Summary
La señalización de Ca2 + regula diversos procesos biológicos en las plantas. Aquí presentamos los enfoques para el control de estrés abiótico inducida espacial y temporal Ca 2 + señales en las células y tejidos que usan las codificados genéticamente Ca 2 + indicadores Aequorina o Case12 Arabidopsis.
Abstract
Señales de desarrollo y ambientales inducen Ca 2 + fluctuaciones en las células vegetales. Espacio-temporales de Ca 2 +-patrones de estímulo específico son detectados por las proteínas de unión a Ca 2 + celulares que inician Ca 2 + cascadas de señalización. Sin embargo, todavía sabemos poco sobre cómo estímulo señales específicas Ca 2 + se generan. La especificidad de una señal de Ca2 + puede atribuirse a la regulación sofisticada de las actividades de los canales y / o transportadores de Ca 2 + en respuesta a un estímulo dado. Para identificar estos componentes celulares y entender sus funciones, es crucial usar sistemas que permiten una grabación sensible y robusta de señales de Ca 2 +, tanto en el tejido y niveles celulares. Genéticamente codificados Ca 2 + indicadores que están dirigidos a diferentes compartimentos celulares han proporcionado una plataforma para la célula viva imagen confocal de celulares Ca 2 + señales. Aquí se describe la instruccións para el uso de dos sistemas de detección de Ca 2 +: Aequorina basa FAS (adhesivo de película) plántulas luminiscencia Ca 2 + de imágenes y basado case12 de fluorescencia confocal de células vivas Ca 2 + de imágenes. De imágenes de luminiscencia usando el sistema FAS ofrece una detección simple, robusto y sensible de espaciales y temporales Ca 2 + señales a nivel de los tejidos, mientras que la célula viva imagen confocal utilizando Case12 ofrece detección simultánea de citosólicas y nucleares Ca 2 + señales con una resolución alta.
Introduction
La célula de la planta responde al medio ambiente a través de señalización que coordina las acciones celulares. Un evento de señalización temprana de la célula en respuesta a estímulos del medio ambiente es un aumento transitorio de Ca 2 +. El patrón, o la firma de un aumento transitorio en la concentración de Ca2 + libre se caracteriza por su amplitud, frecuencia, y duración. Firmas Ca 2 + espacio-temporales diferentes regulan diferentes actividades celulares 1. Estímulos específicos, como el calor, el frío, la sal, la sequía, la luz o las hormonas vegetales, pueden afinar la actividad espacio-temporal de Ca 2 + canales de membrana localizada y / o transportistas, lo que resulta en específicos de Ca 2 + firmas. Aunque Ca 2 + transportistas han sido bien caracterizado, se sabe poco sobre las identidades moleculares y las funciones de los canales de Ca 2 + en las plantas 1. Pantallas genéticos para mutantes con alteración de Ca 2 + respuesta al estrés estímulos pueden ser un apr efectivaoach para la identificación de los componentes que componen las firmas de Ca 2 +. Ca 2 + sistemas de detección Recientemente basa varios Aequorina han sido desarrollados para facilitar las pantallas de genética para el Ca 2 + señalización componentes en respuesta al ataque de patógenos y estrés abiótico 2-4.
