Retina neural de un ratón envejecido 8 días es en la parte superior de un bloque de gelatina 4%. Después del aislamiento de la capa de fotorreceptores (200 m) por vibratome, los fotorreceptores se siembran después de la disociación mecánica y enzimática para la cultura. La capa de fotorreceptores se puede utilizar para, análisis o trasplante bioquímicos moleculares.
La retina es una parte del sistema nervioso central que ha organizado la arquitectura, con las neuronas en las capas de los fotorreceptores, ambos conos y bastones en contacto con el epitelio pigmentado de la retina en la parte más distante sobre la retina teniendo en cuenta la dirección de la luz, y el las células ganglionares en la distancia más proximal. Esta arquitectura permite el aislamiento de la capa de fotorreceptores por vibratome seccionamiento. La retina neural diseccionado de un ratón envejecido 8 días es plana embebido en 4% de gelatina en la parte superior de una rebanada de 20% de gelatina capa de fotorreceptores mirando hacia abajo. El uso de un vibratome y una cuchilla de afeitar de doble filo, el 100 m de espesor retina interna se secciona. Esta sección contiene las células ganglionares y la capa interior con en particular las células bipolares. Una sección intermediario de 15 micras se descarta antes de recuperar 200 m de la retina externa que contiene los fotorreceptores. La gelatina se elimina por calentamiento a 37 ° C. Los pedazos de la capa externa son íncubosted en 500 l de solución de Ringer con 2 unidades de papaína activada durante 20 minutos a 37 ° C. La reacción se detuvo mediante la adición de 500 l 10% de suero de ternera fetal (FCS) en Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), entonces 25 unidades de DNasa I se añade antes de la centrifugación a TA, se lava varias veces para eliminar el suero y las células se resuspenden en 500 l de DMEM y se sembraron a 1 x 10 5 células / cm 2. Las células se cultivan a 5 días in vitro y su viabilidad se calificó utilizando el ensayo en vivo / muerto. La pureza del cultivo se determina por primera vez por la observación microscópica durante el experimento. La pureza es luego validada por distribución y fijación de las células en un portaobjetos histológico y análisis utilizando un anticuerpo policlonal de conejo anti-SAG, un marcador de fotorreceptores y monoclonal de ratón anti-RHO, un marcador específico de los fotorreceptores de varilla. Alternativamente, la capa de fotorreceptores (97% barras) se puede utilizar para el análisis de gen o expresión de la proteína y para el trasplante.
La retina es una parte integral del sistema nervioso central que tiene una arquitectura conservada entre los vertebrados. Las neuronas de la retina neural se organizan en capas, con la más lejana de la luz incidente, la capa de fotorreceptores en estrecho contacto con el epitelio pigmentario de la retina (RPE) en la parte posterior del ojo. Conos y bastones photorecptors son células sensibles a la luz que se basan en moléculas sensibles opsina para la captura de fotones. Estas moléculas están encerradas en las membranas de disco de una estructura celular, que se encuentra en el segmento exterior del fotorreceptor que apunta en la dirección de la RPE 1. Esta estructura, que se ve afectado con mayor frecuencia muy temprano en casos de degeneración de los fotorreceptores, se renueva a un ritmo de 10% todos los días. La capa interna llamada contiene la mayoría de las otras neuronas que calculan la señal recibida de los fotorreceptores, el bipolar, amacrinas y células horizontales, así como las células ganglionares. Estas últimas con sus axonesformar un haz que es el nervio óptico. Esta estratificación es tan conservado que los biólogos han utilizado el término desplazados células amacrinas cuando las células se encuentran fuera de la capa plexiforme interna 2. Las capas de neuronas se distribuyen dentro de una armadura de las células gliales radiales Müller. Células bipolares enlazan fotorreceptores a las células ganglionares. Están situados entre la capa plexiforme externa y la capa plexiforme interna. Las células ganglionares de formar la capa plexiforme interna en relación con las células bipolares. Las células amacrin se denominan como células de asociación ubicadas en la capa plexiforme interna entre las células bipolares y células ganglionares. La capa plexiforme externa contiene células horizontales. Esta disposición única de capas neuronales del sistema nervioso central permite el aislamiento de la capa de fotorreceptores de la capa celular interna por corte de la retina en montaje plano usando un vibratome.
