Neurale nethinde af en mus i alderen 8 dage er på toppen af en 4% gelatine blok. Efter isolering af fotoreceptorlaget (200 um) ved vibratome er fotoreceptorerne podes efter mekanisk og enzymatisk dissociation for kulturen. Fotoreceptorlaget kan anvendes til molekylære biokemiske analyser eller transplantation.
Nethinden er en del af det centrale nervesystem, der er organiseret arkitektur med neuroner i lag fra fotoreceptorerne begge stænger og kegler i kontakt med retinal pigmenteret epitel i den fjerneste del på nethinden overvejer retning af lys, og ganglieceller på den mest proksimale afstand. Denne arkitektur tillader isolering af fotoreceptorlaget af vibratome skæring. Det dissekerede neurale nethinde af en mus i alderen 8 dage er fast indlejret i 4% gelatine på toppen af et udsnit på 20% gelatine fotoreceptorlaget nedad. Ved hjælp af en vibratome og et tveægget barberblad er 100 um tyk indre nethinde snit. Dette afsnit indeholder ganglieceller og det indre lag med især de bipolære celler. En mellemmand sektion 15 um kasseres før 200 um af den ydre retina indeholder fotoreceptorer udvindes. Gelatinen fjernes ved opvarmning til 37 ° C. Stykker af ydre lag er INCUBATed i 500 pi Ringers opløsning med 2 enheder af aktiveret papain i 20 minutter ved 37 ° C. Reaktionen standses ved tilsætning af 500 pi 10% føtalt kalveserum (FCS) i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), derefter 25 enheder DNAse I tilsættes før centrifugering ved stuetemperatur, vasket adskillige gange for at fjerne serum, og cellerne resuspenderes i 500 pi DMEM og podet ved 1 x 10 5 celler / cm2. Cellerne dyrkes til 5 dage in vitro, og deres levedygtighed scoret med levende / dead assay. Renheden af kulturen først bestemt ved mikroskopisk observation under eksperimentet. Renheden derefter valideres ved podning og fastsættelse celler på en histologisk objektglas og analyse under anvendelse af et kanin-polyklonalt anti-SAG, en fotoreceptor markør og muse-monoklonalt anti-Rho, en stang fotoreceptor specifik markør. Alternativt kan fotoreceptorlaget (97% stænger) anvendes til gen eller protein ekspression analyse og til transplantation.
Nethinden er en integreret del af det centrale nervesystem, som har en konserveret arkitektur blandt hvirveldyr. Neuronerne i den neurale nethinde er organiseret i lag, med de mest fjernt for det indfaldende lys, fotoreceptorlaget i tæt kontakt med det retinale pigmenterede epithelium (RPE) på bagsiden af øjet. Rod og kegle photorecptors er lysfølsomme celler, der er afhængige af opsin følsomme molekyler for foton fange. Disse molekyler er omgivet på disken membraner af en cellulær struktur, som ligger på den ydre del af fotoreceptor, som peger i retning af RPE 1. Denne struktur, som oftest påvirkes meget tidligt i tilfælde af fotoreceptor degenerationer, fornyes med en sats på 10% hver dag. Den såkaldte indre lag indeholder de fleste af de andre neuroner som beregner det modtagne signal fra fotoreceptorerne, bipolar, amacrine og horisontale celler samt ganglieceller. Disse sidstnævnte med deres axonerdannelse af en stråle, som er synsnerven. Denne lagdeling er så bevaret, at biologerne har brugt udtrykket fortrængt amacrine celler, når der findes cellerne uden for den indre plexiform lag 2. Lag af neuroner er fordelt inden for et anker af radial Müller gliaceller. Bipolære celler link fotoreceptorer til ganglieceller. De er placeret mellem det ydre netformige lag og den indre plexiform lag. Ganglion celler danner den indre plexiform lag i forbindelse med de bipolære celler. De amacrin celler er navngivet som foreningens celler placeret i det indre plexiform lag mellem de bipolære celler og ganglieceller. Den ydre netformige lag indeholder horisontale celler. Denne unikke arrangement af neuronale lag af centralnervesystemet tillader isolering af fotoreceptorlaget fra det indre cellelag ved skæring flad monteret retina ved anvendelse af en vibratome.
