Summary
Сигнализации Ca 2 + регулирует разнообразные биологические процессы в растениях. Здесь мы представляем подходы для мониторинга абиотическую стресс, вызванный пространственная и временная Са 2 + сигналы в Arabidopsis клеток и тканей с использованием генетически закодированные Ca 2 + показатели экворин или Case12.
Abstract
Развивающие и средовые сигналы вызывают Ca 2 + колебания в клетках растений. Стимул конкретных пространственно-временные Са 2 + модели воспринимаются сотовых Ca 2 + связывающих белков, которые инициируют Ca 2 + сигнальные каскады. Тем не менее, мы все еще мало знаем о том, как стимул сигналы конкретного Ca 2 + генерируются. Специфика сигнала Са 2 + может быть связано с сложной регуляции деятельности каналов Са 2 + и / или перевозчиков в ответ на данный стимул. Чтобы определить эти клеточные компоненты и понять свои функции, она имеет решающее значение для использования системы, позволяющие чувствительный и надежный запись сигналов Ca 2 + как на тканевом и клеточном уровнях. Генетически кодируемые Са 2 + показатели, которые ориентированы на различные клеточные отсеков обеспечили платформу для живых клеток конфокальной микроскопии клеточных Са 2 + сигналов. Здесь мы опишем инструкциюс для использования двух Са 2 + систем обнаружения: экворин основе ФАС (фильм клейкие саженцы) люминесценции Ca 2 + изображений и case12 основе конфокальной флуоресцентной живая клетка Ca 2 + изображения. Свечение изображений с помощью системы FAS обеспечивает простой, надежный и чувствительный обнаружение пространственных и временных Са 2 + сигналов на тканевом уровне, в то время как конфокальной микроскопии живых клеток с помощью Case12 обеспечивает одновременное обнаружение цитозольного и ядерных Са 2 + сигналов с высоким разрешением.
Introduction
Растительная клетка реагирует на окружающую среду посредством сигнализации, которая координирует сотовые действия. Рано клеток событие сигнализации в ответ на раздражители среды является переходным Ca 2 + увеличение. Узор, или подпись преходящим повышением в свободном Са 2 + концентрации характеризуется своей амплитудой, частотой и длительностью. Различные пространственно-временные подписи Ca 2 + регулировать различные клеточные активности 1. Конкретные стимулы, такие как тепло, холод, соль, засухи, света, или растительных гормонов, может точно настроить пространственно-временную активность мембранных локализованные Са 2 + каналов и / или перевозчиков, в результате конкретных Са 2 + подписей. Хотя Са 2 + транспортеры были хорошо характеризуется, мало известно о молекулярных идентичностей и функций каналов Ca 2 + в растения 1. Генетические экраны для мутантов с измененной Са 2 + ответ на стресс стимулы могут быть эффективным октренере для идентификации компонентов, которые составляют подписей Ca 2 +. Недавно на основе нескольких экворин Са 2 + системы обнаружения были разработаны облегчить генетические экраны для Са 2 + компоненты сигнализации в ответ атаки патогена и абиотическим стрессам 2-4.