Aequorina fue utilizado por primera vez para detectar Ca 2 + señales en plantas a principios de 1990 5. Desde entonces, la Aequorina se ha dirigido a diferentes compartimentos celulares, tales como el citoplasma 5, el núcleo 6, 7 cloroplastos, tonoplasto 8, 9 mitocondrias, y el estroma 10, así como a diferentes tipos de células en la raíz para supervisar celda específica Ca 2 + señales 11. Mediciones de Ca 2 + basado Aequorina revelan la espacial y temporal Ca 2 + respuesta de una población de células para estresar estímulos. Sin embargo, en la mayoría de los casos, las respuestas de la Ca 2 + de las células individuales son unsynchronizado en el tejido de responder 4. Por lo tanto, la grabación Aequorina Ca 2 + no informa necesariamente la señal de Ca 2 + en las células individuales. En los últimos años, la proteína fluorescente codificada genéticamente (FP) a base de Ca 2 + indicadores, como cameleon amarilla (YCs) 12 y CASEs12 13 se han utilizado para estudiar Ca 2 + señalización con alta resolución subcelular. YCs son la transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) a base de Ca 2 + indicadores, que contiene PPC y YFP variantes vínculo del Ca 2 + vinculante calmodulina proteína y péptido de unión a calmodulina-M13. La calmodulina sufre un cambio conformacional ya que se une a Ca 2 +, con lo que trae PPC y YFP más cerca juntos, resultando en una mayor transferencia de energía (FRET mejorada). El nivel de FRET con el tiempo, más o menos calculado como la relación de las intensidades de señal de YFP PPC, refleja la dinámica intracelular de Ca 2 +. Varias versiones TA se han utilizado en las plantas. YC3.6 era targeted al citosol 14,15, el núcleo 16, 17 mitocondrias y membrana plasmática 18, y YC4.6 y D4ER fueron atacados a Urgencias 15,19, y D3cpv fue dirigido a los peroxisomas 20. Las plantas transgénicas que expresan YCs permiten la formación de imágenes en vivo de células de Ca 2 + dinámica dentro de los diferentes compartimentos celulares de diferentes tipos de células. Casos (presumiblemente Ca lcium sí Nsor) son proteínas individuales circularmente permutados fluorescentes (CPFPS) albergan una calmodulina y el péptido de unión a calmodulina-M13. Tras la unión a Ca 2 +, CASEs sufren cambios conformacionales, llevando a un aumento de la intensidad de fluorescencia. La correlación entre la respuesta de fluorescencia del CASE y concentración de Ca2 + intracelular de Ca 2 + permite la dinámica que se deben medir cuantitativamente. La variante Case12 ha 12 veces mayor fluorescencia en la Ca 2 + formas saturados. N. plantas benthiminana transitoriamente expresser Case12 o plantas de Arabidopsis que expresan establemente caso 12 se utilizaron para estudiar Ca 2 + señalización en defensa y abióticos de estrés 4,21. Asíncrono espacial y temporal de Ca 2 + oscilaciones en células que responden al ataque de patógenos, o al estrés deshidratación han sido reveladas con basado Case12 Ca 2 + de imágenes.
A continuación, presentamos las instrucciones detalladas para Aequorina imágenes luminiscencia basada de tejidos y estímulos específicos de Ca 2 + en la dinámica de plántulas de Arabidopsis, y de imagen confocal de citosólicas y Ca 2 + dinámica nuclear en células de la raíz de Arabidopsis que expresan Caso 12. luminiscencia imágenes de FAS podría ser adaptado para analizar el estrés inducido por la dinámica de Ca2 + en las plantas o tejidos que no se describen aquí intactos, o para cribar poblaciones de plantas de Arabidopsis mutagenizadas para mutantes con el estrés alterada inducida por Ca 2 + señales. La configuración de imágenes de células vivas Ca2 + podría adaptarse para analizar Ca2 + dinámicas dentro de diferentes compartimentos subcelular o en diferentes tipos de células utilizando otros indicadores de Ca 2 +.
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Protocol
1. Aequorina Based Ca 2 + Imaging Uso del sistema FAS
- Preparar plántulas para imágenes de luminiscencia. Esterilizar semillas de plantas de Arabidopsis que expresan Aequorina con una solución de lejía al 10% que contiene 0,01% de Triton-100. Siembre las semillas estériles en un plato cuadrado (10 x 10 cm cuadrados caja de Petri con rejilla,) que contiene toda su fuerza MS (Murashige y Skoog Basal Sal Mezcla), 1% de sacarosa y 1,2% de agar. Colocar las placas verticalmente en una cámara de crecimiento después de la estratificación a 4 ° C durante 2 días (Figura 1A).
- Transferir las plántulas sobre una película. Colocar una película adhesiva (Figura 1B) en la parte superior de 7-10 días de edad plántulas que crecen en la placa. Empuje suavemente la película con la mano para asegurarse de que las plántulas se adhieren a la película (Figura 1C). Pelar la película con cuidado para que las plántulas permanecen adheridos a la película (Figura 1D y 1E)
- Se incuban las plántulas con cofactor. Colocar la unaplántulas dhered sobre la placa cuadrada (10 x 10 cm) que contiene 15 ml de 2 mg / ml h-CTZ (coelenterazina) en agua. Incubar las plantas de semillero a temperatura ambiente durante 4 horas a toda la noche (Figura 1F).
