Summary
Neural netthinnen av en mus i alderen 8 dager er på toppen av en 4% gelatin blokk. Etter isolering av det fotoreseptoren lag (200 um) ved vibratome, blir fotoreseptorene utsådd etter mekanisk og enzymatisk dissosiasjon for kulturen. Fotoreseptoren sjikt kan brukes til molekylære, biokjemiske analyser eller transplantasjon.
Abstract
Netthinnen er en del av det sentrale nervesystemet som har organisert arkitektur, med nevroner i lag av fotoreseptorene, både staver og tapper som er i kontakt med den retinale pigmentert epitelet i den fjerneste del på retina vurderer lysretningen, og den ganglion celler i den mest proksimale avstand. Denne arkitektur gjør isoleringen av fotoreseptoren laget ved vibratome snitting. Dissekert nevrale netthinnen av en mus i alderen 8 dager er flat-embedded i 4% gelatin på toppen av en bit av 20% gelatin fotoreseptoren lag vendt ned. Ved hjelp av en vibratome og en dobbel edged barberblad, er 100 mikrometer tykt indre netthinne seksjoneres. Denne delen inneholder gangliecellene og det indre lag med særlig de bipolare celler. En mellomliggende seksjon av 15 um blir forkastet før 200 pm av den ytre retina som inneholder fotoreseptorene gjenvinnes. Gelatinen blir fjernet ved oppvarming til 37 ° C. Biter av ytre laget er incubated i 500 ul av Ringers løsning med 2 enheter av aktivert papain i 20 minutter ved 37 ° C. Reaksjonen stoppes ved tilsetning av 500 ul 10% føtalt kalveserum (FCS) i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM), blir deretter 25 enheter av DNAse tilsatt før sentrifugering ved romtemperatur, vaskes flere ganger for å fjerne serum, og cellene resuspenderes i 500 ul DMEM og utsådd på en 5 x 10 celler / cm2. Cellene er vokst til fem dager in vitro og deres levedyktighet scoret bruker levende / død analysen. Renheten av kulturen bestemmes først ved mikroskopisk observasjon i løpet av eksperimentet. Renheten blir deretter validert ved såing og fikse celler på en histologisk lysbilde og analysere ved hjelp av en kaninpolyklonalt anti-SAG, en fotoreseptoren markør og mus monoklonalt anti-RHO, en stang fotoreseptor spesifikk markør. Alternativt kan fotoreseptoren lag (97% stenger) brukes for genet eller proteinet uttrykket analyse og for transplantasjon.
Introduction
Netthinnen er en integrert del av sentralnervesystemet som har en arkitektur konservert blant virveldyr. Nevronene i neurale netthinnen er organisert i lag, med den mest fjerntliggende for det innfallende lys, fotoreseptoren sjikt i nær kontakt med den retinale pigmentert epitel (RPE) på baksiden av øyet. Stang og kjegle photorecptors er lyssensitive celler som er avhengige av opsin sensitive molekyler for foton fangst. Disse molekylene er omsluttet på disk membraner av en cellestruktur, som ligger på den ytre del av fotoreseptoren, som peker i retning av RPE 1. Denne strukturen, som er oftest påvirket veldig tidlig i tilfeller av fotoreseptorlidelser degeneration, fornyes med en hastighet på 10% hver dag. Den såkalte indre lag inneholder de fleste av de andre neuroner som beregne det signal som mottas fra fotoreseptorene, bipolar, amacrine og horisontale celler, så vel som gangliecellene. Disse sistnevnte med sine axonerdanner en bjelke som er den optiske nerven. Denne lagdelingen er så konservert at biologer har brukt begrepet fortrengt amacrine celler når cellene er funnet utenfor den indre plexiform lag 2. Lag av nevroner er fordelt i en armatur av radial Müller gliaceller. Bipolare celler knytte fotoreseptorene til ganglion celler. De er plassert mellom det ytre plexiform lag og det indre lag plexiform. Ganglion-celler danner den indre plexiform sjikt i forbindelse med de bipolare celler. De amacrin cellene er navngitt som foreningen celler lokalisert i indre plexiform lag mellom bipolare celler og ganglion celler. Den ytre plexiform laget inneholder horisontale celler. Denne unike arrangement av neuronal lag av sentralnervesystemet tillater isolering av fotoreseptoren lag fra den indre cellelaget ved å skjære den flate montert hinnen ved hjelp av en vibratome.