Экворин был впервые использован для обнаружения Са 2 + сигналы в растениях в начале 1990-х годов 5. С тех пор, экворин была ориентирована в различных клеточных компартментах, таких как цитоплазме 5, 6 ядра, хлоропластов 7, 8, тонопласт митохондрий 9, 10 и стромы, а также в различных типах клеток в корне, чтобы контролировать конкретную клетку Са 2 + сигналы 11. Измерений, основанный экворин Ca 2 + выявить пространственную и временную Ca 2 + ответ популяции клеток под напряжением стимулы. Тем не менее, в большинстве случаев, Са 2 + ответы одиночных клеток являются unsynchroniзет в ответивших ткани 4. Поэтому записи экворин Ca 2 + не обязательно сообщить Са 2 + сигнал в индивидуальных клетках. В последние годы, генетически кодируемых флуоресцентный белок (ФП) основе Ca 2 + показатели, такие как желтый Cameleon (YCS) 12 и 13 CASEs12 были использованы для изучения Са 2 + сигналов с высоким разрешением субклеточном. YCS являются флуоресценции резонансный перенос энергии (FRET) основе Ca 2 + показатели, содержащий CFP и YFP варианты связаны с Са 2 +-связывающий белок кальмодулин и калмодулин связывания пептида М13. Кальмодулин претерпевает конформационные изменения, как он связывается с Са 2 +, тем самым приносит CFP и YFP ближе друг к другу, что приводит к увеличению передачи энергии (усиливается лад). Уровень FRET в течение долгого времени, рассчитанный примерно как отношение YFP к интенсивности сигналов CFP, отражает внутриклеточного Ca2 + динамику. Несколько YC варианты были использованы в растениях. YC3.6 было тargeted в цитозоль 14,15, ядра 16, митохондрий 17 и мембране 18, и YC4.6 и D4ER были направлены в отделение скорой 15,19, и D3cpv была направлена на пероксисомах 20. Трансгенные растения, выражающие YCS позволить жить-ячейки изображения Ca 2 + динамики внутри различных клеточных отсеках различных типов клеток. Случаях (предположительно Ca lcium себе nsor) одиночные циркулярно переставляются флуоресцентные белки (cpFPs), несущие калмодулин и калмодулина-связывающий пептид М13. После связывания с Са 2 +, МИОНы пройти конформационные изменения, что приводит к увеличению интенсивности флуоресценции. Корреляция между ответ флуоресценции МИОНа и Са 2 + концентрации позволяет внутриклеточный Ca 2 + динамика должна быть измерена количественно. Case12 вариант увеличилась флуоресценции 12 раз в Са 2 + -насыщенных форм. Н. benthiminana растения временно EXPRэссинга Case12 или Arabidopsis растения, стабильно экспрессирующие Case 12 были использованы для изучения Ca 2 + сигнализацию в оборонной и абиотическим стрессам 4,21. Асинхронный пространственная и временная Ca 2 + колебания в клетках, отвечающих на атаки патогена, или к обезвоживанию стресса были выявлены с основанной Case12 Са 2 + визуализации.
Здесь мы представляем подробные инструкции по экворин основе люминесценции визуализации ткани, так и стимулов определенной Са 2 + динамика в Arabidopsis рассаду, и для конфокальной микроскопии от цитозольной и ядерной Са 2 + динамика в Arabidopsis корневых клеток, которые выражают Дело 12. люминесценции изображений ФАС может быть адаптирована для анализа стресс-индуцированной Ca 2 + динамику в целые растения или тканей, не описанных здесь, или для скрининга мутагенизированных популяции растений Arabidopsis для мутантов с измененной стресса, вызванного Са 2 + сигналов. Установка изображений живых клеток Ca 2 + могут быть адаптированы для анализа Ca2 + динамика в рамках различных отсеков subcelluar или в различных типах клеток с помощью других Ca 2 + показатели.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 экворин основе Ca 2 + изображений Использование системы FAS
- Подготовка саженцев для визуализации люминесценции. Стерилизацию семена Arabidopsis растений, экспрессирующих экворин 10% раствором хлорной извести, содержащей 0,01% Triton-100. Сейте стерильные семена на квадратной пластины (10 х 10 см квадратный чашку Петри с сеткой,), содержащие полную силу MS (Murashige и Skoog базальной солевой смеси), 1% сахарозы и 1,2% агара. Место пластины вертикально в камере роста после стратификации при температуре 4 ° С в течение 2 дней (Рисунок 1А).
- Трансфер рассаду на пленку. Поместите клейкую пленку (фиг.1В) в верхней части 7-10 дневных проростков, растущих на пластине. Аккуратно вставьте пленку вручную, чтобы убедиться, что саженцы придерживаться фильма (Рисунок 1C). Очистите пленку аккуратно, чтобы рассада остаются придерживался фильма (Рисунок 1D и 1E)
- Выдержите рассаду с кофактора. Поместите Adhered саженцы на квадратной пластины (10 х 10 см), содержащей 15 мл 2 мкг / мл Н-CTZ (коэлентеразина) в воде. Инкубируйте саженцы при комнатной температуре в течение 4 ч, чтобы в течение ночи (рис 1F).