- Preparar para la imagen de luminiscencia. Tome la película fuera de la solución h-CTZ y cortar por la mitad, formando dos piezas. Coloque cada pieza de película con plántulas cara arriba en dos placas diferentes. Deje las placas en la oscuridad durante 5 min.
- Adquirir imágenes de luminiscencia. En la oscuridad, colocar las dos placas junto a la otra en la etapa del sistema de imágenes de luminiscencia (Figura 1G). Adquirir imágenes inmediatamente después de la adición de 20 ml de solución de estímulos a las placas de forma simultánea.
- Analizar imágenes de luminiscencia. Elija el mismo rango de visualización para todas las imágenes de luminiscencia. Recortar la región de interés (ROI) y generar las imágenes como archivos JPEG (Figura 2A). Alternativamente, exportar las imágenes como archivos de formato SPE e importarlos en elImageJ software de análisis de imagen. Medidas de ajuste para el cálculo del valor medio gris del ROI. Seleccione el mismo tamaño del área de retorno de la inversión y medir los datos de grises y presentes medios como gráficos de barras (Figura 2B).
2. vivo Cell Confocal Ca 2 + Imaging
- Preparar plántulas para la imagen confocal. Esterilizar semillas de plantas de Arabidopsis que expresan case12 con una solución de lejía al 10% que contiene 0,01% de Triton. Siembre las semillas estériles en una placa que contiene la fuerza completa sales MS, sacarosa al 1%, y 1,2% de agar. Coloque las placas verticalmente en una cámara de crecimiento después de la estratificación a 4 ° C durante 2 días.
- Cámaras de imagen de instalación
- Montar una cámara de imágenes usando un portaobjetos y cubreobjetos (Sala A). Coloque un trozo de lana de algodón empapado de agua en el medio de la corredera. A continuación, traslado de uno o dos 5 días plántulas de la placa en la parte superior del agua empapada lana de algodón. Se adhieren pequeños trozos de arcilla a cada esquina de un cubreobjetos, unad lugar cubreobjetos en la parte superior de las plantas de semillero para crear un espacio (cámara) entre el cubreobjetos y portaobjetos (Figura 3A, panel izquierdo). Conectar un extremo del tubo de polietileno (0,58 mm de diámetro) a una jeringa de 1 ml y colocar el otro extremo del tubo inmediatamente adyacente a la cámara. Sostenga el tubo en su lugar con cinta (Figura 3A, panel derecho).
- Montar una cámara de imágenes utilizando una cámara de plexiglás (Sala B).
- Extender una capa fina de grasa de silicona alrededor de dos tubos de polietileno (0,58 mm de diámetro) y presione los tubos revestidos en los canales a cada lado de la cámara de plexiglass (Figura 3B panel de la izquierda). Extender una capa fina de grasa de silicona sobre la superficie de la cámara que contiene las ranuras del tubo y presione un cubreobjetos en la grasa para sellar un lado de la abertura de la cámara (cortadas).
- Transferir una antigua planta de semillero cinco días a partir de la placa en la cámara y coloque un trozo de algodón empapado con agua en la parte superior of la plántula. Extienda la grasa de silicona sobre la otra superficie de la cámara, y presione otro cubreobjetos en la parte superior para sellar. Conectar el extremo de uno de los tubos a una jeringa de 1 ml. Deje el extremo del otro tubo (panel de la derecha Figura 3B) abierta.
- Preparar una cámara de imágenes utilizando una cubierta de vidrio cámaras (Cámara C). Esterilizar el cristal de la cubierta de cámaras con etanol al 70% y se deja en el capó hasta que se seque. Añadir 0,6 ml o 0,2 ml de fuerza completa medio MS que contenía 1% de sacarosa y 0,5% de fitagel en cada pocillo de una cámara de 2 pocillos o una cámara de 8 pocillos (panel de la derecha Figura 3C), respectivamente. Esterilizar semillas y sembrar las semillas directamente en una cubierta de vidrio cámaras que contiene una fina capa de gel transparente y dejarlos crecer verticalmente durante 5 días (Figura 3C).