Opprinnelig ble denne teknikken brukt til å isolere fotoreseptorene for transplantation i øyet av RD1 mus, en modell av menneskelig retinitis pigmentosa (RP) 3. Den RD1 mus bærer en recessiv mutasjon i Pde6b genet som koder for det stav-spesifikke fosfodiesterase-beta-underenhet. Recessive mutasjoner av dette genet resultat i RP hos mennesker fire. Etter stang fotoreseptorene har utartet, mister pasienten nattsyn, og overraskende kjegle fotoreseptorer, som ikke uttrykker det muterte genet, utarte som et neste trinn. Fordi kjeglene er nødvendig for fargesyn og synsskarphet, pasientene blir gradvis blind og en effektiv behandling for sykdommen har ennå ikke utviklet. Ved poding av fotoreseptoren sjikt fra en villtype-mus konusen degenerasjon av vertmusen forsinkes 3,5. Stavene tapt i stav kjegle degenerative modell kunne ikke erstattes av et transplantat, fordi den synaptiske forbindelsen mellom stang og bipolare celler kan bare oppnås ved en bestemt fase av retinal utvikling, preget av utbruddet av NRL uttrykk seks. Sjiktet av fotoreseptorene er innført ved operasjon i sub-retinal plass av stangen mindre RD1 retina, RPE og mellom den ytre retina svarende til bare 3% av de gjenværende fotoreseptorer, kjeglene. To uker etter kirurgi, 40% av kjegler fra dyr transplantert med en vanlig fotoreseptoren lag overlevde i forhold til dyr transplantert med et normalt indre lag av netthinneceller, eller til sham-opererte dyr. Topografien kjegle overlevelse, spredt ut over hele overflaten av det muterte retina plassert ved posisjonen av den podede vev viser at den beskyttende effekt skyldes en diffunderbart molekyl 7.
Deretter vi brukt et ko-kultursystem, så vel som kondisjonert kulturmedium for å validere det faktum at den beskyttende effekt er avhengig av sekresjon av et protein ved hjelp av stenger 8,9. Vi hypotese at dette proteinet vil bli expressed kontinuerlig og spesielt av stenger og at deres død i løpet av første fase av sykdommen vil utløse sekundær kjegle degenerasjon av tapet av en beskyttende signal fra stenger i et ikke-celle autonome måte 10. På grunn av viktigheten av kjeglen mediert sentrale synet hos primater denne antatte proteinet vil være en svært relevant terapeutisk verktøy for RP. Bevare de kjeglene i RP ville teoretisk hindre totalt 1,5 millioner pasienter over hele verden til å bli blind 11. Vi har brukt et høyt innhold screening tilnærming og en kjegle-beriket kultur modell for å identifisere et cDNA som koder for Rod-avledet Cone Livskraftig Factor (RdCVF) fra en retinal cDNA bibliotek 12. RdCVF er skjøtt produkt av NXNL1 gen som er interessant homologt til genet som koder for proteiner involvert i tioredoksin redoks-homeostase 13. Den andre skjøtes produkt av genet, er RdCVFL et enzym som beskytter sitt mål, Tau-protein mot oksidativ dAmage 14. Administrasjon av RdCVF hindrer sekundær degenerasjon av kjegler og tapet av sin visuelle funksjon i en recessiv, og dominerende modellen av RP 12,15. Dette viser to viktige aspekter ved denne innovative terapeutisk strategi 16. For det første kan den anvendes i de fleste tilfeller RP i et gen-uavhengig måte. For det andre er i strid med konkurrerende faktor CNTF, RdCVF overlevelse i forbindelse med vedlikehold av synsfunksjon 17. Fraværet av funksjonelle effekten kan forklare årsaken til fravær av klinisk nytte av forvaltningen av CNTF til RP pasienter 18. RdCVF er mest sannsynlig en av de viktige overlevelse signalet mellom stenger og kjegler siden kjegle redning in vitro hemmes av RdCVF immunodepletion 12. I tillegg til avbrudd av den stang avledet kjegle levedyktighet genet fører til fotoreseptoren dysfunksjon og mottakelighet for oksidativt stress 19.
