויים ספציפיים, כגון חום, קור, מלח, הבצורת, אור, או הורמונים צמחיים, עשויים לכוונן את פעילות מרחב ובזמן של ערוצים מקומי קרום Ca ^{2 +} ו / או מובילים, וכתוצאה מכך Ca ^{2 +} חתימות ספציפיות. למרות Ca ^{2 +} מובילים כבר מאופיינים היטב, מעט מאוד ידוע על הזהות המולקולרית ופונקציות של ערוצי ^{2 +} Ca בצמחי ^1. מסכי גנטיים למוטציות בתגובה שינתה Ca ^{2 +} להדגיש גירויים עשויים להיות appr יעילאוח לזיהוי הרכיבים שמרכיבים את חתימות Ca ^{2 +.} מערכות גילוי Ca ^{2 +} לאחרונה מבוססים כמה Aequorin פותחו המאפשרות מסכי גנטיים לCa ^{2 +} איתות רכיבים בתגובה להתקפת הפתוגן ואביוטי מתח ^2-4.

Aequorin שימש לראשונה כדי לזהות Ca ^{2 +} אותות בצמחים בתחילת 1990 ^5. מאז, Aequorin כבר ממוקד לתאים סלולריים שונים, כגון ציטופלסמה ^5, גרעין ^6, כלורופלסטים ^7, tonoplast ^8, מיטוכונדריה ^9, וסטרומה ^10, כמו גם לסוגים שונים של תאים בשורש כדי לפקח על תא ספציפי Ca ^{2 +} אותות ^11. מדידות Ca ^{2 +} מבוסס Aequorin לחשוף את Ca ^{2 +} תגובת מרחב ובזמן של אוכלוסייה של תאים להדגיש גירויים. עם זאת, ברוב המקרים, תגובות Ca ^{2 +} של תאים בודדים הן unsynchronized ברקמות להגיב ^4. לכן, הקלטת ^{2 +} Aequorin Ca לא בהכרח לדווח אות Ca ^{2 +} בתאים בודדים. בשנים האחרונות, חלבון פלואורסצנטי מקודד גנטי (FP) המבוסס Ca ^{2 +} אינדיקטורים, כגון Cameleon הצהוב (YCS) ^{12 ו13} CASEs12 היה בשימוש ללמוד Ca ^{2 +} איתות עם רזולוציה subcellular גבוהה. YCS הוא העברת אנרגיית תהודת הקרינה (סריג) המבוסס Ca ^{2 +} אינדיקטורים, המכילה CFP ו YFP ריאנטים מקושר על ידי Ca ^{2 +} -binding calmodulin החלבון ופפטיד מחייב calmodulin M13. Calmodulin עובר שינוי קונפורמציה כפי שהוא נקשר לCa ^{2 +,} ובכך מביא CFP ו YFP ביחד קרוב, וכתוצאה מכך העברת אנרגיה מוגברת (סריג משופר). רמת סריג לאורך זמן, מחושבת בערך כמו היחס של YFP לעוצמות אות CFP, משקפת תאיים Ca ^{2 +} דינמיקה. כמה גרסאות י"ס היו בשימוש בצמחים. YC3.6 היה targeted לcytosol ^14,15, גרעין ^16, מיטוכונדריה ^17, וקרום פלזמה ^18, וYC4.6 וD4ER היו ממוקד לחדר המיון ^15,19, וD3cpv היה ממוקד peroxisomes ^20. צמחים מהונדסים מבטא YCS לאפשר ההדמיה לחיות התאים של Ca ^{2 +} דינמיקה בתוך תאים סלולריים שונים של סוגי תאים שונים. מקרים (כנראה Ca lcium se nsor) הם חלבונים יחידים מעגלי permuted ניאון (cpFPs) מחסה calmodulin ופפטיד מחייב calmodulin M13. על הכריכה לCa ^{2 +,} מקרים עוברים שינויי קונפורמציה, שהובילו לגידול של עוצמת הקרינה. המתאם בין תגובת הקרינה של CASE וריכוז Ca ^{2 + 2 +} מאפשר דינמיקה תאית Ca להימדד כמותית. גרסת Case12 יש לקפל 12 עלתה הקרינה בCa ^{2 +} צורות -saturated. נ צמחי benthiminana זמני exprEssing Case12 או צמחי ארבידופסיס ביציבות להביע 12 מקרה שמשו ללמוד איתות Ca ^{2 +} במתח הבטחוני ואביוטי ^{4,21. 2 +} תנודות Ca מרחב ובזמן אסינכרוני בתאים מגיבים להתקפת הפתוגן, או ללחץ התייבשות נחשפו עם ההדמיה Ca ^{2 +} מבוסס Case12.

