Summary
आठ दिनों के आयु वर्ग के एक माउस के तंत्रिका रेटिना एक 4% जिलेटिन ब्लॉक के शीर्ष पर है। Vibratome द्वारा फोटोरिसेप्टर परत (200 माइक्रोन) के अलगाव के बाद, फोटोरिसेप्टरों संस्कृति के लिए यांत्रिक और enzymatic हदबंदी के बाद वरीयता प्राप्त कर रहे हैं। फोटोरिसेप्टर परत आणविक, जैव रासायनिक विश्लेषण या प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Abstract
रेटिना प्रकाश की दिशा पर विचार रेटिना पर सबसे दूर भाग में रेटिना pigmented उपकला साथ, फोटोरिसेप्टर से परतों में न्यूरॉन्स के साथ, संपर्क में दोनों छड़ और शंकु वास्तुकला का आयोजन किया गया है कि केंद्रीय तंत्रिका तंत्र का एक हिस्सा है, और सबसे समीपस्थ दूरी में नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं। इस वास्तुकला vibratome सेक्शनिंग द्वारा फोटोरिसेप्टर परत के अलगाव की अनुमति देता है। आठ दिनों के आयु वर्ग के एक माउस के विच्छेदित तंत्रिका रेटिना फ्लैट एम्बेडेड है नीचे का सामना करना पड़ 20% जिलेटिन फोटोरिसेप्टर परत का एक टुकड़ा के शीर्ष पर 4% जिलेटिन में। एक vibratome और एक डबल धार धार का प्रयोग, 100 माइक्रोन मोटी भीतरी रेटिना sectioned है। इस अनुभाग में नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं और विशेष रूप से द्विध्रुवी कोशिकाओं के साथ भीतरी परत में शामिल है। फोटोरिसेप्टर युक्त बाहरी रेटिना के 200 माइक्रोन बरामद किया है इससे पहले 15 माइक्रोन का एक मध्यस्थ खंड खारिज कर दिया है। जिलेटिन 37 डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग द्वारा हटा दिया जाता है। बाहरी परत के टुकड़े incuba हैं37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए सक्रिय papain की दो इकाइयों के साथ घंटी समाधान के 500 μl में टेड। प्रतिक्रिया Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) में 500 μl 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) जोड़कर बंद कर दिया है, DNase मैं तो 25 इकाइयों सीरम दूर करने के लिए, आरटी पर centrifugation से पहले कई बार धोया जोड़ा जाता है और कोशिकाओं में resuspended 500 DMEM के μl और / 2 सेमी 1 x 10 5 कोशिकाओं पर वरीयता प्राप्त। कोशिकाओं इन विट्रो में 5 दिनों के लिए बड़े हो रहे हैं और उनकी व्यवहार्यता लाइव / मृत परख का उपयोग रन बनाए। संस्कृति की पवित्रता पहले प्रयोग के दौरान सूक्ष्म अवलोकन द्वारा निर्धारित किया जाता है। पवित्रता तो बोने और एक ऊतकीय स्लाइड पर कोशिकाओं फिक्सिंग और एक खरगोश पॉलीक्लोनल विरोधी शिथिलता, एक फोटोरिसेप्टर मार्कर और माउस मोनोक्लोनल विरोधी रो, एक रॉड फोटोरिसेप्टर विशिष्ट मार्कर का उपयोग का विश्लेषण द्वारा मान्य है। वैकल्पिक रूप से, फोटोरिसेप्टर परत (97% की छड़) जीन या प्रोटीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण के लिए और प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Introduction