- Adquirir imágenes utilizando un microscopio confocal. Para aplicar estímulos de estrés, como la sal, el frío o peróxido, inyectar lentamente alrededor de 200 l de NaCl 150 mM, hielo-cold agua o 1 mM H 2 O 2 solución en la cámara (Cámara A o B) justo antes de la adquisición de imágenes, o agregar suavemente 500 l o 100 l de solución de estímulo para el pozo de una cámara de 2 o de 8 pocillos, respectivamente . Capturar imágenes inmediatamente después de aplicar la solución de estímulo utilizando un microscopio confocal Nikon A1R de escaneo láser invertida con un lente de inmersión en agua 20X (apertura numérica 0,75). Reúne una serie temporal de imágenes a intervalos de 4 segundos con longitudes de onda de excitación y emisión de 488 nm y 500-550 nm, respectivamente, y con una resolución de píxel de 512 x 512.
- Análisis de Imagen
Usando Nikon Elements, ROIs fueron elaboradas alrededor de cada celda (o área) de interés. Intensidad total dentro de cada ROI se mide en el tiempo utilizando el cuadro de diálogo Medición del tiempo (ImageJ se podría utilizar en su lugar). Mediciones totales de intensidad fueron exportados y tratados en Datagraph. Ca 2 + amplitud pico se define como la intensidad máxima de menos intensidad de descanso, la duración como ªtiempo e entre el inicio y la finalización de un pico, y el período como el intervalo de tiempo entre los picos pico adyacentes de dos picos. t-test fue utilizado para comparar las medias.
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Representative Results
Manitol, NaCl y H 2 O 2 se utilizaron como indicadores de la deshidratación, la sal y el estrés oxidativo estímulos, respectivamente. Para comprobar si el ion de metal pesado Cu 2 + sinergia con cualquiera de estos tres estímulos de estrés, se comparó la Ca 2 + respuesta a cada uno de los estímulos en la presencia o ausencia de Cu 2 +. Como se muestra en la Figura 2, las imágenes de luminiscencia FAS reveló que las plantas de semillero Arabidoposis respondieron de manera diferente a la deshidratación, la sal y el estrés oxidativo. Para la concentración de los estímulos que hemos examinado en este estudio, NaCl 75 mM indujo el más fuerte Ca 2 + respuesta en hojas y raíces durante el primer 40 segundos de exposición (panel central Figura 2A y la Figura 2B), mientras que 1 mM H 2 O 2 inducida una fuerte respuesta de Ca2 +, tanto en hojas y raíces durante el primero y segundo 40 seg (panel de la derecha Figura 2A). La solución de manitol 400 mM sólo indujoCa 2 + respuesta en las raíces durante los primeros años 40 y señales muy débiles de las hojas durante el segundo 40 seg. Cu 2 + mejorarse fuertemente las amplitudes y duración de la Ca 2 + señales desencadenadas por NaCl y manitol (Figura 2A panel izquierdo). Parece que Cu2 + tenía efectos inhibidores sobre la H 2 O 2 inducida por Ca 2 + señales, reduciendo tanto la amplitud y la duración (panel de la derecha la figura 2A y 2B).
El uso de plantas de Arabidopsis que expresan Case12, que mide la dinámica de Ca2 + en el citosol y núcleos simultáneamente. Peso molecular de 46 kDa Case12 es, por lo tanto, las plantas transgénicas que expresan Case12 tienen señales de GFP tanto en el citosol y núcleos de células de la raíz y de la hoja (figura 4A). Personalizada (Figura 3A y 3B) o comerciales cámaras (Figura 3C) se utilizaron para imágenes de células vivas con un confocalmicroscopio. La aplicación de NaCl 150 mM a la plántula en la cámara, se observó cambios de intensidad de la fluorescencia tanto en el citosol y el núcleo de las células individuales (Figura 4B y C; complementario Película 1). Usando NIS-Elements (software Imaging, Nikon Instruments Inc.), que mide la intensidad de la fluorescencia en las regiones de interés (ROI) a través del tiempo. La amplitud, la duración y la frecuencia de citosólica y nuclear Ca 2 + oscilación se presentan gráficamente en la Figura 4B. La amplitud y el periodo de Ca 2 + picos en el citoplasma y los núcleos varían mucho entre las células de la misma raíz, así como a través de las células en diferentes raíces. La amplitud y el periodo de Ca2 + citosólico picos fueron 60.36 ± 45.22 AU (unidad arbitraria) y 58.24 ± 15.70 segundos, respectivamente. La amplitud y el periodo de nucleares de Ca 2 + picos fueron 316.26 ± 75.24 (UA) y 61,71 ± 16,31 segundos, respectivamente. En contraste, laduración de citosólicas y nucleares Ca 2 + picos fueron similares entre las células, que fueron 17.43 ± 3.67 segundos y 17.33 ± 2 s, respectivamente. La amplitud de los picos de Ca 2 + disminuyeron con el tiempo, que puede ser debido al cambio del plano focal y / o una pérdida de la respuesta al estrés estímulos debido a una condición desfavorable en vitro. Estos resultados muestran que el estrés desencadena sal de Ca2 + de oscilación tanto en el citoplasma y el núcleo.