כאן, אנו מציגים הוראות מפורטות להדמית Aequorin מבוססת הארה של ברקמה וגירויים ספציפית Ca ^{2 +} דינמיקה בשתילי ארבידופסיס, והדמית confocal של cytosolic וCa הגרעיני ^{2 +} דינמיקה בתאי שורש ארבידופסיס המבטאות מקרה 12. הדמיה הארה של FAS יכול להיות מותאם כדי לנתח דינמיקת Ca ^{2 +} מתח מושרה בצמחים או ברקמות אינן מתוארות כאן בשלמותה, או כדי לסנן אוכלוסיות צמח ארבידופסיס mutagenized למוטציות עם לחץ שינה המושרה Ca ^{2 +} אותות. התקנת ההדמיה התא החי Ca ^{2 +} יכולה להיות מותאמת כדי לנתח Ca2 + דינמיקה בתוך תאי subcelluar שונים או בתאים מסוגים שונים באמצעות Ca ^{2 +} אינדיקטורים אחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

.1 ההדמיה Aequorin מבוסס Ca ^{2 +} שימוש במערכת FAS

הכן שתילי הדמיה הארה. לעקר זרעים של צמחי ארבידופסיס להביע Aequorin עם פתרון אקונומיקה 10% מכיל 0.01% Triton-100. לזרוע את הזרעים סטריליים על צלחת מרובעת (10 x 10 סנטימטר צלחת פטרי מרובע עם רשת,) המכילים במלוא הכוח MS (Murashige ותערובת Skoog סל מלח), סוכרוז 1%, ואגר 1.2%. צלחות מקום אנכי בתא צמיחה לאחר ריבוד על 4 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים (איור 1 א).
העבר את השתילים על גבי סרט. מניחים סרט דבק (איור 1) בחלק העליון של שתילים ישנים 7-10 יום גדלו על הצלחת. דחף בעדינות את הסרט ביד על מנת להבטיח ששתילים לדבוק בסרט (איור 1 ג). לקלף את הסרט בעדינות, כך שהשתילים יישארו דבקו בסרט (1D איור ו1E)
דגירה השתילים עם cofactor. הנח אתשתילי dhered לצלחת המרובע (10 x 10 סנטימטר) המכילה 15 מ"ל של 2 מיקרוגרם h-CTZ / מ"ל (coelenterazine) במים. דגירה השתילים בטמפרטורת חדר למשך 4 שעות ללילה (איור 1F).
להתכונן להדמית הארה. קח את הסרט של פתרון h-CTZ ולחתוך אותו באמצע, ויצר שתי חתיכות. מניחים כל חתיכת סרט עם שתילים עם הפנים כלפי מעלה בשתי צלחות שונות. השאר את הצלחות בחושך במשך 5 דקות.
לרכוש תמונות הארה. בחושך, מקם את שתי הצלחות לצד זה על הבמה של מערכת ההדמיה הארה (איור 1G). לרכוש תמונות מייד עם הוספת 20 מ"ל של תמיסת גירויים לצלחות בו זמנית.