रेटिना रीढ़ के बीच एक संरक्षित वास्तुकला है जो केंद्रीय तंत्रिका तंत्र का एक अभिन्न हिस्सा है। तंत्रिका रेटिना के न्यूरॉन्स घटना प्रकाश, आंख के पीछे की रेटिना pigmented उपकला (RPE) के साथ निकट संपर्क में फोटोरिसेप्टर परत के लिए सबसे दूर के साथ, परतों में आयोजित कर रहे हैं। रॉड और कोन photorecptors फोटोन को पकड़ने के लिए opsin संवेदनशील अणुओं पर निर्भर है कि प्रकाश के प्रति संवेदनशील कोशिकाएं हैं। इन अणुओं RPE के एक अंक की दिशा में जो फोटोरिसेप्टर के बाहरी खंड पर स्थित एक सेलुलर संरचना की डिस्क झिल्ली, पर संलग्न हैं। सबसे अधिक बार बहुत जल्दी फोटोरिसेप्टर degenerations के मामलों में प्रभावित होता है, जो इस संरचना, 10% हर दिन की दर से नए सिरे से है। तथाकथित भीतरी परत फोटोरिसेप्टरों, द्विध्रुवी, amacrine और क्षैतिज कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह के रूप में नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं से प्राप्त संकेत गणना कि अन्य न्यूरॉन्स के सबसे शामिल हैं। उनके axons के साथ इन बादऑप्टिक तंत्रिका है जो एक किरण के रूप में। इस layering कोशिकाओं भीतरी plexiform परत 2 के बाहर पाए जाते हैं जब जीव के कार्यकाल विस्थापित amacrine कोशिकाओं का इस्तेमाल किया है इतना है कि संरक्षित है। न्यूरॉन्स की परतें रेडियल मुलर glial कोशिकाओं का एक कवच के भीतर वितरित कर रहे हैं। द्विध्रुवी कोशिकाओं नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं को फोटोरिसेप्टर लिंक। वे बाहरी plexiform परत और भीतरी plexiform परत के बीच स्थित हैं। नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं द्विध्रुवी कोशिकाओं के सिलसिले में आंतरिक plexiform परत के रूप में। amacrin कोशिकाओं द्विध्रुवी कोशिकाओं और नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के बीच आंतरिक plexiform परत में स्थित एसोसिएशन कोशिकाओं के रूप में नामित कर रहे हैं। बाहरी plexiform परत क्षैतिज सेल शामिल हैं। केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के न्यूरोनल परतों की इस अनूठी व्यवस्था एक vibratome का उपयोग फ्लैट घुड़सवार रेटिना टुकड़ा करने की क्रिया द्वारा आंतरिक सेल परत से फोटोरिसेप्टर परत के अलगाव परमिट।
मूल रूप से, इस तकनीक ट्रॅन के लिए फोटोरिसेप्टरों अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया थाrd1 माउस, मानव रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा (आरपी) 3 के एक मॉडल की नजर में splantation। rd1 माउस रॉड-विशिष्ट फॉस्फोडाइस्टरेज़ बीटा सबयूनिट के लिए encodes जो Pde6b जीन में एक अप्रभावी उत्परिवर्तन वहन करती है। मनुष्य के चार में आरपी में इस जीन परिणाम के पीछे हटने का म्यूटेशन। रॉड फोटोरिसेप्टर degenerated है, के बाद रोगी रात दृष्टि खो देता है, और, उत्परिवर्तित जीन व्यक्त एक दूसरे कदम के रूप में पतित नहीं है जो आश्चर्यजनक रूप से कोन फोटोरिसेप्टर,। शंकु रंग दृष्टि और दृश्य तीक्ष्णता के लिए आवश्यक हैं, क्योंकि रोगियों उत्तरोत्तर अंधे हो जाते हैं और रोग के लिए एक प्रभावी उपचार अभी तक विकसित नहीं किया है। एक जंगली प्रकार माउस से मेजबान माउस के कोन अध: पतन फोटोरिसेप्टर परत कलम बांधने का काम करके 3,5 देरी हो रही है। छड़ और द्विध्रुवी कोशिकाओं के बीच synaptic कनेक्शन केवल आर के एक विशिष्ट चरण में प्राप्त किया जा सकता है क्योंकि रॉड-कोन अपक्षयी मॉडल में खो छड़ एक प्रत्यारोपण से नहीं बदला जा सकता हैएनआरएल अभिव्यक्ति 6 की शुरुआत से चिह्नित etinal विकास,। फोटोरिसेप्टर की परत RPE और शेष फोटोरिसेप्टरों, शंकु का केवल 3% करने के लिए इसी बाहरी रेटिना के बीच, रॉड-कम rd1 रेटिना के उप रेटिना अंतरिक्ष में शल्य चिकित्सा द्वारा शुरू की है। दो हफ्ते सर्जरी के बाद, एक सामान्य फोटोरिसेप्टर परत के साथ प्रत्यारोपित पशु से शंकु का 40%, या दिखावा संचालित पशु को भीतरी रेटिना की कोशिकाओं का एक सामान्य परत के साथ प्रत्यारोपित पशु की तुलना में बच गया। कोन अस्तित्व की स्थलाकृति, फैल आउट grafted ऊतकों की स्थिति में स्थित उत्परिवर्तित रेटिना की पूरी सतह पर सुरक्षात्मक प्रभाव एक प्रसारण अणु 7 की वजह से है कि इंगित करता है।