Figura 1. Aequorina basa sistema FAS para la medición de espacio-temporales de Ca 2 + dinámica en respuesta al estrés estímulos. A) crecer plántulas de Arabidopsis verticalmente sobre una placa que contiene medio MS. B, C) Colocar una película adhesiva (B) en la parte superior de las plantas de semillero (C). D, E) F) Incubar plántulas adheridas a la película con 2 mg / ml de h-CTZ en agua durante 4 horas. G) Cortar la película por la mitad y colocar cada pieza en una diferente plato vacío. Deje las placas en la oscuridad durante 5 min. Aplicar simultáneamente soluciones de control y estímulos (asegúrese de que las plántulas se cubren por completo), y adquieren imágenes inmediatamente. La barra de escala es de 5 cm.
Figura 2: Comparación de Ca 2 + espacio-temporal de respuesta de 10 plántulas de un día a diferentes estímulos de estrés. A) Una serie de tiempo de imágenes de luminiscencia de plántulas sometido a manitol 400 mM y manitol 400 mM más 1 mM CuCl 2 (A, panel izquierdo), NaCl 75 mM y NaCl 75 mM más 1 mM CuCl2 (A, panel central), y 1 mM H 2 O 2 o 1 mM H 2 O 2 más 1 mM CuCl 2 (A, panel derecho). Paneles superior e inferior de A son imágenes de luminiscencia adquiridos durante primero y segundo 40 seg 40 seg, respectivamente. Una barra de escala de intensidad indica un aumento de las señales de luminiscencia de baja (negro) a alto (blanco). B) Gráfico de barras de intensidad media luminiscencia de las plantas de semillero en respuesta a los estímulos de estrés indicados.
Figura 3 Configuración de una célula viva experimento de imagen confocal. A) Una cámara personalizada se construye con un tobogán, cubreobjetos con cuatro piezas de arcilla y lana de algodón. Dos 5 días plántulas se colocan en la diapositiva. Un extremo de un tubo de polietileno se coloca junto a la cámara de ensamblado y se fija conunos trozos de cinta, mientras que el otro extremo está conectado a un B) Una diapositiva personalizada hecha de plexiglás con jeringa de 1 ml. tiene una cámara abierta en el centro y dos canales que están conectados a los dos lados del canal. Un cubreobjetos se coloca sobre la parte superior de la corredera y dos tubos de polietileno de se colocan en el canal. Cubreobjetos y tubos se fijan en la posición con grasa de silicona. El extremo de uno de los tubos está conectado a una jeringa de 1 ml y el extremo de otro tubo permanece abierta. Un viejo plántulas 5 días se coloca en la cámara y un coveslip se pone en la parte superior de la plántula y se sella con grasa de silicona. La corredera plexigalss con la cámara de ensamblado se coloca en la platina del microscopio. C) plántulas de Arabidopsis se cultivan en dos pozos (izquierda) o 8 pozos (derecha) de la cubierta de vidrio cámaras que contiene una capa fina de 0,6% de fitagel en la EM medios de comunicación.
Figura 4. citosólica y nuclear Ca 2 + oscilación en respuesta al estrés salino. A) Las imágenes confocales muestran que Case12 se expresa en el citoplasma y núcleos de las células de la raíz (panel izquierdo) y células de la hoja (panel derecho) de las plantas transgénicas que expresan Case12. La imagen en el panel de la derecha es una imagen combinada de la autofluorescencia roja de los cloroplastos y la fluorescencia verde de Case12. B) El estrés salino (NaCl 150 mM) inducida por Ca 2 + oscilación en el citosol (panel superior) y los núcleos (panel inferior) de células de la raíz. Ubicaciones de las células de medición se indican con flechas con números en panel.