Anvendelse avfotoreseptoren laget er på opprinnelsen til identifisering av RdCVF og av en roman Redox signal involvert i nevrodegenerative sykdommer 20. Dette manuskriptet beskriver protokollen som brukes for å isolere og dyrke celler fra fotoreseptoren lag for å karakterisere aktiviteten av RdCVF. Fotoreseptorene kan opprettholdes i kultur for 5 til 7 dager 21. Denne teknikken kan også brukes til å studere ekspresjonen av spesifikke gener fotoreseptoren.
Protocol
MERK: Prosedyren ble godkjent av etisk komité Darwin fra University Pierre og Marie Curie (Ce5 / 2009/048)
1. Utarbeidelse av Gelatin Solution, Instrumenter, Vibratome, Kultur Media og kultur Plate
- Fremstille en 20% gelatinoppløsning i minst en dag før eksperimentet.
- Under panseret, tilsett 500 mL av gentamycin [10 mg / ml] til en 500 ml flaske som inneholder CO 2 uavhengige medium (CO 2 -i).
- I et separat begerglass, tilsett 20 ml av CO2-I (fra trinn 1.1.1) og oppvarm til 95 ° C på en varmeblokk med konstant omrøring i 15 min. Observere en fargeendring til gult, noe som indikerer at løsningen er klar for videre bruk.
- Vei 4 g gelatin og gradvis dårlig til løsningen fremstilt ovenfor (trinn 1.1.2) med øket omrøring og oppvarming ved 95 ° C i 45 min, for å oppnå en gul farge-løsning. Tillat løsningen å avkjøle gelatin henholdpanseret for ca 5 min.
- Hell 4 ml av den gelatinoppløsning inn i et 35 mm diameter kulturskåler uten å innføre luftbobler. Hold fatet ved 21 ° C i 30 min. Dekk til retter med plastfolie, og slå de retter opp ned. Eventuelt lagre rettene ved 4 ° C i opp til to måneder før bruk.
- Forbered en 4% gelatin løsning.
- Under panseret, tilsett 25 ml av CO 2 -i medium i en steril beholder, og varme ved 42 ° C på en varmeblokk. Fjern mediet fra varmeblokken og tilsett 1 g gelatin til det varme medium og rør. Raskt tilbake beholderen på varmeblokken (42 ° C) og holde den varm under prosessen.
- Sette opp vibratome apparat:
- Fjern de skåler inneholdende 20% gelatin-oppløsning oppbevares ved 4 ° C. Skjær gelatin med en skalpell. Vend gelatin skive og feste den på den svarte støtte plate av vibratome å bruke en dråpe super lim.
- Bryte et barberblad i to halvdeler, og sett den ene halvdelen inn i vibratome holde kontakten. Sett den sorte støtte skiven på vibratome apparat. Slå på den svarte kulen til høyre side. Fest holde kontakten på hodet av vibratome. Tilsett tilstrekkelig mengde av CO 2 -i medium i vibratome tanken for å dekke gelatinblokken.
- Slå på vibratome og skar tre 100 mikrometer skiver av gelatin blokk. Hold gelatin blokk for videre bruk.