अगला, हम सुरक्षात्मक प्रभाव छड़ 8,9 द्वारा एक प्रोटीन का स्राव पर निर्भर करता है कि तथ्य यह मान्य करने के लिए एक सह संस्कृति प्रणाली के रूप में अच्छी तरह से वातानुकूलित संस्कृति मीडिया का इस्तेमाल किया। हम इस प्रोटीन Expr किया जाएगा कि परिकल्पनाएक गैर-सेल स्वायत्त तरीके से 10 में छड़ से एक सुरक्षात्मक संकेत के नुकसान से माध्यमिक शंकु अध: पतन ट्रिगर किया जाएगा रोग के पहले चरण के दौरान उनकी मौत की छड़ से और कहा कि लगातार और विशेष रूप से essed। क्योंकि वानरों में शंकु की मध्यस्थता केंद्रीय दृष्टि के महत्व के इस ख्यात प्रोटीन आरपी के लिए एक अत्यधिक प्रासंगिक चिकित्सकीय उपकरण होगा। आरपी में शंकु के संरक्षण सैद्धांतिक रूप से 11 अंधा बनने के लिए दुनिया भर में 15 लाख रोगियों की कुल रोका जा सके। हम एक रेटिना सीडीएनए लाइब्रेरी 12 से रॉड व्युत्पन्न शंकु व्यवहार्यता फैक्टर (RdCVF) एन्कोडिंग एक सीडीएनए की पहचान करने के लिए एक उच्च सामग्री स्क्रीनिंग दृष्टिकोण और एक शंकु समृद्ध संस्कृति मॉडल का इस्तेमाल किया है। RdCVF, दिलचस्प बात यह है redox homeostasis को 13 में शामिल thioredoxin प्रोटीन के लिए जीन एन्कोडिंग मुताबिक़ जो NXNL1 जीन की spliced उत्पाद है। जीन की दूसरी spliced उत्पाद, RdCVFL अपने लक्ष्य, ऑक्सीडेटिव डी के खिलाफ ताऊ प्रोटीन की रक्षा करता है कि एक एंजाइम है14 amage। RdCVF का प्रशासन शंकु के माध्यमिक अध: पतन और एक पीछे हटने में उनके दृश्य समारोह की हानि, और आरपी 12,15 के प्रमुख मॉडल से बचाता है। यह इस अभिनव चिकित्सकीय रणनीति 16 के दो महत्वपूर्ण पहलुओं को दर्शाता है। सबसे पहले, यह एक जीन-स्वतंत्र ढंग से आरपी अधिकांश मामलों में लागू किया जा सकता है। दूसरा, प्रतिस्पर्धा कारक के विपरीत CNTF, RdCVF अस्तित्व दृश्य समारोह 17 के रखरखाव के साथ जुड़ा हुआ है। कार्यात्मक प्रभाव के अभाव आरपी रोगियों से 18 CNTF के प्रशासन के नैदानिक लाभ के अभाव के कारण समझा जा सकता है। RdCVF इन विट्रो में कोन बचाव RdCVF immunodepletion 12 से हिचकते हैं क्योंकि छड़ और शंकु के बीच महत्वपूर्ण अस्तित्व संकेत में से एक सबसे अधिक संभावना है। इसके अलावा, रॉड व्युत्पन्न कोन व्यवहार्यता जीन के विघटन oxidative तनाव से 19 शिथिलता और संवेदनशीलता फोटोरिसेप्टर की ओर जाता है।
का उपयोगफोटोरिसेप्टर परत RdCVF की पहचान के मूल में और neurodegenerative रोगों 20 में शामिल एक उपन्यास रेडॉक्स संकेत की है। इस पांडुलिपि को अलग करने और फोटोरिसेप्टर परत से संस्कृति कोशिकाओं RdCVF की गतिविधि को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल का वर्णन है। फोटोरिसेप्टरों 5 से 7 दिनों में 21 के लिए संस्कृति में बनाए रखा जा सकता है। इस तकनीक को भी फोटोरिसेप्टर विशिष्ट जीनों की अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Protocol
नोट: प्रक्रिया विश्वविद्यालय पियरे और मैरी क्यूरी (/ 2009/048 Ce5) से आचार समिति डार्विन द्वारा अनुमोदित किया गया था
जिलेटिन समाधान, उपकरण, Vibratome, संस्कृति मीडिया और संस्कृति की थाली से 1. तैयारी
- कम से कम एक दिन के प्रयोग से पहले एक 20% जिलेटिन समाधान तैयार है।