ניתוח תמונות הארה. בחר את אותו טווח תצוגה לכל תמונות הארה. לחתוך את האזור של העניין (ROI) וליצור תמונות כקבצים (איור 2 א) JPEG. לחלופין, לייצא את התמונות כקבצים בפורמט SPE ולייבא אותם לתוךתוכנת ניתוח תמונת ImageJ. מדידות קבועות לחישוב הערך האפור הממוצע של החזר על השקעה. בחר באותו הגודל של שטח החזר על ההשקעה ולמדוד את הנתונים אפורים ובהווה אומר כגרף עמודות (איור 2).

.2 תא חי הדמיה Confocal Ca ^{2 +}

הכן שתילים להדמית confocal. לעקר זרעים של צמחי ארבידופסיס להביע case12 עם פתרון אקונומיקה 10% מכיל 0.01% טריטון. לזרוע את הזרעים סטריליים על צלחת המכילה מלחי כוח משרה מלא MS, סוכרוז 1%, ואגר 1.2%. צלחות מקום אנכי בתא צמיחה לאחר ריבוד על 4 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים.
צ'יימברס ההדמיה התקנה
1. להרכיב חדר הדמיה באמצעות שקופיות וcoverslip (קאמרי). מניחים פיסת צמר גפן במים ספוגה על אמצע השקופית. לאחר מכן להעביר ישנים שתילי 5 יום אחד או שתיים מהצלחת על החלק העליון של צמר גפן ספוג מים. היצמד חתיכות קטנות של חימר לכל פינה של coverslip,coverslip מקום ד בחלק העליון של שתילים כדי ליצור פער (קאמרי) בין coverslip ושקופיות (איור 3 א, פנל משמאל). חבר קצה אחד של צינור פוליאתילן (0.58 מ"מ קוטר) למזרק 1 מ"ל ומניח את הקצה השני של צינור מייד בסמוך לתא. החזק את צינורות במקום עם קלטת (איור 3 א, פנל מימין).
2. להרכיב חדר הדמיה באמצעות תא פרספקס (הקאמרי B).
  1. מורחים שכבה דקה של גריז סיליקון סביב שני צינורות פוליאתילן (קוטר 0.58 מ"מ) ולחץ על הצינורות מצופים לערוצים בכל צד של חדר פרספקס (איור 3B עזב פנל). מורחים שכבה דקה של גריז סיליקון על פני השטח של התא המכיל את חריצי הצינור ולחץ coverslip לתוך הגריז לאטום צד אחד של פתיחת התא (לגזור).
  2. העבר את השתיל בן חמישה ימים מהצלחת לתוך התא ולמקם את פיסת צמר גפן טבול במים בo העליונהf השתיל. מורחים גריז סיליקון על גבי המשטח האחר של החדר, ולחץ coverslip אחר על גבי לאטום. חבר את קצו של אחד מהצינורות למזרק 1 מ"ל. השאר את קצה הצינורית האחר (פנל מימין איור 3 ב) פתוח.
3. הכן חדר הדמיה באמצעות מכסה זכוכית chambered (הקאמרי C). לעקר את מכסה זכוכית chambered עם אתנול 70% ולהשאיר אותה על מכסה המנוע עד יבש. הוספת 0.6 מ"ל או 0.2 מ"ל של כוח מלא בינוני MS המכיל סוכרוז 1% וphytagel 0.5% לבאר כל תא 2 היטב או קאמרי 8 היטב (פנל מימין איור 3 ג), בהתאמה. לעקר זרעים ולזרוע את הזרעים ישירות בכיסוי זכוכית chambered המכילה שכבה דקה של ג'ל ברור ולתת להם לגדול בצורה אנכית במשך 5 ימים (איור 3 ג).
לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ confocal. כדי להחיל גירויי מתח, כגון מלח, קר או מי חמצן, להזריק לאט על 200 μl של 150 mM NaCl, קרח colהמים ד או 1 מ"מ H ₂ O ₂ פתרון לתוך התא (הקאמרי A או B) רק לפני רכישת תמונות, או בעדינות להוסיף 500 μl μl או 100 של פתרון גירוי ולשל תא 2 או 8 היטב, בהתאמה . צלם תמונות באופן מיידי לאחר יישום פתרון הגירוי באמצעות מיקרוסקופ confocal Nikon A1R הפוך לייזר סריקה עם עדשת 20X טבילה במים (צמצם מספרי 0.75). לאסוף סדרת זמן של תמונות ב 4 מרווחי שניות עם אורכי גל עירור ופליטה של 488 ננומטר ו500-550 ננומטר, בהתאמה, וברזולוצית פיקסל של 512 x 512.
ניתוח תמונה
השימוש בNikon אלמנטים, ROIs נמשכו מסביב לכל תא (או אזור) של עניין. עוצמת סה"כ בתוך כל החזר על השקעה נמדדה לאורך זמן באמצעות תיבת הדו שיח זמן המדידה (יכול לשמש ImageJ במקום). מדידות עוצמת סה"כ יוצאו ומעובד בDataGraph. משרעת ספייק ^{2 +} Ca הוגדר כעוצמת שיא מינוס עצמת מנוחה, משך כהזמן דואר בין ייזום והשלמת ספייק, ותקופה כפי שמרווח הזמן בין פסגות ספייק הסמוכות של שני קוצים. ט'-test שימש להשוות את האמצעים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מניטול, NaCl וH ₂ O ₂ שמשו כשליחים לגירויי התייבשות, מלח וסטרס חמצונים, בהתאמה. כדי לבדוק אם יון המתכת הכבד Cu ^{2 +} synergizes עם כל אחד משלושת גירויי מתח אלה, השווינו את תגובת Ca ^{2 +} לכל גירויים בנוכחותו או היעדריו של Cu ^{2 +.} כפי שניתן לראות באיור 2, הדמיה הארה FAS גילתה כי שתילי Arabidoposis הגיבו באופן שונה להתייבשות, מלח וסטרס חמצונים. לריכוז של גירויים נבחנו במחקר זה, 75 mM NaCl מושרה Ca ^{2 +} התגובה החזקה ביותר בעלים ושורשים במהלך 40 שניות הראשונות של חשיפה (פנל איור 2A אמצע ואיור 2), ואילו 1 מ"מ H ₂ O ₂ מושרה Ca ^{2 +} תגובה חזקה הן בעלים ושורשים במהלך 40 שניות הראשונות ושנייה (פנל מימין איור 2 א). הפתרון של 400 מניטול מ"מ מושרה רקתגובת Ca ^{2 +} בשורשים במהלך 40s הראשון ואותות חלשים מאוד בעלים בשניות 40 השניה. Cu ^{2 +} מאוד משופר אמפליטודות ומשך ^{2 +} אותות Ca מופעלים על ידי NaCl ומניטול (פנל משמאל איור 2 א). נראה כי היו לי Cu ^{2 +} השפעות מעכבות על H ₂ O ₂ מושרה Ca ^{2 +} אותות, הפחתת שני משרעת ומשך (פנל איור 2A תקין ו2B).