- Подготовка к визуализации люминесценции. Возьмите фильм из раствора ч-ЧТЗ и сократить его пополам, образуя две части. Поместите каждый кусок пленки с саженцы лицевой стороной вверх в двух различных пластин. Оставьте пластин в темноте в течение 5 мин.
- Приобретать люминесценции изображения. В темноте, разместить две пластины рядом друг с другом на стадии системе формирования изображения люминесценции (рис 1 г). Получение изображений сразу же после добавления 20 мл раствора стимулов к пластинам одновременно.
- Анализ люминесценции изображения. Выберите тот же диапазон отображения для всех люминесцентных изображений. Обрезать область интереса (ROI) и генерировать изображения, как JPEG файлы (рисунок 2А). Кроме того, экспортировать изображения в виде файлов формата SPE и импортировать их вПрограммное обеспечение для анализа изображений ImageJ. Установить измерения для вычисления среднего серого стоимости ROI. Выберите тот же размер области ROI и измерить средние серые и представлять данные гистограмм (Рисунок 2B).
2 Онлайн сотовый конфокальной Ca 2 + изображений
- Подготовка саженцев для конфокальной микроскопии. Стерилизацию семена Arabidopsis растений, экспрессирующих case12 10% раствором хлорной извести, содержащей 0,01% Triton. Сейте стерильные семена на пластину, содержащую полный рабочий прочностные MS соли, 1% сахарозы и 1,2% агара. Место пластины вертикально в камере роста после стратификации при 4 ° С в течение 2 дней.
- Настройка визуализации палаты
- Соберите камеру, использующую горка и покровное (палата A). Место кусок пропитанной водой ваты на середине слайда. Затем перенесите одну или две 5 день сеянцев от пластины на верхней части воды замачивают ваты. Придерживайтесь небольшие кусочки глины каждому углу покровного А.Н.е место покровное на вершине рассады, чтобы создать зазор (камеры) между покровным и слайд-(фиг.3А, слева). Подключение один конец полиэтиленовой трубки (диаметром 0,58 мм) до 1 мл шприца, а другой конец трубки в непосредственной близости от камеры. Держите трубку в месте с лентой (рисунок 3А, правая панель).
- Соберите камеру, использующую плексигласа камеру (палата B).
- Нанесите тонкий слой силиконовой смазки вокруг двух труб полиэтиленовых (диаметром 0,58 мм) и нажмите труб с покрытием в каналы на каждой стороне плексигласа камеры (3В левой панели). Нанесите тонкий слой силиконовой смазки на поверхность камеры, содержащей канавки трубки и нажмите покровное в смазку для герметизации одной стороны отверстия камеры (вырезали).
- Трансфер пятидневный старый рассаду от пластины в камеру и поместить кусочек ваты, смоченной водой на верхнем Oе рассады. Спрэд силиконовую смазку на другую поверхность камеры, и нажать другую покровное на вершине, чтобы запечатать. Подключение к концу одной из труб с 1 мл шприца. Оставьте конец другой трубы открыт (фигура 3В правая панель).
- Подготовьте камеру, использующую патрон покровного стекла (палата C). Стерилизовать патрон покровного стекла с 70% этанола и оставить его на капоте до сухой. Добавить 0,6 мл или 0,2 мл полного прочности MS среды, содержащей 1% сахарозы и 0,5% phytagel в каждую лунку в 2-а камеры или 8-а камеры (фиг.3С правая панель), соответственно. Стерилизовать семена и посеять семена непосредственно в патрон покровного стекла, содержащего тонкий слой прозрачного геля и пусть они растут вертикально в течение 5 дней (Рисунок 3C).