- हुड के तहत, सीओ 2 स्वतंत्र मध्यम युक्त एक 500 मिलीलीटर की बोतल (सीओ 2 -मैं) को gentamycin [10 मिलीग्राम / एमएल] के 500 μl जोड़ें।
- एक अलग बीकर में, 15 मिनट के लिए लगातार सरगर्मी के साथ एक हीटिंग ब्लॉक पर 95 डिग्री सेल्सियस और गर्मी (कदम 1.1.1) से सीओ 2-मैं के 20 मिलीलीटर जोड़ें। समाधान आगे उपयोग के लिए तैयार है यह दर्शाता है कि पीले रंग के लिए एक रंग परिवर्तन को ध्यान से देखें।
- एक पीले रंग समाधान प्राप्त करने के लिए, 45 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस की वृद्धि में सरगर्मी और हीटिंग के साथ ऊपर तैयार समाधान (कदम 1.1.2) के लिए चार जिलेटिन की जी और धीरे-धीरे गरीब वजन। जिलेटिन समाधान के तहत शांत करने की अनुमतिलगभग 5 मिनट के लिए हुड।
- हवाई बुलबुले शुरू करने के बिना एक 35 मिमी व्यास संस्कृति बर्तन में जिलेटिन समाधान के 4 मिलीलीटर डालो। 30 मिनट के लिए 21 डिग्री सेल्सियस पर पकवान रखें। प्लास्टिक की फिल्म के साथ बर्तन कवर, और उल्टा व्यंजन बारी है। वैकल्पिक रूप से, उपयोग करने से पहले अप करने के लिए 2 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बर्तन की दुकान।
- एक 4% जिलेटिन समाधान तैयार है।
- हुड के तहत, एक हीटिंग ब्लॉक पर 42 डिग्री सेल्सियस पर सीओ 2 -मैं एक बाँझ प्लास्टिक कंटेनर में मध्यम, और गर्मी के 25 मिलीलीटर जोड़ें। हीटिंग ब्लॉक से मध्यम निकालें और धीरे-धीरे गर्म मध्यम और हलचल को जिलेटिन की 1 ग्राम जोड़ें। जल्दी हीटिंग ब्लॉक (42 डिग्री सेल्सियस) पर कंटेनर लौट सकते हैं और इस प्रक्रिया के दौरान यह गर्म रखें।
- सेटिंग अप vibratome तंत्र:
- 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत 20% जिलेटिन समाधान युक्त व्यंजन निकालें। एक स्केलपेल के साथ जिलेटिन काटें। जिलेटिन टुकड़ा पलटें और एस की एक बूंद का उपयोग कर vibratome की काली समर्थन डिस्क पर छड़ीuper गोंद।
- दो हिस्सों में एक रेजर ब्लेड तोड़ने, और vibratome पकड़े गोदाम में एक आधा डालें। Vibratome तंत्र पर काले समर्थन डिस्क डालें। दाईं तरफ काले घुंडी पर मुड़ें। Vibratome के सिर पर धारण संदूक को ठीक करें। जिलेटिन ब्लॉक कवर करने के लिए vibratome टैंक में सीओ 2 -मैं मध्यम के लिए पर्याप्त मात्रा में शामिल करें।
- Vibratome पर स्विच और जिलेटिन ब्लॉक के तीन सौ माइक्रोन स्लाइस काट लें। आगे उपयोग के लिए जिलेटिन ब्लॉक रखें।
- संस्कृति के माध्यम से 40 मिलीलीटर की तैयारी:
- हुड के तहत भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) के 10% के साथ Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) तैयार करें। 1 मिलीग्राम / एमएल पाली D-lysine का उपयोग कर फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) 7.4 पीएच तैयार करें।
- एक 96 अच्छी तरह से थाली में, कोट करने के लिए कुओं के नीचे पाली D-lysine के 2 माइक्रोग्राम प्रति / 2 सेमी जोड़ें। सीओ 2 इनक्यूबेटर में 5% के भीतर 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए थाली सेते हैं। ऊष्मायन के बाद, पीबीएस को हटाने और 200 μl के साथ की जगह/ प्रयोग करने से पहले 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर फिर से अच्छी तरह से DMEM और जगह।
पूरे रेटिना 2. विच्छेदन
- माउस मालूम करना:
- यूरोपीय निर्देश 2010/63 के अनुसार माउस बलिदान: गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से। घुमावदार कैंची से सिर कट और कीटाणुनाशक के साथ नजर विसंक्रमित करने के बाद एक 100 मिमी व्यास पेट्री डिश में जगह है।
- बहुत ध्यान से एक घुमावदार पकड़ का उपयोग कर इसे सेक्शनिंग द्वारा ऑप्टिक तंत्रिका अलग होने के बाद आंख निकालें। फिर 21 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ सीओ 2 -मैं मध्यम युक्त एक 35 मिमी पेट्री डिश में दोनों आंखों जगह है।
- रेटिना हटाना:
- आँख दुनिया में कैंची लागू करने के लिए सक्षम होने के लिए एक 18 जी सुई की मदद से आंख-अंग के स्तर पर एक छेद बनाओ। छेद के अंदर सीधे कैंची का परिचय और ध्यान से सिलिअरी शरीर को दूर करने के नेत्र दुनिया के सभी परिधि पर आईरिस नीचे श्वेतपटल काटा।
- नेत्र दुनिया आए उछाल और एक "नारंगी" के रूप में यह छील। श्वेतपटल और रेटिना pigmented उपकला (RPE) से रेटिना अलग करें। अभी ऑप्टिक तंत्रिका का स्तर बहुत ही सावधानी के साथ ठीक घुमावदार कैंची में संलग्न रेटिना अलग करें।
- दो ठीक पकड़ती साथ रेटिना के केंद्र की ओर परिधि से शेष शीशे को अलग करें। सभी शीशे पूरी तरह से रेटिना के सपाट अनुमति देने के लिए निकाल दिया जाता है कि सुनिश्चित करें।
- एक प्लास्टिक पिपेट का सिरा काटें और प्लास्टिक विंदुक के साथ सीओ 2 -मैं मध्यम युक्त एक 35 मिमी व्यास पेट्री डिश के लिए रेटिना हस्तांतरण।
फ्लैट mounte 3. सीलजिलेटिन ब्लॉक पर डी रेटिना
- फ्लैट मुहिम शुरू की रेटिना की सील की अनुमति के लिए vibratome टैंक (जिलेटिन ब्लॉक मुक्त है) से सीओ 2 -मैं माध्यम के 30 मिलीलीटर - 20 निकालें।
- एक प्लास्टिक पिपेट का उपयोग कर एक गिलास स्लाइड के लिए रेटिना स्थानांतरण और दो -मैं मध्यम जिलेटिन टुकड़ा पर नीचे का सामना करना पड़ फोटोरिसेप्टर साथ जिलेटिन टुकड़ा करने के लिए स्थानांतरित करने से पहले कंपनी की एक बूंद जोड़ें।
- धीरे दूसरे पक्ष पर गर्म जिलेटिन को खदेड़ने के लिए एक साथ रेटिना और जिलेटिन ब्लॉक के बीच ब्लॉक के एक तरफ गरम 4% जिलेटिन इंजेक्शन और से जिलेटिन ब्लॉक करने के लिए रेटिना संलग्न।
- पाश्चर विंदुक के साथ महाप्राण 4% जिलेटिन। कुल सील अनुमति देने के लिए 10 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें। ब्लॉक और पूरी तरह से ब्लेड विसर्जित करने के लिए सीओ 2 -मैं मध्यम जोड़ें।
4. रेटिना सेक्शनिंग
नोट: यह कदम अन्य रेटिना की कोशिकाओं के बिना फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं की एक परत प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है (चित्रा 1)।
- जिलेटिन ब्लॉक पर ऊपर से शुरू, रेटिना तक पहुंचने के लिए 100 माइक्रोन धारावाहिक वर्गों में कटौती। भीतरी परत के 120 माइक्रोन धारा - 100 तो काटा। आवेदन के आधार पर, इस परत खारिज किया जा सकता है या तरल नाइट्रोजन में संग्रहीत। Vibratome की गति भीतरी परत या फोटोरिसेप्टर परतों के सेक्शनिंग के दौरान (1 या 2 पर) बहुत धीमी है कि सुनिश्चित करें।
- भीतरी और बाहरी रेटिना के बीच इंटरफेस के लिए इसी रेटिना के मध्यवर्ती 15 माइक्रोन वर्गों को पूरा करें। एक खुर्दबीन के नीचे इस खंड का निरीक्षण करें। रक्त वाहिकाओं के अभाव बाहरी रेटिना तक पहुँच गया है कि इंगित करता है।
- जिलेटिन के साथ बाहरी रेटिना के 200 माइक्रोन (फोटोरिसेप्टर परत) में कटौती और यह सीओ 2 -मैं माध्यम के 3 मिलीग्राम से भरा एक 35 मिमी व्यास पकवान के लिए स्थानांतरण। सभी retinas के सभी फोटोरिसेप्टर परत वर्गों प्राप्त कर रहे हैं जब तक बर्फ पर रखें।