שימוש בצמחי ארבידופסיס להביע Case12, מדדנו Ca ^{2 +} דינמיקה בcytosol וגרעינים בו זמנית. משקל מולקולרי של Case12 הוא 46 kDa, יש צמחים לכן מהונדסים מבטא Case12 אותות GFP בשני cytosol וגרעינים של עלה ותאי שורש (איור 4 א). תאים מותאמים אישית (איור 3 א ו 3 ב) או מסחריים (איור 3 ג) שמשו להדמית תא חי עם confocalמיקרוסקופ. החלת 150 mM NaCl לשתיל בתא, ראה שינויים של עוצמת הקרינה בשני cytosol והגרעין של התאים הבודדים (איור 4 וC; משלים סרט 1). שימוש בש"ח-אלמנטים (תוכנת הדמיה, Nikon אינסטרומנטס), מדדנו את עוצמת הקרינה באזורים של עניין (ROI) לאורך זמן. משרעת, המשך והתדירות של cytosolic ותנודת Ca ^{2 +} גרעינית מוצגים באופן גרפי באיור 4. משרעת ותקופה של Ca ^{2 +} קוצים בציטופלסמה והגרעינים להשתנות במידה רבה בין תאים מאותו השורש, כמו גם על פני תאים בשורשים שונים. משרעת ותקופה של Ca ^{2 +} קוצים cytosolic היו 60.36 ± 45.22 AU (יחידה שרירותית) ו58.24 ± 15.70 שניות, בהתאמה. משרעת ותקופה של Ca ^{2 +} קוצים גרעיניים היו 316.26 ± 75.24 (AU) ו61.71 ± 16.31 שניות, בהתאמה. בניגוד לכך,משך Ca ^{2 +} הקוצים cytosolic והגרעיניים היו דומה בין תאים, אשר היו 17.43 ± 3.67 שניות ו17.33 ± 2 שניות, בהתאמה. המשרעת של Ca ^{2 +} קוצים ירדו לאורך זמן, וזה יכול להיות כתוצאה מהשינוי של מישור המוקד ו / או הפסד של תגובה ללחץ גירויים בגלל שלילי במצב מבחנה. תוצאות אלו מראות כי לחץ מלח מפעיל תנודת Ca ^{2 +} בשתי הציטופלסמה לבין הגרעין.

איור 1 Aequorin מערכת FAS מבוסס למדידת ^{2 +} דינמיקת Ca מרחב וזמן בתגובה ללחץ גירויים. ) לגדול שתילי ארבידופסיס אנכי על צלחת המכילה MS תקשורת. B, C) מניחים סרט דבק (ב ') בחלק העליון של שתילים (C). D, E) F) דגירה שתילים דבקו בסרט עם 2 מיקרוגרם / מ"ל של h-CTZ במים למשך 4 שעות. G) חותך את הסרט באמצע ולמקם את כל חתיכה לשונה צלחת ריקה. השאר את הצלחות בחושך במשך 5 דקות. במקביל, לשלוט ופתרונות גירויים (הקפידו השתילים מכוסים לחלוטין), ולרכוש תמונות באופן מיידי. סרגל קנה המידה הוא 5 סנטימטר.

השוואת איור 2 של Ca מרחב והזמן ^{2 +} תגובה של שתילי יום 10 לגירויי לחץ שונים. ) סדרת זמן של תמונות הארה של שתילים נתון 400 מניטול מ"מ ו400 מניטול מ"מ בתוספת 1 CuCl ₂ פנל מ"מ (, משמאל), 75 mM NaCl ו75 mM NaCl בתוספת 1 מ"מ CuCl2 (, הפנל באמצע), ו1 מ"מ H ₂ O ₂ או 1 מ"מ H ₂ O ₂ בתוספת 1 מ"מ CuCl ₂ (, פנל מימין). פנלים העליונים ותחתונים שלהם תמונות הארה נרכשו במהלך שניות הראשונות 40 ושניות 40 השניה, בהתאמה. סרגל קנה מידה אינטנסיביות מצביע על עלייה של אותות הארה מנמוך (שחור) עד גבוה (לבן). B) תרשים בר של עוצמת הארה הממוצעת של שתילים בתגובה לגירויים לחץ המצוין.