- Forbered 40 ml dyrkingsmedium:
- Forberede Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) med 10% av føtalt kalveserum (FCS) under panseret. Forbered 1 mg / ml poly-D-lysin ved bruk av fosfatbuffer-saltvann (PBS) pH 7,4.
- I en 96-brønns plate, tilsett 2 mikrogram / cm 2 av poly-D-lysin for å belegge bunnen av brønnene. Platen inkuberes i 45 minutter ved 37 ° C i løpet av 5% CO2-inkubator. Etter inkubasjon, fjerne PBS og erstatte med 200 ul/ Brønn DMEM og stedet på nytt ved 37 ° C i 5% CO2 inkubator før bruk.
2. Disseksjon av Hele Retina
- Enucleate musen:
- Ofre musen i henhold til EU-direktiv 2010/63: ved halshugging. Kutt hodet med buede-saks og legg den i en 100 mm diameter petriskål etter å ha desinfisert øyet med desinfeksjonsmiddel.
- Fjerne øyet etter å ha løsrevet synsnerven ved seksjonering det veldig forsiktig med en buet grep. Deretter plasserer begge øynene i en 35 mm petriskål inneholder sterilt CO 2 -i medium ved 21 ° C.
- Fjerne netthinnen:
- Lag et hull i nivå med øyet-lem ved hjelp av en 18 G nål for å være i stand til å innføre saksen i øyeeplet. Innføre rette saks inne i hullet og forsiktig kuttet sclera under iris på hele omkretsen av okulær verden for å fjerne strålelegeme.
- Opptur med okulær kloden og skrelle den som en "oransje". Løsne netthinnen fra sclera og retinal pigmentert epitel (RPE). Løsne hinnen fremdeles er festet på nivå med den optiske nerven meget nøye med fine buede-saks.
- Løsne det gjenværende glasslegemet fra periferien mot midten av retina med to fine hylster. Sørg for at alle glasslegemet er helt fjernet for å tillate utflating av netthinnen.
- Skjær enden av en plast pipette og overføre netthinnen til en 35 mm diameter petriskål som inneholder CO 2 -i medium med plastpipetten.
3. Tetting av Flat-Mounted Retina på Gelatin Block
- Fjern 20 - 30 ml av CO 2 -i medium fra vibratome tanken (gelatinblokken er fritt) for å muliggjøre forsegling av flatmontert hinnen.
- Overfør netthinnen til et glass lysbilde med en plast pipette og tilsett en dråpe av CO 2 -i medium før du overfører til gelatin skive med fotoreseptoren vender ned mot gelatin skive.
- Sett på netthinnen til gelatinblokken ved forsiktig å injisere oppvarmet 4% gelatin på den ene side av blokken mellom netthinnen og gelatin blokken og samtidig utvise varm gelatin på den andre siden.
- Aspirer 4% gelatin med en pasteur-pipette. Vent i 10 minutter for å tillate total forsegling. Legg CO 2 -i medium å fordype blokken og bladet helt.
4. Seksjonering Retina
MERK: Dette trinnet er avgjørende for å få et lag av fotoreseptorcellene uten de andre netthinnens celler (figur 1).
- Med start fra toppen på gelatin blokk, kuttet 100 um seriesnitt for å nå netthinnen. Deretter skar 100-120 mikrometer deler av det indre laget. Avhengig av programmet, kan dette laget kastes eller lagres i flytende nitrogen. Sikrer at hastigheten på vibratome er meget langsom (ved 1 eller 2) i løpet av seksjonering av det indre lag eller lagene fotoreseptorer.
- Utføre mellomliggende 15 pm seksjoner av retina som svarer til grenseflaten mellom den indre og den ytre retina. Observere dette avsnittet under et mikroskop. Fraværet av blodkar indikerer at den ytre retina er nådd.
- Skjær 200 pm av den ytre retina (fotoreseptoren lag) med gelatin og overføre den til en 35 mm diameter fatet fylt med 3 ml av CO 2 -i medium. Hold det på is inntil alle fotoreseptoren lag deler av alle netthinne oppnås.