5. अलग कर फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं
- (पकवान ले लोते) फोटोरिसेप्टर परत (एस) से युक्त और 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में यह (उन्हें) डाल दिया।
- का प्रयोग संदंश धीरे जिलेटिन से फोटोरिसेप्टर परत अलग और घंटी समाधान के 3 एमएल के साथ भरा एक नई डिश में यह हस्तांतरण। प्रत्येक फोटोरिसेप्टर परत तैयार करने के लिए इस कदम (5.2) को दोहराएँ।
- एक 5 मिलीलीटर polypropylene बाँझ ट्यूब में और 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर के भीतर 37 डिग्री सेल्सियस पर यह 30 मिनट सेते (60 माइक्रोन β-mercaptoethanol; 5.5 मिमी एल cystein 1.1 मिमी EDTA) उत्प्रेरक समाधान के 25 μl के साथ papain की दो इकाइयों को सेते । papain की सक्रियता 37 डिग्री सेल्सियस पर हासिल की है। इस ऊष्मायन के दौरान, (बहुत छोटा नहीं) 2 मिमी दो टुकड़ों में फोटोरिसेप्टर परत में कटौती और एक 5 मिलीलीटर ट्यूबों में इन टुकड़ों को हस्तांतरण।
- गुरुत्वाकर्षण अवसादन द्वारा पीछा समाधान घंटी समाधान के 1.5 मिलीलीटर के साथ दो बार रेटिना कुल्ला। नमूना के साथ ट्यूब से सभी शेष घंटी समाधान निकालें।
- सक्रिय papain और मिश्रण युक्त ट्यूब के लिए घंटी समाधान के 475 μl जोड़ें। रेटिना युक्त ट्यूब के लिए इस समाधान जोड़ें।
- सीओ 2 इनक्यूबेटर में 5% के भीतर 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए रेटिना के साथ ट्यूब सेते हैं। DMEM में 10% एफसीएस के 1 मिलीलीटर जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो। मौत कोशिकाओं से पचा डीएनए के लिए deoxyribonuclease के 25 यू मैं (DNase मैं) जोड़ें। ध्यान से एक एक एमएल पिपेट का उपयोग सेल निलंबन homogenize। आरटी पर छह मिनट के लिए 50 XG पर स्पिन।
- सीरम के निशान को हटाने और सेल गोली (विशिष्ट reagents_equipment की तालिका देखें) की खुराक के साथ DMEM मध्यम जोड़ने के लिए और ध्यान से एक 1 मिलीलीटर विंदुक के साथ सेल निलंबन resuspend करने के लिए सतह पर तैरनेवाला त्यागें। आरटी पर छह मिनट के लिए 50 XG पर स्पिन। इस चरण (5.7) एक बार फिर दोहराना।
6 संवर्धन फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं
- PN8 पर एक माउस के फोटोरिसेप्टर परत इस तकनीक का उपयोग करने के बारे 1-1,500,000 सेल शामिल हैं। 1 पर फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं बीजx 10 5 कोशिकाओं / संस्कृति मध्यम और संस्कृति 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर के भीतर 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 दिनों के लिए कोशिकाओं के साथ एक संस्कृति की थाली में 2 सेमी। 5 दिन पर, immunochemistry और एंटीबॉडी आपूर्तिकर्ताओं द्वारा प्रदान की जाने वाली पश्चिमी सोख्ता अध्ययन निम्न तरीकों के लिए आगे बढ़ें।
नोट: कदम संस्कृति को रोकने के लिए और प्रारंभिक परीक्षणों संदर्भ 21 में वर्णित हैं।
Representative Results