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Discussion
Hemos demostrado un sistema FAS para el registro de la espacio-temporal Ca 2 + respuesta de plántulas de Arabidopsis. Este sistema de grabación FAS 2 + Ca proporciona un enfoque sencillo, sensible y robusto que se podría adaptar para medir la dinámica de Ca 2 + desencadenadas por diversos estímulos, además de los estímulos de estrés abióticos que se presentan aquí. El uso de este sistema, podemos comparar fácilmente tejido o específicos estímulos espaciales-temporales de Ca 2 + en la dinámica de toda la planta. La alta sensibilidad del FAS permite el uso de estímulos de baja intensidad para el examen de Ca 2 + respuestas, lo cual es importante para evitar los artefactos causados por daños físicos a las células cuando se utiliza el estrés de alta intensidad. Siete a 10 días de edad plántulas de Arabidopsis mostró tejido o estímulos específicos Ca 2 + respuesta, aunque las plántulas en diferentes etapas fisiológicas pueden tener diferente sensibilidad y especificidad en respuesta a un estímulo dado. Por lo tanto espreferible utilizar 7-10 días plántulas para aumentar el rendimiento de las mediciones de la FAS, en el que alrededor de 100 plántulas podrían ser adherido sobre una pieza de película. Junto con el rendimiento fácil y simple, de alta sensibilidad y reproducibilidad, el sistema FAS también podría ser adaptado para el cribado de mutantes ccsme mutagenizados para Ca 2 + respuestas alteradas. Para el cribado, es fundamental contar con plántulas uniformes que están bien cultivadas en el plato y se adhirieron a la película. Cuatro a cinco horas de incubación de película adherida plántulas con h-CTZ es generalmente suficiente para la reconstitución de aequorina. Uso de la película adhesiva con agujeros es preferible porque la reacción de apoaecuorina y el cofactor requiere oxígeno. Para la comparación de tejido o específicos de estímulos-respuestas Ca 2 +, usando grupos de plántulas originalmente de la misma película es crítico porque el estado de las plantas de semillero y / o la condición de la reconstitución puede afectar a la cantidad total de aecuorina funcional. Cuando estos requiremeNTS se cumplen, la diferencia de la respuesta de luminiscencia es proporcional a la de tejido o de estímulo específico Ca 2 + respuesta.
Aequorina de medición basado en las señales de Ca 2 + reflejan la respuesta de una población de las células. Sin embargo, considerando la heterogeneidad de tipos de células y / o la accesibilidad de diferentes células en los tejidos a los estímulos, los resultados de Aequorina basan Ca 2 + mediciones no equivalen al comportamiento de cualquier célula. La comprensión de la dinámica de Ca 2 + en el nivel celular requiere un indicador de Ca 2 + que se puede detectar con resolución subcelular. Células vivas de imagen confocal de la proteína de fluorescencia (FP) a base de indicadores de Ca 2 + proporciona un sistema de detección de Ca 2 + avanzado para registrar celulares de Ca 2 + dinámica con resolución celular en un tejido deseado. En este caso, el uso de células vivas de imagen confocal y basados en FP Ca 2 + indicadores, registramos subcelular Ca 2 + 2 +-FP se han aplicado en plantas con características diferentes. En comparación con YCs, solo Ca indicador basado en las buenas prácticas agrarias 2 + tiene algunas ventajas: 1. Case12 no requiere YFP y PPC juegos de filtros o las muchas suposiciones y cálculos complejos necesarios para medir FRET 22. Case12 tiene solo excitación / emisión máxima y se puede detectar fácilmente con juego de filtros GFP estándar. 2. Case12 es estable bajo pH fisiológico, y es relativamente una pequeña proteína (46 kDa). Cuando se expresa en las plantas, Case12 no específica aparece en el citoplasma así como los núcleos, por lo que las plantas transgénicas Case12 pueden ser utilizados para rastrear citosólicas y nucleares de Ca 2 + dinámica simultáneamente. Un inconveniente de este indicador es que es un indicador no radiométrico, por lo que los niveles de fluorescencia también se ven afectados por factores que no están relacionados con Ca 2 + de concentración, tales como el nivel de expresiónCase12 y el pH local. Sin embargo, Case12 es adecuada para determinar la concentración de Ca2 + celular para la comparación de espacio-temporales de Ca 2 + dinámica en el citoplasma y orgánulos entre materiales con diferentes antecedentes genéticos en las mismas condiciones experimentales. En el futuro, la nueva GFP basada Ca 2 + indicadores con mayor relación señal-ruido, cinética rápida y una mayor respuesta, como GCaMP3 24 y 25 GCaMP5 demostrado en animales, podrían ser mejores indicadores para el registro de celular o subcelular de Ca 2 + en la dinámica plantas.