איור 3 התקנה של ניסוי הדמיה confocal תא חי. ) קאמרי מותאם אישית בנוי עם שקופיות, coverslip עם ארבע פיסות טין וצמר גפן. שני זקני שתילים 5 יום מונחים על השקופית. קצה אחד של צינור פוליאתילן ממוקם ליד התא התאסף וקבוע עםחתיכות של נייר ואילו הקצה השני מחובר לשקופית 1 מ"ל מזרק. B) מותאמת אישית שנעשתה עם פרספקס יש תא פתוח באמצע ושני ערוצים שמחוברים לשני צידי הערוץ. coverslip אחד ממוקם בחלק העליון של המגלשה ושני צינורות POLYETHLENE ממוקמים בערוץ. Coverslip וצינורות קבועים בעמדה עם גריז סיליקון. סוף אחד הצינורות מחובר למזרק 1 מ"ל וסוף צינור אחר נשאר פתוח. שתיל בן 5 ימים ממוקם בתא וcoveslip הוא לשים על החלק העליון של השתיל ונחתם בגריז סיליקון. שקופית plexigalss עם התא התאסף מושם על השלב של המיקרוסקופ. שתילי C) ארבידופסיס גדלים בשתי בארות (משמאל) או 8 בארות (מימין) של מכסה זכוכית chambered המכילה שכבה דקה של 0.6% מphytagel בטרשת נפוצה תקשורת.

איור 4 Cytosolic וCa הגרעיני ^{2 +} תנודה בתגובה ללחץ מלח. ) תמונות Confocal מראות כי Case12 באו לידי הביטוי בציטופלסמה והגרעינים של תאי שורש (פנל משמאל) ותאי עלה (פנל מימין) של צמחים מהונדסים מבטא Case12. התמונה על הלוח הימני היא תמונה ממוזגת של autofluorescence האדום של כלורופלסטים וקרינה ירוקה של Case12. B) מתח מלח (150 mM NaCl) הנגרם על Ca ^{2 +} תנודה בcytosol (פנל עליון) וגרעינים (פנל תחתון) של תאי שורש. מיקומם של התאים נמדדו מסומן על ידי חיצים עם מספרים על לוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אנחנו הוכחנו מערכת FAS להקלטת Ca ^{2 +} תגובת מרחב וזמן של שתילי ארבידופסיס. מערכת הקלטה זו FAS Ca ^{2 +} מספקת גישה פשוטה, רגישה וחזקה שיכול להיות מותאמת למדידת Ca ^{2 +} דינמיקה מופעלת על ידי גירויים שונים, בנוסף לגירויים אביוטי המתח שמוצגים כאן. באמצעות מערכת זו, אנו יכולים בקלות להשוות ברקמה או גירויים ספציפיים ^{2 +} דינמיקת Ca מרחב וזמן ברמת הצמח כולו. הרגישות הגבוהה של FAS מאפשרת השימוש בגירויים בעוצמה נמוכים לבחינת תגובות Ca ^{2 +,} וזה חשוב עבור הימנעות חפצים הנגרמים על ידי נזקים פיזיים לתאים כאשר נעשה שימוש מתח בעוצמה גבוהה. שבעה לשתילי ארבידופסיס ישנים 10 יום הראה תגובת Ca ^{2 +} רקמה או גירויים ספציפיים, אם כי שתילים בשלבים פיסיולוגיים שונים עשויים להיות רגישים וסגוליות שונים בתגובה לגירוי נתון. לכן זהעדיף להשתמש ישנים שתילי 7-10 יום כדי להגדיל את התפוקה של מדידות FAS, שבו יכולים להיות דבקות סביב 100 שתילים על גבי פיסת סרט אחד. יחד עם ביצועים קלים ופשוטים, רגישות גבוהה ושחזור, מערכת FAS יכולה גם להיות מותאמת להקרנת מוטציות EMS mutagenized לתגובות Ca ^{2 +} שינו. לסינון מטרות, זה חיוני שיהיו שתילים אחידים, כי הם גדלו גם על הצלחת ודבקה על הסרט. ארבעה עד חמש שעות דגירה של שתילי סרט דבק עם h-CTZ בדרך כלל מספיק לכינון מחדש של aequorin. שימוש בסרט דבק עם חורים הוא עדיף משום שתגובה של apoaequorin וcofactor דורש חמצן. להשוואה של רקמה או גירויים ספציפיים תגובות Ca ^{2 +,} באמצעות קבוצות של שתילים במקור מאותו הסרט הוא קריטי משום שהמדינה של שתילים ו / או מצב הכינון מחדש עשוי להשפיע על הסכום הכולל של aequorin הפונקציונלי. כאשר requireme אלהNTS הם נפגשו, ההבדל של תגובת הארה הוא פרופורציונאלי לתגובת Ca ^{2 +} ברקמה או גירוי ספציפי.