- Получение изображений с помощью конфокальной микроскопии. Чтобы применить стресс стимулы, такие как соль, холодно или перекиси, медленно вдохнуть около 200 мкл 150 мМ NaCl, лед-полковникD вода или 1 мМ Н 2 О 2 Раствор в камеру (камеры А и В) как раз перед получения изображений, или слегка добавить 500 мкл или 100 мкл раствора стимула к лунку 2-х или 8-луночного камеры, соответственно . Захват изображения сразу после применения стимулирующих решение с использованием перевернутой Nikon A1R конфокальной лазерной сканирующей микроскопии с погружением в воду линзы 20X (числовой апертурой 0,75). Соберите временной ряд изображений на 4 интервала с с возбуждения и эмиссии длинах волн 488 нм и 500 - 550 нм, соответственно, и на пикселей резолюции 512 х 512.
- Анализ изображений
Использование Nikon Элементы, трансформирования были нарисованы вокруг каждой ячейки (или области), представляющие интерес. Всего интенсивность в пределах каждого ROI измеряли в течение долгого времени с помощью диалогового окна Время измерения (ImageJ можно использовать вместо). Всего измерения интенсивности были экспортированы и обработаны в DataGraph. Амплитуда всплеска Ca 2 + был определен как пиковой интенсивности минус отдыхает интенсивности, продолжительности, как гое время между началом и завершением шпилем, и период, что интервал времени между соседними шипами пиков двух шипов. T -test был использован для сравнения средства.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Маннитол, NaCl и H 2 O 2 были использованы в качестве прокси для обезвоживания, соли и окислительного стресса стимулов, соответственно. Чтобы убедиться, что тяжелых ионов металла Cu 2 + синергетический эффект с любой из этих трех стрессовых раздражителей, мы сравнили Ca 2 + ответ на каждый стимулов в присутствии или в отсутствие Cu 2 +. Как показано на рисунке 2, люминесценция изображений ФАС показали, что Arabidoposis саженцы по-разному реагировали обезвоживания, соли и окислительного стресса. Для концентрации стимулов, которые мы исследовали в этом исследовании, 75 мМ NaCl индуцированной сильнейший Ca 2 + ответ в листьях и корнях в течение первого 40 сек воздействия (2А средняя панель и рис 2B), в то время как 1 мМ H 2 O 2 индуцируется сильный Ca 2 + ответ как в листьях и корнях в течение первого и второго 40 сек (2А правая панель). Решение 400 мМ маннита только индуцированныхCa 2 + ответ в корнях в течение первых 40-х годов и очень слабых сигналов в листьях во второй 40 сек. Cu2 + резко усиливается амплитуды и продолжительности Са 2 + сигналов, вызванных NaCl и маннита (2А левая панель). Похоже, что Cu 2 + были тормозящее действие на H 2 O 2 индуцированного Са 2 + сигналы, уменьшая как амплитуду и длительность (2А правая панель и 2B).
Использование Case12 выражая Arabidopsis растений, мы измерили Ca 2 + динамику в цитозоле и ядер одновременно. Молекулярная масса Case12 составляет 46 кДа, поэтому трансгенные растения, экспрессирующие Case12 есть GFP сигналы в обоих цитозоле и ядра листа и корневые клетки (рис 4а). Индивидуальные (фиг.3А и 3В) или коммерческие камеры (фиг.3С) были использованы для изображений живых клеток с конфокальноймикроскоп. Применение 150 мМ NaCl в рассады в камере, мы наблюдали изменения интенсивности флуоресценции и в цитозоле и ядре отдельных клеток (фиг.4В и С Дополнительный Фильм 1). Использование NIS-Elements (Imaging программное обеспечение, Nikon Instruments Инк), мы измерили интенсивность флуоресценции в регионах, представляющих интерес (ROI) с течением времени. Амплитуда, длительность и частота цитозольной и ядерной Са 2 + колебаний представлены в графическом виде на рисунке 4В. Амплитуда и период Са 2 + шипы в цитоплазме и ядрах сильно различаются между клетками того же корня, а также через клеток в разных корней. Амплитуда и период цитозольными Са 2 + шипы были 60,36 ± 45,22 а.е. (произвольный единичный) и 58,24 ± 15,70 сек, соответственно. Амплитуда и период ядерных Са 2 + шипы были 316,26 ± 75,24 (АС) и 61,71 ± 16,31 сек, соответственно. В отличие от этого,продолжительность цитозольными и ядерных Ca 2 + шипы были похожи между клетками, которые были 17,43 ± 3,67 сек и 17,33 ± 2 сек, соответственно. Амплитуда Са 2 + шипы уменьшилось с течением времени, что может быть обусловлено изменением фокальной плоскости и / или потере ответ на стимулы, поскольку подчеркнуть неблагоприятного состояния в пробирке. Эти результаты показывают, что соль стресс вызывает Ca2 + колебание как в цитоплазме и ядре.