5. dissociating fotoreseptorcellene
- Ta parabolen (e) som inneholder den fotoreseptoren laget (-lagene) og sette den (dem) i en inkubator ved 37 ° C i 10 min.
- Ved hjelp av pinsett forsiktig skille fotoreseptoren laget fra gelatin og overføre den i en ny rett fylt med 3 ml Ringers oppløsning. Gjenta dette trinnet (5.2) for hver fotoreseptor lag forberedelse.
- Inkuber 2 enheter av papain med 25 ul av aktivator-løsning (1,1 mM EDTA, 5,5 mM L-Cystein; 60 pM β-merkaptoetanol) i en 5 ml polypropylen sterilt rør og inkuberes det i 30 minutter ved 37 ° C i 5% CO2-inkubator . Aktiveringen av papain er oppnådd ved 37 ° C. I løpet av denne inkubasjon, kutt fotoreseptoren lag i 2 mm 2 stykker (ikke for små) og overføre disse delene til en 5 ml rør.
- Skyll retina to ganger med 1,5 ml oppløsning Ringers løsning, etterfulgt av gravitasjonssedimentering. Fjern alle gjenværende Ringers løsning fra røret med prøven.
- Legg 475 ul av Ringers løsning til røret inneholdende aktivert papain og blanding. Legg denne løsningen til røret inneholdende netthinnen.
- Inkuber røret med retina i 20 minutter ved 37 ° C i 5% CO2-inkubator. Stopp reaksjonen ved å tilsette 1 ml 10% FCS i DMEM. Legg 25 U av deoksyribonuklease I (DNAse I) til spaltet DNA fra døds celler. Homogencellesuspensjonen forsiktig ved anvendelse av en 1 ml-pipette. Spinne ved 50 xg i 6 min ved RT.
- Kast supernatanten for å fjerne spor av serum og tilsett DMEM-medium med kosttilskudd (se tabell over bestemte reagents_equipment) til celle-pellet og resuspender nøye cellesuspensjonen med en 1 ml pipette. Spinne ved 50 xg i 6 min ved RT. Gjenta dette trinnet (5.7) en gang mer.
6 Dyrking fotoreseptorcellene
- Den fotoreseptoren lag av en mus på PN8 inneholder ca 1 til 1,5 millioner celler ved hjelp av denne teknikken. Seed fotoreseptorcellene på en5 x 10 celler / cm2 i en kulturplate med kulturmedium og kultur av cellene i 5 dager ved 37 ° C i 5% CO2-inkubator. På dag 5, fortsett til immunokjemi og vestlige blotting studie følgende metoder som tilbys av antistoff leverandører.
MERK: Fremgangsmåte for å stoppe kultur og foreløpige testene er beskrevet i referanse 21.
Representative Results
Bortsett fra transplantasjon, har fotoreseptorlidelser lagene også blitt brukt til å studere cellesignalisering ved såing celler for å lage fotoreseptorlidelser kulturer 12,22. I tillegg blir de brukt til å studere genekspresjon og døgnrytme 23,24. Vi har benyttet fotoreseptoren cellelaget fra et villtype-mus ved postnatal dag 8 for å fremstille fotoreseptoren kulturer i fravær av FCS og holdt cellene i 5 dager ved 37 ° C i en inkubator med 5% CO2 (figur 1E ). Cellene ble deretter fiksert ved hjelp av 4% paraformadehyde og deretter fortsatte for immunocytokjemisk analyse ved hjelp av metoder som tilbys av leverandører antistoff enten med muse-monoklonalt anti-RHO (1: 250, Millipore Mab5316) eller kanin-polyklonalt anti-SAG (1: 200, en generøs gave av Igal Gery og David Hicks). Vi brukte anti-RHO og anti-SAG (selv om anti-SAG etikett kjegler og stenger) på grunn av det faktum at anti-SAG er en tidligere markør, enn anti-Rho. Andelen av cells positive for anti-RHO antistoff er lavere enn de som er positive for anti-SAG-antistoffer (figur 2). Dette kan forklares ved det faktum at SAG, er stangen arrestin også uttrykkes av kjegler som utgjør 3% av fotoreseptorer i det isolerte lag, eller alternativt ved det faktum at i løpet av post-natal modning av retina, ekspresjonen av SAG forut for at av RHO 25,26.