इसके अलावा प्रत्यारोपण से, फोटोरिसेप्टर परतें भी फोटोरिसेप्टर संस्कृतियों 12,22 बनाने के लिए कोशिकाओं को बोने से सेल संकेतन अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इसके अतिरिक्त, वे जीन अभिव्यक्ति और circadian ताल 23,24 अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। हम 5% चित्रा 1E सीओ 2 (के साथ एक मशीन में 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 दिनों के लिए कोशिकाओं एफसीएस के अभाव में फोटोरिसेप्टर संस्कृतियों को तैयार करने के प्रसवोत्तर दिन 8 बजे एक जंगली प्रकार माउस से सेल फोटोरिसेप्टर परत का इस्तेमाल किया और बनाए रखा है )। कोशिकाओं तो 4% paraformadehyde का उपयोग कर तय की और फिर या तो माउस मोनोक्लोनल विरोधी रो के साथ एंटीबॉडी आपूर्तिकर्ताओं द्वारा प्रदान की जाने वाली विधियों का उपयोग कर immunocytochemical विश्लेषण के लिए रवाना हुए थे (1: 250, Millipore Mab5316) या खरगोश पॉलीक्लोनल विरोधी शिथिलता (1: 200, एक उदार यिगाल Gery और डेविड हिक्स) का उपहार। हम इस्तेमाल एंटी-रो और विरोधी शिथिलता (हालांकि विरोधी शिथिलता लेबल शंकु और छड़) विरोधी शिथिलता विरोधी रो से पहले के एक मार्कर है कि इस तथ्य के कारण। सेल के अनुपातविरोधी रो एंटीबॉडी के लिए सकारात्मक रास विरोधी शिथिलता एंटीबॉडी (चित्रा 2) के लिए सकारात्मक उन लोगों की तुलना में कम है। इस शिथिलता, रॉड arrestin भी रेटिना के प्रसवोत्तर परिपक्वता के दौरान शिथिलता की अभिव्यक्ति है कि पछाड़ दिया है कि इस तथ्य से वैकल्पिक रूप से अलग-थलग परत में photoreceptors के 3% बनाने के लिए, या जो शंकु द्वारा व्यक्त की है कि इस तथ्य से समझाया जा सकता है रो 25,26 की।
फोटोरिसेप्टर परत भी शाही सेना CSCL ultracentrifugation 27 का उपयोग कर तैयार है और माउस डीएनए चिप ऐरे संकरित गया 35 दिनों के आयु वर्ग के पशुओं के जंगली प्रकार रेटिना और मस्तिष्क के फोटोरिसेप्टर द्वारा जीन की विशिष्ट अभिव्यक्ति की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया गया था। मस्तिष्क (चित्रा 3 ए) की तुलना में rhodopsin के लिए दूत (रो), एस-arrestin (एसएजी) और शंकु के transducin (Gnat2) रेटिना में विशेष रूप से व्यक्त कर रहे हैं। अभिव्यक्ति शामिल हैं जो पूरे रेटिना में से फोटोरिसेप्टर परत (पीआर) में प्रमुख हैभीतरी रेटिना परत इन जीनों फोटोरिसेप्टरों द्वारा वास्तव में व्यक्त कर रहे हैं कि दिखा। Gnat2 के लिए, रो और शिथिलता के लिए तुलना में रिश्तेदार अभिव्यक्ति यह अलग फोटोरिसेप्टर परत के भीतर निहित शंकु द्वारा व्यक्त की है कि पता चलता है। पूरे रेटिना की तुलना में फोटोरिसेप्टर परत में recoverin की अभिव्यक्ति (Rcvrn) (3B चित्रा) बढ़ जाती है।
फोटोरिसेप्टर परत भी रो और GNAT2 एंटीबॉडी आपूर्तिकर्ताओं द्वारा प्रदान की जाने वाली विधियों का पालन पश्चिमी सोख्ता का उपयोग करने की अभिव्यक्ति की निगरानी करने और भीतरी रेटिना परत (चित्रा 4) की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। पूरे रेटिना में और प्रसवोत्तर दिन 35 पर rd1 माउस की रेटिना में क्रमश: रो और GNAT2 28, छड़ और शंकु के मार्कर की अनुपस्थिति की सूचना।
फाईgure 1. माउस रेटिना के vibratome सेक्शनिंग के योजनाबद्ध देखें। Vibratome ब्लेड के साथ भीतरी रेटिना के (ए) जिलेटिन टुकड़ा पर नीचे का सामना करना पड़ फोटोरिसेप्टर के साथ फ्लैट मुहिम शुरू की रेटिना की स्थापना। (बी) की धारा। बाहरी रेटिना (सी) धारा जिलेटिन की गयी। (डी) नियंत्रण फोटोरिसेप्टर परत के अलगाव के बाद रेटिना के टुकड़ा के किनारे पर फोटोरिसेप्टर की उपस्थिति। हरी प्रतिदीप्ति के लिए इस्तेमाल किया स्केल बार एक सफेद प्रकाश माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल किया जाता है। फोटोरिसेप्टरों तस्वीर के किनारे में स्थित हैं। (ई) संवर्धित फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं (पोस्ट-पाँच दिन)। (एफ) पैनल ई के उच्च बढ़ाई