Aequorin מדידה של אותות ^{2 +} Ca מבוסס משקף את התגובה של אוכלוסייה של התאים. Ca ^{2 +} מדידות עם זאת, בהתחשב בהטרוגניות של סוגי תאים ו / או הנגישות של תאים ברקמות לגירויים השונים, המבוססות על תוצאות Aequorin אינן שווה להתנהגותם של כל תא אחד. הבנת Ca ^{2 +} דינמיקה ברמה התאית דורשת מחוון Ca ^{2 +} שניתן לאתרם ברזולוציה subcellular. ההדמיה חיה תא confocal חלבון פלואורסצנטי של (FP) מבוסס מדדי Ca ^{2 +} מספק מערכת איתור Ca ^{2 +} מתקדמת להקלטת Ca ^{2 +} דינמיקה סלולרית עם רזולוציה סלולרית ברקמה רצויה. כאן, באמצעות הדמיה confocal תא חי ^{ו2 +} אינדיקטורים Ca מבוססי FP, הקלטנו Ca subcellular ^{2 +} 2 + מבוסס FP יושמו בצמחים בעלי מאפיינים שונים. בהשוואה לYCS, יש מחוון המבוסס על GFP יחיד Ca ^{2 +} כמה יתרונות: 1 Case12 אינו דורש סטי YFP וCFP מסנן או הנחות רבות וחישובים מורכבים הדרושים כדי למדוד ²² סריג. יש Case12 עירור / מקסימום פליטה בודד וניתן לאתר בקלות באמצעות מערכת סינון GFP סטנדרטית. .2 Case12 יציב תחת pH הפיזיולוגי, והוא יחסית חלבון קטן (46 KDA). כאשר הביע בצמחים, Case12 הממוקד שאינו מופיע בציטופלסמה, כמו גם את הגרעינים, כך ניתן להשתמש בם צמחים מהונדסים Case12 כדי לעקוב אחר Ca ^{2 +} דינמיקת cytosolic והגרעינית בו זמנית. חסרון של הכתב הזה הוא שזה הוא אינדיקטור שאינה ratiometric, כך רמות הקרינה מושפעות גם מגורמים שאינם קשורים לCa ^{2 +} ריכוז, כגון רמת הביטוי שלCase12 וpH המקומי. אף על פי כן, Case12 הוא נאות כדי לקבוע Ca ^{2 +} ריכוז סלולארי להשוואה של ^{2 +} דינמיקה של מרחב והזמן Ca בציטופלסמה ואברונים בין חומרים עם רקע גנטי שונה באותם תנאי הניסוי. בעתיד, GFP החדש Ca ^{2 +} מחוונים עם גבוה יותר יחס אות לרעש, קינטיקה מהירה ותגובה טובה יותר, כמו ²⁴ GCaMP3 וGCaMP5 ²⁵ הפגין בבעלי חיים מבוססים, יכול להיות אינדיקטורים טובים יותר להקלטה סלולרית או subcelluar Ca ^{2 +} דינמיקה ב צמחים.