Fotoreseptoren lag ble også brukt til å overvåke den spesifikke ekspresjon av gener av fotoreseptorene av villtype-retina og hjernen av dyr i alderen 35 dager RNA ble fremstilt ved hjelp av CsCl-ultrasentrifugering 27 og hybridiserte til mus DNA chip-array. Budbringere for rhodopsin (Rho), er S-arrestin (Sag) og kjegle-transducin (Gnat2) uttrykt spesifikt i netthinnen i forhold til hjernen (figur 3A). Uttrykket er fremtredende i fotoreseptoren lag (PR) enn i hele netthinnen som omfatterden indre retinal lag som viser at disse genene er uttrykt faktisk av fotoreseptorer. For Gnat2, den relative uttrykk i forhold til Rho og Sag viser at det er uttrykt av kjegler som finnes i den isolerte fotoreseptoren lag. Ekspresjon av recoverin (Rcvrn) i fotoreseptoren lag i forhold til hele netthinnen økes (figur 3B).
Fotoreseptoren laget ble også brukt til å overvåke uttrykk for RHO og GNAT2 hjelp western blotting følgende metoder som tilbys av antistoff leverandører og å sammenligne med den indre retinal lag (figur 4). Legg merke til fraværet av RHO og GNAT2 28 markører for stenger og kjegler henholdsvis i hele netthinnen og i netthinnen av RD1 musen på postnatal dag 35.
Figur 1. Skjematisk visning av vibratome seksjonering av musen netthinnen. (A) Installasjon av flat-montert netthinnen med fotoreseptoren vender ned mot gelatin skive. (B) seksjon av den indre netthinne med vibratome blad. (C) Seksjon for ytre retina lagt av gelatin. (D) Kontroll av tilstedeværelsen av fotoreseptoren på kanten av fragmentet av netthinnen etter isolering av fotoreseptoren lag. Skala bar anvendes for grønn fluorescens blir brukt av et hvitt lysmikroskop. Fotoreseptorene ligger i kanten av bildet. (E) Cultured fotoreseptorcellene (post-fem dager). (F) Høyere forstørrelse av panel E.
Figur 2. Differential uttrykk for RHO og SAG i mus fotoreseptor kultur. (A) Farging av kjerner (blå), (B) SAG flekker (grønn), (C) RHO farging (rød). (D) sammenslåtte bildet. Fordi farging av SAG er uttrykt tidligere enn RHO flekker, er bare to celler dobbeltmerket SAG og RHO (se *). Målestokk:. 23 mikrometer Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Sammenligning av ekspresjonen av tre gener i hjernen og hele netthinnen og fotoreseptorene av vill-type dyr alderen trettifem dager. (A) Rhodopsin (Rho), S-arrestin (Sag) og kjegle-transducin (Gnat2). (B) Calbindin (Calb1) og Recoverin (Rcvrn). Dataene vises som relative uttrykk. Den relative uttrykk er et uttrykk verdiinnhentet fra microarray data etter normaliszation med programvaren Robust Multi-matrise Average (RMA) tilgjengelig i kunnskapsdatabasen KBaSS (http://kbass.institut-vision.org/KBaSS/).