Los sistemas de detección de Aequorina y Case12 descritos aquí proporcionan no destructiva in vivo enfoques para la medición de espacio-temporales de Ca 2 + dinámica en toda la planta de semillero y los niveles subcelulares, respectivamente. En ambos sistemas, las condiciones de estado o de crecimiento fisiológicos podrían afectar el Ca 2 + respuestas de las plantas de semillero o células. Si physically dañado o no se cultiva en buenas condiciones, las células podrían tener débiles o incluso sin Ca 2 + respuestas. Además, la duración de espaciales y temporales Ca 2 + señales también se ven afectados por las condiciones de la plántula durante las mediciones. Las señales de luminiscencia o fluorescencia puede disminuir con el tiempo debido al daño inducido por los estímulos, y / o el foto-daño inducido por láser en el caso de formación de imágenes confocal. Aunque el daño inducido por estímulo-no se puede evitar, fototoxicidad puede ser reducido mediante la limitación de la intensidad y / o frecuencia de la exposición al láser. Además, basándose Aequorina Ca 2 + sistema de grabación requiere una etapa de reconstitución. Factores que interrumpen la difusión de CTZ a la célula y / o reacción de apoaequorina con CTZ afectarían señales de luminiscencia que se relacionan directamente a concentración de Ca2 +. Por lo tanto la concentración de CTZ, así como la duración y las condiciones de incubación CTZ necesidad de ser optimizados para mejor sensibilidad y reproducibildad. Genéticamente codificados Ca 2 + indicadores pueden informar incorrectamente celulares Ca 2 + concentraciones por otras razones, incluyendo no deseado dirigido a determinados compartimentos subcelulares, sensibilidad a la temperatura, o la interferencia del reportero del Ca2 + celular maquinaria de señalización 23. Hemos encontrado que las plantas que expresan Aequorina o Case12 no tienen fenotipos morfológicos o condicionales obvios como la tolerancia al estrés alterada. Por lo tanto, es poco probable que estas codificados genéticamente Ca 2 + indicadores tienen importantes interferencias con Ca 2 + señalización en plantas.
En resumen, presentamos aquí las instrucciones detalladas para el uso de dos sistemas de detección de Ca 2 + para la medición espacial y temporal Ca 2 + señales tanto en toda la planta de plántulas y niveles subcelulares. Estos dos sistemas se pueden utilizar para determinar el tejido (o tipo de célula) o Ca 2 +-específica estímulos patrones dinámicos con alta sensibilidad yreproducibilidad. Por lo tanto, son herramientas poderosas para dilucidar las redes de genes que subyacen a Ca 2 + señalización en respuesta a diversos estímulos ambientales.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm x 10 cm square Petri dish | VWR | 60872-310 | |
| Adhesive film | VWR | 60941-062 | |
| Polyethylene tubing | PerkinElmer | 9908265 | |
| 1 ml syringe | VWR | 53548-000 | |
| Silicone grease | Beckman | 335148 | |
| 2-well chambered cover glass | Nalge Nunc international | 155379 | |
| 8-well chambered cover glass | Nalge Nunc international | 155409 | |
| Luminescence imaging system | Princeton Instruments | N/A | |
| Inverted confocal laser-scanning microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon A1R |
| Imaging software | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Elements |
| DataGraph | Visual Data Tools Inc | N/A | DataGraph 3.1.1 is the newest version |
| Coelenterazine | NanoLight Technolgies | #301B NF-BCTZ-FB | |
| All purpose bleach | Any local store | N/A | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151500 | |
| MS salt | Phytotechnology Labs | M524-50L | |
| Sucrose | VWR | BDH8029-12KG | |
| Agar | Sigma | A1296-5KG | |
| Phytagel | Sigma | P8169-1KG |
References
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