Рис.1 экворин основе системы FAS для измерения пространственно-временные Ca 2 + динамику в ответ на стресс стимулы. А) Grow Arabidopsis рассаду вертикально на пластине, содержащей MS средств массовой информации. B, C) Поместите клейкую пленку (В) на верхней части проростков (с). D, E) F) Инкубировать рассаду, прилипших к пленке с 2 мкг / мл Н-CTZ в воде в течение 4 часов. G), отрезать пленку посередине и поместить каждую часть в другой пустая тарелка. Оставьте пластин в темноте в течение 5 мин. Применить одновременно контролировать и стимулы решения (убедитесь, что сеянцы полностью покрыты), и сразу же получать изображения. Шкалы 5 см.
Рисунок 2 Сравнение пространственно-временной Са 2 + ответ 10 день саженцев на различные стимулы стресса. А) временной ряд люминесцентных изображений саженцев подвергаются 400 мМ маннита и 400 мМ маннита плюс 1 мМ CuCl 2 (A, левая панель), 75 мМ NaCl и 75 мМ NaCl плюс 1 мМ CuCl2 (А, средняя панель), и 1 мМ H 2 O 2 или 1 мМ H 2 O 2 плюс 1 мМ CuCl 2 (А, правая панель). Верхние и нижние панели А являются люминесцентные изображения, полученные во время первого 40 сек и второй 40 сек, соответственно. Шкала интенсивности бар указывает на увеличение сигналов люминесценции от низкой (черный) до высокой (белый). B) гистограмма средней интенсивности люминесценции рассады в ответ на указанных стрессовых раздражителей.
Рис.3 Setup из эксперимента конфокальной микроскопии живых клеток. А) настроены камера встроена с горкой, покровного с четырьмя кусками глины и ваты. Два 5 дней сеянцы помещают на предметное стекло. Один конец полиэтиленовой трубки помещается рядом с собранной камеры и фиксируетсяа кусков ленты, а другой конец соединен с 1 мл шприц. б) индивидуальные слайд заключил с оргстекла имеет открытую камеру в середине и двумя каналами, которые подключены к двум сторонам канала. Один покровное находится на верхней части ползуна и два полиэтиленовой трубки размещены в канале. Покровного и трубки фиксируются в положении с силиконовой смазкой. В конце одной из труб соединена с шприца емкостью 1 мл и конец другой трубы остается открытым. 5 день старый рассады помещают в камеру и coveslip наносится на верхней части рассады и герметизируют силиконовой смазкой. Plexigalss слайд с собранным камере помещается на столик микроскопа. C) Arabidopsis рассаду выращивают в двух скважин (слева) или 8 скважин (справа) под патрон покровного стекла, содержащего тонкий слой 0,6% phytagel в MS СМИ.