Figur 4. Uttrykk for RHO og GNAT2 i ytre netthinnen fra en vill-type netthinnen ved postnatal dag 35. Fravær av deres uttrykk i den indre netthinne og i netthinnen i RD1 musen på postnatal dag 35. ACTB, beta aktin. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytidine 5′-diphosphocholin* | Sigma-Aldrich | C0256 | 4.7 µM Cytidine 5′-diphosphocholin |
| Cytidine 5′-diphosphoethanolamine* | Sigma-Aldrich | C0456 | 2.7 µM Cytidine 5′-diphosphoethanolamine |
| Linoleïc acid/ bovine serum albumin (BSA)* | Sigma-Aldrich | L8384 | 100 µg/ml linoleïc acid/ bovine serum albumin (BSA) |
| Triiodo-L-thyronine* | Sigma-Aldrich | T6397 | 0.03 µM Triiodo-L-thyronine |
| 96-well plates | Greiner bio-one | 655-095 | |
| Binocular microscope | Leica | MZ-75 | |
| CO2 independent (CO2-i) | Life Technologies | 18045054 | |
| DMEM | Life Technologies | 41966029 | |
| Forceps n°5 Dumont | Bionic | 11254-20 | |
| Gelatin from porcin skin type A | Sigma-Aldrich | G2500 | |
| GeneChip | Affymetrix | U74v2 | |
| Gentamicin solution | Life Technologies | 15710049 | |
| Hydrocortison* | Sigma-Aldrich | H0888 | 0.55 µM hydrocortison |
| Insulin* (I) | Sigma-Aldrich | I1884 (ITS) | 0.86 µM insulin (I) |
| Papain | Worthington-biochem | WOLS03124 | |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P-6407 | |
| Progesterone* | Sigma-Aldrich | P7556 | 2.0 µM progesterone |
| Prostaglandin* | Sigma-Aldrich | P5172 | 0.28 µM prostaglandin |
| Putrescine* | Sigma-Aldrich | P5780 | 182 µM putrescine |
| Scalpel Albion | EMS | 72000 | |
| Scissor | Moria | 15396-00 | |
| Sodium pyruvate* | Sigma-Aldrich | S8636 | 1 mM sodium pyruvate |
| Sodium selenite* (S) | Sigma-Aldrich | I1884 (ITS) | 0.29 µM Na2SeO3 (S) |
| Taurine* | Sigma-Aldrich | T8691 | 3 mM taurine |
| Transferrin* (T) | Sigma-Aldrich | I1884 (ITS) | 0.07 µM transferrin (T) |
| Vibratome apparatus | Leica | VT1000-S | |
| * Supplements | |||
References
- The Organization of the Retina and Visual System. Webvision. Kolb, H., Nelson, R., Fernandez, E., Jones, B. , (2014).
- Perez De Sevilla Muller, L., Shelley, J., Weiler, R. Displaced amacrine cells of the mouse retina. J Comp Neurol. 505 (2), 177-189 (2007).
- Mohand-Said, S., et al. Photoreceptor transplants increase host cone survival in the retinal degeneration (rd) mouse. Ophthalmic Res. 29 (5), 290-297 (1997).
- Daiger, S., Sullivan, L., Bowne, S. RetNet, the Retinal Information Network. , The University of Texas Health Science Center. Houston, TX. Available from: https://sph.uth.edu/retnet (2014).
- Mohand-Said, S., Hicks, D., Dreyfus, H., Sahel, J. A. Selective transplantation of rods delays cone loss in a retinitis pigmentosa model. Arch Ophthalmol. 118 (6), 807-811 (2000).
- MacLaren, R. E., et al. Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors. Nature. 444 (7116), 203-207 (2006).
- Yang, Y., et al. Transplantation of photoreceptor and total neural retina preserves cone function in P23H rhodopsin transgenic rat. PLoS One. 5 (10), (2010).
- Mohand-Said, S., et al. Normal retina releases a diffusible factor stimulating cone survival in the retinal degeneration mouse. Proc Natl Acad Sci USA. 95 (14), 8357-8362 (1998).