מערכות גילוי Aequorin וCase12 המתוארות כאן לספק הורסות in vivo גישות למדידת ^{2 +} דינמיקת Ca מרחב וזמן בכל השתיל ורמות subcellular, בהתאמה. בשתי המערכות, בתנאי המדינה או צמיחה הפיזיולוגיות יכולים להשפיע על Ca ^{2 +} תגובות של השתילים או תאים. אם physically פגום או לא גדל במצב טוב, יש לי תאים יכולים ^{2 +} תגובות חלשות או אפילו לא Ca. בנוסף, משך הזמן של Ca ^{2 +} אותות מרחב ובזמן מושפע גם מהתנאים של השתיל במהלך המדידות. אותות הארה או הקרינה עלולים להפחית לאורך זמן בשל נזק הנגרם על ידי גירויים, ו / או צילום הנזק הנגרם על ידי הלייזר במקרה של ההדמיה confocal. למרות שלא ניתן להימנע מניזק הנגרם על ידי גירוי, phototoxicity יכול להיות מופחת על ידי הגבלת עוצמת ו / או תדירות של חשיפת לייזר. בנוסף, מערכת הקלטה מבוססת Aequorin Ca ^{2 +} מחייבת צעד הכינון מחדש. גורמים שיפריעו לדיפוזיה של CTZ לסלולרי ו / או תגובה של apoaequorin עם CTZ ישפיעו אותות הארה שקשורות ישירות לריכוז Ca ^{2 +.} לכן הריכוז של CTZ, כמו גם את משך הזמן והתנאים של הדגירה CTZ צריך להיות מותאמים לרגישות וreproducibil הטובות ביותרity. Ca ^{2 +} אינדיקטורים מקודד גנטי עשויים לא מדויקים לדווח Ca ^{2 +} ריכוזים סלולריים מסיבות אחרות, ובכלל זה לא מכוון מיקוד לתאים ספציפיים subcellular, רגישות טמפרטורה, או הפרעה של הכתב עם Ca2 הסלולרי + איתות מכונות ^23. מצאנו שיש לי Aequorin או Case12 צמחים מביעים שום פנוטיפים מורפולוגיים או מותנים ברורים כגון סובלנות מתח שונה. לכן לא סביר שיש לי Ca ^{2 +} אינדיקטורים מקודד גנטי אלה הפרעות עיקריות עם Ca ^{2 +} איתות בצמחים.

לסיכום, אנו מציגים כאן הוראות מפורטות לשימוש בשני Ca ^{2 +} מערכות גילוי למדידת Ca מרחב ובזמן ^{2 +} אותות בשני כל שתיל הצמח ורמות subcellular. שתי מערכות אלו יכולות לשמש כדי לקבוע רקמות (או סוג תא) או Ca גירויים ספציפי ^{2 +} דפוסים דינמיים עם רגישות גבוהה ושחזור. לכן הם כלים רבי עוצמה להבהרת רשתות גנים העומדות בבסיס איתות Ca ^{2 +} בתגובה לרמזים סביבתיים שונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm x 10 cm square Petri dish	VWR	60872-310
Adhesive film	VWR	60941-062
Polyethylene tubing	PerkinElmer	9908265
1 ml syringe	VWR	53548-000
Silicone grease	Beckman	335148
2-well chambered cover glass	Nalge Nunc international	155379
8-well chambered cover glass	Nalge Nunc international	155409
Luminescence imaging system	Princeton Instruments	N/A
Inverted confocal laser-scanning microscope	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon A1R
Imaging software	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon Elements
DataGraph	Visual Data Tools Inc	N/A	DataGraph 3.1.1 is the newest version
Coelenterazine	NanoLight Technolgies	#301B NF-BCTZ-FB
All purpose bleach	Any local store	N/A
Triton X-100	Fisher	BP151500
MS salt	Phytotechnology Labs	M524-50L
Sucrose	VWR	BDH8029-12KG
Agar	Sigma	A1296-5KG
Phytagel	Sigma	P8169-1KG