Рисунок 4 Цитозольный и ядерная Ca 2 + колебание в ответ на солевой стресс. А) Конфокальные изображения показывают, что Case12 выражается в цитоплазме и ядрах клеток корня (слева) и клетках листа (справа) от трансгенных растений, экспрессирующих Case12. Изображение на правой панели является объединенная изображение красного автофлуоресценции хлоропластов и зеленой флуоресценции Case12. B) солевого стресса (150 мМ NaCl), индуцированного Са 2 + колебание в цитозоле (верхняя панель) и ядер (нижняя панель) из корневые клетки. Места измеренных клеток указаны стрелками с номерами на панели.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы продемонстрировали систему FAS для записи пространственно-временную Ca 2 + ответ Arabidopsis рассады. Это ФАС Ca 2 + система записи обеспечивает простой, чувствительный и надежный подход, который может быть адаптирован для измерения Са 2 + динамику запускаются различными стимулами в дополнение к абиотическим стресс-стимулы, которые представлены здесь. Используя эту систему, мы можем легко сравнить по ткани, или стимулы-специфические пространственно-временные Ca 2 + динамику на уровне целого завода. Высокая чувствительность FAS позволяет использовать низкой интенсивности стимулов для изучения реакции Ca 2 +, который является важным для предотвращения искажений, вызванных физических повреждений клеток при использовании высокой интенсивности напряжений. Семь 10-дневных проростков Arabidopsis показали, ткани или конкретных стимулов-Са 2 + отклик, хотя саженцы в различных физиологических стадиях могут иметь различную чувствительность и специфичность в ответ на данный стимул. ПоэтомуПредпочтительно использовать 7-10 суточных саженцев, чтобы увеличить пропускную способность измерений ФАС, в котором около 100 саженцев может быть наклеена на одном куске пленки. Вместе с легкой и простой производительности, высокой чувствительностью и воспроизводимостью, система ФАС также может быть адаптирована для скрининга EMS мутагенизированных мутантов для измененных Ca 2 + ответов. Для целей скрининга, очень важно иметь единые саженцы, которые хорошо выросли на тарелку и прилипшие на пленку. Четыре-пять часов инкубации пленочных придерживался сеянцев с ч-ЧТЗ, как правило, достаточно для воссоздания акворина. Использование клейкой пленки с отверстиями является предпочтительным, поскольку реакция apoaequorin и кофактора требует кислорода. Для сравнения ткани или стимулов-специфических ответов Ca 2 +, с помощью группы саженцев родом из того же фильма является критическим, так как состояние саженцев и / или условие восстановление может повлиять на общее количество функциональных акворина. Когда эти requiremeНТС будут выполнены, разность ответ люминесценции пропорциональна по ткани или стимула конкретных Са 2 + ответ.
Экворин основе измерение сигналов Ca 2 + отражают реакцию населением клеток. Тем не менее, принимая во внимание неоднородность типов клеток и / или различной доступности клеток в тканях на стимулы, результаты экворин на основе Са 2 + измерения не приравнивают к поведению любой одной ячейке. Понимание Ca 2 + динамику на клеточном уровне требует Ca 2 + индикатор, который может быть обнаружен с субклеточной резолюции. Живая клетка конфокальной микроскопии флуоресценции белка (FP) основе Ca 2 + показатели предоставляет расширенный Ca 2 + системы обнаружения для записи клеточные Ca 2 + динамику с сотовой резолюции в желаемой ткани. Здесь, используя живой клетки конфокальной микроскопии и FP-основанные Ca 2 + показатели, мы записали субклеточную Са 2 + Ca 2 + были реализованы в установках с различными характеристиками. По сравнению с YCS, одного GFP основе Ca 2 + индикатор имеет некоторые преимущества: 1 Case12 не требует YFP и CFP наборы фильтров или много предположений и сложные вычисления, необходимые для измерения FRET 22. Case12 имеет единственную возбуждения / максимумов излучения и могут быть легко обнаружены с использованием стандартного набора GFP фильтра. 2 Case12 стабилен при физиологическом рН, и является относительно небольшой белок (46 кДа). При экспрессии в растениях, нецелевой Case12 появляется в цитоплазме, а также ядер, так Case12 трансгенные растения могут быть использованы для отслеживания и цитозольных ядерного Ca 2 + динамику одновременно. Недостатком этого репортера в том, что он не является пропорциональный индикатор, таким образом, уровни флуоресценции, также зависит от факторов, которые не связаны с концентрацией Са 2 +, таких как уровень экспрессииCase12 и местный рН. Тем не менее, Case12 адекватна определить клеточный Ca 2 + концентрации для сравнения пространственно-временных Ca 2 + динамики в цитоплазме и органелл между материалами с различными генетическими фонов при тех же экспериментальных условиях. В будущем, новая GFP основе Ca 2 + показатели с высшим сигнал-шум, быстрой кинетики и большей ответ, как GCaMP3 24 и GCaMP5 25 продемонстрировали в животных, может быть лучшие показатели для записи сотовой или subcelluar Ca 2 + динамику в растения.