- Fintz, A. C., et al. Partial characterization of retina-derived cone neuroprotection in two culture models of photoreceptor degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (2), 818-825 (2003).
- Cronin, T., Leveillard, T., Sahel, J. A. Retinal degenerations: from cell signaling to cell therapy; pre-clinical and clinical issues. Curr Gene Ther. 7 (2), 121-129 (2007).
- Wright, A. F. A searchlight through the fog. Nat Genet. 17 (2), 132-134 (1997).
- Leveillard, T., et al. Identification and characterization of rod-derived cone viability factor. Nat Genet. 36 (7), 755-759 (2004).
- Lillig, C. H., Holmgren, A. Thioredoxin and related molecules--from biology to health and disease. Antioxid Redox Signal. 9 (1), 25-47 (2007).
- Fridlich, R., et al. The thioredoxin-like protein rod-derived cone viability factor (RdCVFL) interacts with TAU and inhibits its phosphorylation in the retina. Mol Cell Proteomics. 8 (6), 1206-1218 (2009).
- Yang, Y., et al. Functional cone rescue by RdCVF protein in a dominant model of retinitis pigmentosa. Mol Ther. 17 (5), 787-795 (2009).
- Bennett, J. Strategies for delivery of rod-derived cone viability factor. Retina. 25 (8 Suppl), S47 (2005).
- Komaromy, A. M., et al. Transient photoreceptor deconstruction by CNTF enhances rAAV-mediated cone functional rescue in late stage CNGB3-achromatopsia. Mol Ther. 21 (6), 1131-1141 (2013).
- Birch, D. G., Weleber, R. G., Duncan, J. L., Jaffe, G. J., Tao, W. Randomized trial of ciliary neurotrophic factor delivered by encapsulated cell intraocular implants for retinitis pigmentosa. Am J Ophthalmol. 156 (2), 283-292 (2013).
- Cronin, T., et al. The disruption of the rod-derived cone viability gene leads to photoreceptor dysfunction and susceptibility to oxidative stress. Cell Death Differ. 17 (7), 1199-1210 (2010).
- Leveillard, T., Sahel, J. A. Rod-derived cone viability factor for treating blinding diseases: from clinic to redox signaling. Sci Transl Med. 2 (26), 26ps16 (2010).
- Fontaine, V., Hicks, D., Dreyfus, H. Changes in ganglioside composition of photoreceptors during postnatal maturation of the rat retina. Glycobiology. 8 (2), 183-190 (1998).
- Fontaine, V., Kinkl, N., Sahel, J., Dreyfus, H., Hicks, D. Survival of purified rat photoreceptors in vitro is stimulated directly by fibroblast growth factor-2. J Neurosci. 18 (23), 9662-9672 (1998).
- Reichman, S., et al. The homeobox gene CHX10/VSX2 regulates RdCVF promoter activity in the inner retina. Hum Mol Genet. 19 (2), 250-261 (2010).
- Sandu, C., Hicks, D., Felder-Schmittbuhl, M. P. Rat photoreceptor circadian oscillator strongly relies on lighting conditions. Eur J Neurosci. 34 (3), 507-516 (2011).
- Dorrell, M. I., Aguilar, E., Weber, C., Friedlander, M. Global gene expression analysis of the developing postnatal mouse retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (3), 1009-1019 (2004).
- Brooks, M. J., Rajasimha, H. K., Roger, J. E., Swaroop, A. Next-generation sequencing facilitates quantitative analysis of wild-type and Nrl(-/-) retinal transcriptomes. Mol Vis. 17, 3034-3054 (2011).
- Delyfer, M. N., et al. Transcriptomic analysis of human retinal surgical specimens using jouRNAI. J Vis Exp. (78), (2013).
- Ying, S., et al. A CAT reporter construct containing 277bp GNAT2 promoter and 214bp IRBP enhancer is specifically expressed by cone photoreceptor cells in transgenic mice. Curr Eye Res. 17 (8), 777-782 (1998).