Oprindeligt blev denne teknik anvendt til at isolere fotoreceptorer til transplantation i øjet af RD1 mus, en model af den menneskelige retinitis pigmentosa (RP) 3. The RD1 mus bærer en recessiv mutation i Pde6b gen, der koder for stangen-specifik phosphodiesterase beta underenhed. Recessive mutationer i dette gen resulterer i RP i mennesker 4. Efter stang fotoreceptorer har degenereret, at patienten mister nattesyn, og overraskende kegle fotoreceptorer, som ikke udtrykker det muterede gen, degenereret som andet trin. Fordi kræves keglerne for farvesyn og synsstyrke, patienterne bliver gradvist blind og en effektiv behandling af sygdommen har endnu ikke udviklet. Ved podning fotoreceptorlaget fra en vildtype mus kegle degeneration af værtens mus forsinkes 3,5. Stængerne tabt i stangen-kegle degenerative model kunne ikke erstattes af en transplantation, fordi den synaptiske forbindelse mellem stænger og bipolære celler kun kan opnås på et bestemt tidspunkt af retinal udvikling, præget af udbruddet af NRL udtryk 6. Laget af fotoreceptorer introduceres ved kirurgi i sub-retinal plads af stangen-mindre RD1 nethinde, mellem RPE og den ydre retina, der svarer til kun 3% af de resterende fotoreceptorer, kegler. To uger efter operation, 40% af keglerne fra dyret transplanteret med en normal fotoreceptorlaget overlevede sammenlignet med dyr transplanteret med en normal lag af indre retinale celler eller til sham-opererede dyr. Topografi kegle overlevelse, spredt ud over hele overfladen af det muterede retina placeret ved positionen af transplanteret væv indikerer, at den beskyttende virkning skyldes en diffunderbart molekyle 7.
Dernæst anvendte vi et co-dyrkningssystem samt konditionerede dyrkningsmedier at validere, at den beskyttende virkning beror på sekretionen af et protein af stænger 8,9. Vi hypotesen, at dette protein bliver exprsmelteostpro- løbende og specifikt af stænger, og at deres død i første fase af sygdommen vil udløse sekundær kegle degeneration ved tabet af et beskyttende signal fra stænger i en ikke-celle selvstændigt 10. På grund af vigtigheden af kegle medieret centrale syn i primater denne formodede protein vil være en yderst relevant terapeutisk værktøj til RP. Bevarelse keglerne i RP ville teoretisk forhindre alt 1,5 millioner patienter på verdensplan at blive blind 11. Vi har anvendt et højt indhold screening tilgang og en kegle-beriget kultur model til at identificere et cDNA, der koder Rod-afledt Cone Levedygtighed Factor (RdCVF) fra en retina cDNA-bibliotek 12. RdCVF er splejset produkt af NXNL1 genet, som interessant er homolog til genet, der koder for thioredoxin proteiner involveret i redox homeostase 13. Den anden splejset produkt af genet, RdCVFL er et enzym, der beskytter sit mål, tau-proteinet mod oxidativ dAmage 14. Administration af RdCVF forhindrer sekundære degeneration af kegler og tabet af deres visuelle funktion i en recessiv og dominerende model RP 12,15. Dette viser to vigtige aspekter af denne innovative terapeutiske strategi 16. For det første kan den anvendes i de fleste RP tilfælde i et gen-uafhængig måde. For det andet er i strid med konkurrerende faktor CNTF, RdCVF overlevelse er forbundet med opretholdelsen af synsfunktionen 17. Fraværet af funktionel effekt kan forklare årsagen til den manglende kliniske fordel af administrationen af CNTF til RP patienter 18. RdCVF er sandsynligvis en af de vigtige overlevelse signalet mellem stave og kegler, da kegle redning in vitro inhiberes af RdCVF immunodepletion 12. Desuden afbrydelse af stangen afledt kegle levedygtighed genet fører til fotoreceptor dysfunktion og tilbøjelighed til oxidativ stress 19.
Anvendelsen affotoreceptorlaget er til grund for identifikationen af RdCVF og en ny redox signal involveret i neurodegenerative sygdomme 20. Dette håndskrift beskriver den protokol, der anvendes til at isolere og kultur celler fra fotoreceptorlaget at karakterisere aktiviteten af RdCVF. Fotoreceptorerne kan opretholdes i kultur i 5 til 7 dage 21. Denne teknik kan også anvendes til at studere ekspressionen af fotoreceptor specifikke gener.
Nethinden er en model organ i biologi. Undersøgelse af nethinden førte til 6 store opdagelser inden for biologi. Det er til grund for den første tumorsuppressorgen RB1. Den afslører molekylær forbindelse mellem receptortyrosinkinaser og MAP-kinaser gennem interaktion med Søn sevenless. Det var involveret i opdagelsen af Pax6, det første gen for orgel morfogenese mester kontrol. Det er i centrum af den genetiske sammenslutning af komplement faktor H (CFH) med aldersrelateret makulær degeneration (AMD), den første sygdomsdisponeringsgen identificeret ved genom sammenslutning skærm (GWAS). Endelig førte til den første vellykkede genterapi til Leber medfødt amaurosis det første korrigerende forsøg genterapi i human nogen arvelig sygdom. Strukturen af dette organ er konserveret i de fleste vertebrater. Dens tilgængelighed for manipulation in vivo har tilskyndet tidligt genomik undersøgelser på denne integreret del af central nervesystem.