Originalmente, se utilizó esta técnica para aislar los fotorreceptores para transplantation en el ojo del ratón rd1, un modelo de la retinitis pigmentosa humana (RP) 3. El ratón rd1 lleva una mutación recesiva en el gen PDE6B que codifica para la subunidad beta de la fosfodiesterasa-rod específico. Las mutaciones recesivas de este gen producen en los seres humanos RP 4. Después de fotorreceptores han degenerado, el paciente pierde la visión nocturna, y fotorreceptores sorprendentemente cono, que no expresan el gen mutado, degeneran en una segunda etapa. Debido a que los conos se necesitan para la visión del color y de la agudeza visual, los pacientes se vuelven progresivamente ciega y un tratamiento efectivo para la enfermedad aún no se ha desarrollado. Al injertar capa de fotorreceptores de un ratón de tipo salvaje de la degeneración cono del ratón anfitrión se retrasa 3,5. Las barras de perdidas en el modelo degenerativa de conos y bastones no podrían ser reemplazados por un trasplante porque la conexión sináptica entre las barras y las células bipolares sólo se puede obtener en una etapa específica de rdesarrollo etinal, marcado por la aparición de la expresión Nrl 6. La capa de fotorreceptores se introduce por la cirugía en el espacio subretiniano de la retina RD1-rod menos, entre el RPE y la retina externa correspondiente a sólo el 3% de los fotorreceptores restantes, los conos. Dos semanas después de la cirugía, el 40% de los conos del animal trasplantado con una capa normal de fotorreceptores sobrevivió en comparación con el animal trasplantado con una capa normal de las células de la retina interna, o al animal con operación simulada. La topografía de la supervivencia de cono, desplegada sobre toda la superficie de la retina mutado situado en la posición del tejido injertado indica que el efecto protector se debe a una molécula difusible 7.
A continuación, se utilizó un sistema de co-cultivo, así como medios de cultivo condicionados para validar el hecho de que el efecto protector se basa en la secreción de una proteína por varillas 8,9. Nuestra hipótesis es que esta proteína se exprcomputan de forma continua y específicamente por varillas y que su muerte durante la primera fase de la enfermedad se disparará la degeneración secundaria de cono por la pérdida de una señal de protección de las barras de una manera autónoma no celular 10. Debido a la importancia de cono mediada por la visión central en primates esta proteína putativa será una herramienta terapéutica de gran relevancia para RP. Preservar los conos en la RP podría teóricamente evitar que un total de 1,5 millones de pacientes en todo el mundo para convertirse en ciegos 11. Hemos utilizado un enfoque de detección de alto contenido y un modelo de cultivo de cono enriquecido para identificar un ADNc que codifica Cono derivados-Rod Factor Viabilidad (RdCVF) a partir de una biblioteca de ADNc de retina 12. RdCVF es el producto empalmada del gen NXNL1 que, curiosamente es homóloga a la codificación de genes para las proteínas de tiorredoxina que participan en la homeostasis redox 13. El segundo producto de corte y empalme del gen, RdCVFL es una enzima que protege su objetivo, la proteína TAU contra oxidativo damage 14. Administración de RdCVF evita la degeneración secundaria de los conos y la pérdida de su función visual en una recesiva, y el modelo dominante de RP 12,15. Esto demuestra dos aspectos importantes de esta estrategia terapéutica innovadora 16. En primer lugar, se puede aplicar en la mayoría de los casos RP de una manera gen independiente. En segundo lugar, contrariamente al factor de supervivencia compitiendo CNTF, RdCVF está asociado con el mantenimiento de la función visual 17. La ausencia de efecto funcional puede explicar la razón de la ausencia de beneficio clínico de la administración de CNTF a pacientes con RP 18. RdCVF es muy probable que una de las señales de supervivencia importante entre los conos y bastones de rescate desde cono in vitro es inhibida por RdCVF immunodepletion 12. Además, la interrupción del gen viabilidad cono varilla derivados conduce a la disfunción de los fotorreceptores y la susceptibilidad al estrés oxidativo 19.
El uso decapa de fotorreceptores está en el origen de la identificación de RdCVF y de una señal redox novela implicados en enfermedades neurodegenerativas 20. Este manuscrito describe el protocolo usado para aislar y cultivar células de la capa de fotorreceptores para caracterizar la actividad de RdCVF. Los fotorreceptores se pueden mantener en cultivo durante 5 a 7 días 21. Esta técnica también se puede utilizar para estudiar la expresión de genes específicos fotorreceptoras.