माउस फोटोरिसेप्टर संस्कृति में रो और शिथिलता के चित्रा 2. विभेदक अभिव्यक्ति। नाभिक (ए) धुंधला (नीले), (ख) शिथिलता धुंधला (हरा), (सी) रो धुंधला (लाल)। (डी) छवि विलय कर दिया। शिथिलता का धुंधला पहले रो धुंधला से व्यक्त किया गया है, क्योंकि केवल दो कोशिकाओं डबल शिथिलता और रो (देखें *) चिह्नित कर रहे हैं। स्केल बार:। 23 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
मस्तिष्क और पूरे रेटिना और पैंतीस दिनों आयु वर्ग के जंगली प्रकार के पशुओं के फोटोरिसेप्टर में तीन जीनों की अभिव्यक्ति की 3. तुलना चित्रा। (ए) Rhodopsin (रो), एस-arrestin (एसएजी) और शंकु के transducin (Gnat2)। (बी) Calbindin (Calb1) और Recoverin (Rcvrn)। डेटा रिश्तेदार अभिव्यक्ति के रूप में प्रदर्शित कर रहे हैं। रिश्तेदार अभिव्यक्ति एक अभिव्यक्ति मूल्य हैKBaSS (http://kbass.institut-vision.org/KBaSS/) ज्ञान डेटाबेस में उपलब्ध सॉफ्टवेयर मजबूत बहु सरणी औसत (आरएमए) के साथ normaliszation के बाद माइक्रोएरे डेटा से प्राप्त की।
भीतरी रेटिना में और प्रसवोत्तर दिन 35. ACTB, बीटा पर rd1 माउस की रेटिना में उनकी अभिव्यक्ति की प्रसवोत्तर दिन 35. अनुपस्थिति में एक जंगली प्रकार रेटिना से बाहरी रेटिना में रो और GNAT2 चित्रा 4. अभिव्यक्ति -actin। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytidine 5′-diphosphocholin* | Sigma-Aldrich | C0256 | 4.7 µM Cytidine 5′-diphosphocholin |
| Cytidine 5′-diphosphoethanolamine* | Sigma-Aldrich | C0456 | 2.7 µM Cytidine 5′-diphosphoethanolamine |
| Linoleïc acid/ bovine serum albumin (BSA)* | Sigma-Aldrich | L8384 | 100 µg/ml linoleïc acid/ bovine serum albumin (BSA) |
| Triiodo-L-thyronine* | Sigma-Aldrich | T6397 | 0.03 µM Triiodo-L-thyronine |
| 96-well plates | Greiner bio-one | 655-095 | |
| Binocular microscope | Leica | MZ-75 | |
| CO2 independent (CO2-i) | Life Technologies | 18045054 | |
| DMEM | Life Technologies | 41966029 | |
| Forceps n°5 Dumont | Bionic | 11254-20 | |
| Gelatin from porcin skin type A | Sigma-Aldrich | G2500 | |
| GeneChip | Affymetrix | U74v2 | |
| Gentamicin solution | Life Technologies | 15710049 | |
| Hydrocortison* | Sigma-Aldrich | H0888 | 0.55 µM hydrocortison |
| Insulin* (I) | Sigma-Aldrich | I1884 (ITS) | 0.86 µM insulin (I) |
| Papain | Worthington-biochem | WOLS03124 | |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P-6407 | |
| Progesterone* | Sigma-Aldrich | P7556 | 2.0 µM progesterone |
| Prostaglandin* | Sigma-Aldrich | P5172 | 0.28 µM prostaglandin |
| Putrescine* | Sigma-Aldrich | P5780 | 182 µM putrescine |
| Scalpel Albion | EMS | 72000 | |
| Scissor | Moria | 15396-00 | |
| Sodium pyruvate* | Sigma-Aldrich | S8636 | 1 mM sodium pyruvate |
| Sodium selenite* (S) | Sigma-Aldrich | I1884 (ITS) | 0.29 µM Na2SeO3 (S) |
| Taurine* | Sigma-Aldrich | T8691 | 3 mM taurine |
| Transferrin* (T) | Sigma-Aldrich | I1884 (ITS) | 0.07 µM transferrin (T) |
| Vibratome apparatus | Leica | VT1000-S | |
| * Supplements | |||
References
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