Системы обнаружения экворин и Case12 описанные здесь обеспечить неразрушающего в естественных подходов для измерения пространственно-временных Ca 2 + динамики на всей рассады и субклеточном уровнях, соответственно. В обеих системах, физиологического состояния или условия роста может повлиять Са 2 + ответы сеянцев или клеток. Если PhysicaLLY повреждены или не выросли в хорошем состоянии, клетки могут иметь слабые или даже не Ca 2 + ответов. Кроме того, продолжительность пространственных и временных Са 2 + сигналов, также страдают от условий рассады во время измерений. Люминесцентные или флуоресцентные сигналы могут уменьшаться с течением времени за счет стимулов-индуцированные повреждения, и / или лазер-индуцированной фото-повреждения в случае конфокальной микроскопии. Хотя стимул-индуцированной повреждение не может быть предотвращено, фототоксичность может быть уменьшена путем ограничения интенсивности и / или частоту лазерного воздействия. Кроме того, на основе экворин Ca 2 + система записи требует стадии восстановления. Факторы, которые прерывают диффузию ЧТЗ к клетке и / или реакции apoaequorin с ЧТЗ повлияет люминесценции сигналы, которые связаны непосредственно с Са 2 + концентрации. Поэтому концентрация CTZ, а также продолжительность и условия CTZ инкубации должны быть оптимизированы для лучшей чувствительности и reproducibilность. Генетически кодируемые Са 2 + показатели могут неточно сообщить клеточные концентрации Ca 2 + и по другим причинам, в том числе непреднамеренное ориентации на конкретные субклеточных отсеков, температурной чувствительности, или вмешательства корреспондента сотовой Ca2 + оборудование 23 сигнализации. Мы обнаружили, что экворин или Case12 выражающие растения не имеют очевидных морфологических или условные фенотипы, например, изменение стрессоустойчивости. Поэтому маловероятно, что эти генетически закодированные Са 2 + показатели имеют основные помехи с Са 2 + сигнализации в растениях.
Таким образом, мы представляем здесь подробные инструкции по использованию двух Са 2 + систем обнаружения для измерения пространственных и временных Ca 2 + сигналы как на всей рассады растений и субклеточном уровнях. Эти две системы могут быть использованы для определения ткани (или тип клеток) или раздражители-специфический Ca2 + динамические модели с высокой чувствительностью ивоспроизводимость. Поэтому они являются мощными инструментами для выяснения генных сетей, которые лежат Ca 2 + сигнализацию в ответ на различные сигналы окружающей среды.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm x 10 cm square Petri dish | VWR | 60872-310 | |
| Adhesive film | VWR | 60941-062 | |
| Polyethylene tubing | PerkinElmer | 9908265 | |
| 1 ml syringe | VWR | 53548-000 | |
| Silicone grease | Beckman | 335148 | |
| 2-well chambered cover glass | Nalge Nunc international | 155379 | |
| 8-well chambered cover glass | Nalge Nunc international | 155409 | |
| Luminescence imaging system | Princeton Instruments | N/A | |
| Inverted confocal laser-scanning microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon A1R |
| Imaging software | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Elements |
| DataGraph | Visual Data Tools Inc | N/A | DataGraph 3.1.1 is the newest version |
| Coelenterazine | NanoLight Technolgies | #301B NF-BCTZ-FB | |
| All purpose bleach | Any local store | N/A | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151500 | |
| MS salt | Phytotechnology Labs | M524-50L | |
| Sucrose | VWR | BDH8029-12KG | |
| Agar | Sigma | A1296-5KG | |
| Phytagel | Sigma | P8169-1KG |
References
- Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. Calcium signals: the lead currency of plant information processing. Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).