La retina es un modelo de órgano en la biología. Estudio de la retina llevó a 6 grandes descubrimientos en la biología. Es en el origen de la primera gen supresor de tumor RB1. Revela el vínculo molecular entre los receptores de tirosina quinasas y las MAP quinasas a través de la interacción con Hijo de sevenless. Se participó en el descubrimiento de PAX6, el primer gen de control maestro para la morfogénesis de órganos. Es en el centro de la asociación genética del factor H del complemento (CFH) con degeneración macular relacionada con la edad (AMD), el primer gen de susceptibilidad enfermedad identificada por la pantalla de asociación amplia del genoma (GWAS). Por último, se llevó a la primera terapia génica exitosa para la amaurosis congénita de Leber, el primer ensayo de terapia génica correctiva en humanos de cualquier enfermedad hereditaria. La estructura de este órgano se conserva en la mayoría de las especies de vertebrados. Su accesibilidad para la manipulación in vivo ha animado desde el principio de la genómica funcional investigaciones en esta parte integral del cientoral sistema nervioso.
Mostramos aquí cómo separar la capa de fotorreceptores de la capa interna de la retina por vibratome seccionamiento. Este paso es fundamental para obtener cultivos puros fotorreceptoras. Nuestro protocolo de disección hace que la contaminación por células del RPE muy poco probable.
Uno de los principales retos es el aplanamiento de la retina que es necesario seccionar adecuadamente el interior y la retina externa. El seccionamiento de la retina es mejor en la retina con diámetro pequeño como los de los roedores y este diámetro es una limitación de la técnica con el material disponible actual.
Es aconsejable antes de comenzar un experimento biológicamente significativo, para practicar en una muestra de la retina. Se ilustra el método por los resultados representativos obtenidos a partir de células fotorreceptoras cultivadas, utilizando el material para estudiar la expresión de ambos ARNm y proteínas de realizar. Los estudios de expresión también se puede realizar alternativamente en seccións obtuvieron por captura láser microdissection, pero los cultivos se realizan mejor usando vibratome seccionamiento. Podríamos haber utilizado la técnica de láser microdisección con una estrategia completamente diferente. Pero, para recoger la capa de fotorreceptores con el aparato de microdisección por la cultura, sería necesario evitar fijador y esto complicaría la actual metodología de manera significativa.
Estamos desarrollando un protocolo destinado a estudiar la cinética de la expresión génica y proteica en vibratome secciones durante la degeneración de fotorreceptores en modelos de retinosis pigmentaria. Creemos que la descripción detallada del protocolo será de utilidad para los investigadores en el campo de la biología de la retina, y muy especialmente para los estudios de proteómica y metabolómica.
The authors have nothing to disclose.
Igal Gery and David Hicks for anti-SAG antibodies. Ram Fridlich for reading the manuscript.
Name of Material / Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Cytidine 5′-diphosphocholin* | Sigma-Aldrich | C0256 | 4.7 µM Cytidine 5′-diphosphocholin |
Cytidine 5′-diphosphoethanolamine* | Sigma-Aldrich | C0456 | 2.7 µM Cytidine 5′-diphosphoethanolamine |
Linoleïc acid/ bovine serum albumin (BSA)* | Sigma-Aldrich | L8384 | 100 µg/ml linoleïc acid/ bovine serum albumin (BSA) |
Triiodo-L-thyronine* | Sigma-Aldrich | T6397 | 0.03 µM Triiodo-L-thyronine |
96-wells plate | Greiner bio-one | 655-095 | |
Binocular microscope | Leica | MZ-75 | |
CO2 independent (CO2-i) | Life Technologies | 18045054 | |
DMEM | Life Technologies | 41966029 | |
Forceps n°5 Dumont | Bionic | 11254-20 | |
Gelatin from porcin skin type A | Sigma-Aldrich | G2500 | |
GeneChip | Affymetrix | U74v2 | |
Gentamicin solution | Life Technologies | 15710049 | |
Hydrocortison* | Sigma-Aldrich | H0888 | 0.55 µM hydrocortison |
Insulin* (I) | Sigma-Aldrich | I1884 (ITS) | 0.86 µM insulin (I) |
Papain | Worthington-biochem | WOLS03124 | |
Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P-6407 | |
Progesterone* | Sigma-Aldrich | P7556 | 2.0 µM progesterone |
Prostaglandin* | Sigma-Aldrich | P5172 | 0.28 µM prostaglandin |
Putrescine* | Sigma-Aldrich | P5780 | 182 µM putrescine |
Scalpel Albion | EMS | 72000 | |
Scissor | Moria | 15396-00 | |
Sodium Pyruvate* | Sigma-Aldrich | S8636 | 1 mM sodium pyruvate |
Sodium Selenite* (S) | Sigma-Aldrich | I1884 (ITS) | 0.29 µM Na2SeO3 (S) |
Taurine* | Sigma-Aldrich | T8691 | 3 mM taurine |
Transferrin* (T) | Sigma-Aldrich | I1884 (ITS) | 0.07 µM transferrin (T) |
Vibratome apparatus | Leica | VT1000-S | |
* Supplements |