Vi viser her, hvordan at adskille fotoreceptorlaget fra det indre lag af retina ved vibratome skæring. Dette trin er afgørende for opnåelse af rene fotoreceptor kulturer. Vores dissektion protokol gør forurening med RPE celler meget usandsynligt.
En af de største udfordringer er udfladning af nethinden, der er nødvendig for at afsnittet korrekt den indre og den ydre retina. Den sektionering af nethinden er bedst på nethinden med lille diameter som dem fra gnavere og denne diameter er en begrænsning af teknikken med nuværende tilgængelige materiale.
Det er tilrådeligt, før du starter en biologisk meningsfuld eksperiment, for at øve på en stikprøve af nethinden. Vi illustrerer metoden repræsentative resultater opnået fra dyrkede fotoreceptorceller ved hjælp af materiale til at udføre ekspression undersøgelse af både mRNA'er og proteiner. Expression undersøgelser kan også udføres alternativt sektionns opnået ved laser capture microdissection, men kulturerne bedst udføres ved hjælp vibratome skæring. Vi kunne have brugt en teknik mikrodissektion laser med en komplet anden strategi. Men, for at indsamle fotoreceptorlaget med mikrodissektion apparater til kultur, vil det være nødvendigt at undgå fiksativ og dette ville komplicere den nuværende metodologi betydeligt.
Vi udvikler en protokol til formål at studere kinetikken for gen og protein-ekspression i vibratome sektioner under degeneration af fotoreceptorer i modeller af retinitis pigmentosa. Vi mener, at den detaljerede beskrivelse af protokollen vil være nyttig for forskere inden for retinal biologi, og især for proteomiske og metabolomiske studier.
The authors have nothing to disclose.
Igal Gery and David Hicks for anti-SAG antibodies. Ram Fridlich for reading the manuscript.
Name of Material / Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Cytidine 5′-diphosphocholin* | Sigma-Aldrich | C0256 | 4.7 µM Cytidine 5′-diphosphocholin |
Cytidine 5′-diphosphoethanolamine* | Sigma-Aldrich | C0456 | 2.7 µM Cytidine 5′-diphosphoethanolamine |
Linoleïc acid/ bovine serum albumin (BSA)* | Sigma-Aldrich | L8384 | 100 µg/ml linoleïc acid/ bovine serum albumin (BSA) |
Triiodo-L-thyronine* | Sigma-Aldrich | T6397 | 0.03 µM Triiodo-L-thyronine |
96-wells plate | Greiner bio-one | 655-095 | |
Binocular microscope | Leica | MZ-75 | |
CO2 independent (CO2-i) | Life Technologies | 18045054 | |
DMEM | Life Technologies | 41966029 | |
Forceps n°5 Dumont | Bionic | 11254-20 | |
Gelatin from porcin skin type A | Sigma-Aldrich | G2500 | |
GeneChip | Affymetrix | U74v2 | |
Gentamicin solution | Life Technologies | 15710049 | |
Hydrocortison* | Sigma-Aldrich | H0888 | 0.55 µM hydrocortison |
Insulin* (I) | Sigma-Aldrich | I1884 (ITS) | 0.86 µM insulin (I) |
Papain | Worthington-biochem | WOLS03124 | |
Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P-6407 | |
Progesterone* | Sigma-Aldrich | P7556 | 2.0 µM progesterone |
Prostaglandin* | Sigma-Aldrich | P5172 | 0.28 µM prostaglandin |
Putrescine* | Sigma-Aldrich | P5780 | 182 µM putrescine |
Scalpel Albion | EMS | 72000 | |
Scissor | Moria | 15396-00 | |
Sodium Pyruvate* | Sigma-Aldrich | S8636 | 1 mM sodium pyruvate |
Sodium Selenite* (S) | Sigma-Aldrich | I1884 (ITS) | 0.29 µM Na2SeO3 (S) |
Taurine* | Sigma-Aldrich | T8691 | 3 mM taurine |
Transferrin* (T) | Sigma-Aldrich | I1884 (ITS) | 0.07 µM transferrin (T) |
Vibratome apparatus | Leica | VT1000-S | |
* Supplements |