- Pan, Z., Zhao, Y., Zheng, Y., Liu, J., Jiang, X., Guo, Y. A high-throughput method for screening Arabidopsis mutants with disordered abiotic stress-induced calcium signal. J. Genet. Genomics. 39 (5), 225-235 (2012).
- Ranf, S., et al. Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana. Mol. Plant. 5 (1), 115-130 (2012).
- Zhu, X., Feng, Y., Liang, G., Liu, N., Zhu, J. K. Aequorin-based luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Mol. Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
- Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).
- Van der Luit, A. H., Olivari, C., Haley, A., Knight, M. R., Trewavas, A. J. Distinct calcium signalling pathways regulate calmodulin gene expression in tobacco. Plant Physiol. 121 (3), 705-714 (1999).
- Johnson, C. H., et al. Circadian oscillations of cytosolic and chloroplastic free calcium in plants. Science. 269 (5232), 489-503 (1995).
- Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signature after acclimation. Plant Cell. 8 (3), 489-503 (1996).
- Logan, D. C., Knight, M. R. Mitochondrial and cytosolic calcium dynamics are differentially regulated in plants. Plant Physiol. 133 (1), 21-24 (2003).
- Mehlmer, N., Parvin, N., Hurst, C. H., Knight, M. R., Teige, M., Vothknecht, U. C. A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot. 63 (4), 1751-1761 (2012).
- Kiegle, E., Moore, C. A., Haseloff, J., Tester, M. A., Knight, M. R. Cell-type-specific calcium responses to drought, salt and cold in the Arabidopsis root. Plant J. 23 (2), 267-278 (2000).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat. Protoc. 1 (3), 1057-1065 (2006).
- Souslova, E., et al. Single fluorescent protein-based Ca2+ sensors with increased dynamic range. BMC. Biotechnol. 7, 37-46 (2007).
- Tanaka, K., Swanson, S., Gilroy, S., Stacey, G. Extracellular nucleotides elicit cytosolic free calcium oscillations in Arabidopsis. Plant Physiol. 154 (2), 705-719 (2010).
- Iwano, M., et al. Fine-tuning of the cytoplasmic Ca2+ concentration is essential for pollen tube growth. Plant Physiol. 150 (3), 1322-1334 (2009).
- Sieberer, B., Chabaud, M., Timmers, A., Monin, A., Fournier, J., Barker, D. A nuclear-targeted Cameleon demonstrates intranuclear Ca2+ spiking in Medicago truncatula root hairs in response to rhizobial nodulation factors. Plant Physiol. 151 (3), 1197-1206 (2009).
- Loro, G., Drago, I., Pozzan, T., Lo Schiavo, F., Zottini, M., Costa, A. Targeting of Cameleons to different subcellular compartments reveals a strict cytoplasmic/mitochondrial Ca2+ handling relationship in plant cells. Plant J. 71 (1), 1-13 (2012).
- Krebs, M., et al. FRET-based genetically encoded sensors allow high-resolution live cell imaging of Ca2+ dynamics. Plant J. 69 (1), 181-192 (2012).
- Bonza, M. C., Loro, G., Behera, S., Wong, A., Kudla, J., Costa, A. Analyses of Ca2+ accumulation and dynamics in the endoplasmic reticulum of Arabidopsis root cells using a genetically encoded Cameleon sensor. Plant Physiol. 163 (3), 1230-1241 (2013).
- Costa, A., et al. H2O2 in plant peroxisomes: An in vivo analysis uncovers a Ca2+ dependent scavenging system. Plant J. 62 (5), 760-772 (2010).
- Zhu, X., Caplan, J., Mamillapalli, P., Czymmek, K., Dinesh-Kumar, S. P. Function of endoplasmic reticulum calcium ATPase in innate immunity-mediated programmed cell death. EMBO J. 29 (5), 1007-1018 (2010).
- Roszik, J., Lisboa, D., Szöllosi, J., Vereb, G. Evaluation of intensity-based ratiometric FRET in image cytometry--approaches and a software solution. Cytometry A. 75 (9), 761-767 (2009).
- Kotlikoff, M. I. Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology. J. Physiol. 578 (Pt 1), 55-67 (2007).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
