Neurala näthinnan av en mus i åldern 8 dagar är på toppen av en 4% gelatinblocket. Efter isolering av ljusmätare lagret (200 nm) genom vibratome är de fotoreceptorer seedade efter mekanisk och enzymatisk dissociation för kultur. Den fotoreceptorskiktet kan användas för molekylära, biokemiska analyser eller transplantation.
Näthinnan är en del av det centrala nervsystemet som har organiserat arkitektur, med nervceller i skikt från fotoreceptorer, både stavar och koner i kontakt med näthinnans pigmente epitel i den mest avlägsna delen på näthinnan väger riktning av ljus, och ganglieceller i den mest proximala avstånd. Denna arkitektur möjliggör isolering av fotoreceptorskiktet av vibratome sektione. Den dissekerade neurala näthinnan av en mus i åldern 8 dagar är platt-inbäddade i 4% gelatin ovanpå en skiva av 20% gelatin ljusmätare skikt nedåt. Med användning av en vibratom och ett dubbelt edged rakblad är 100 | im tjockt inner näthinnan sektionerad. Det här avsnittet innehåller ganglieceller och det inre lagret med framför allt de bipolära cellerna. En förmedlare sektion av 15 ^ m är kasseras innan 200 | im hos den yttre näthinnan innehållande fotoreceptorema utvinnes. Gelatinet avlägsnas genom upphettning vid 37 ° C. Bitar av det yttre skiktet är incubated i 500 pl av Ringers lösning med två enheter av aktiverat papain under 20 min vid 37 ° C. Reaktionen stoppas genom tillsats av 500 | il 10% fetalt kalvserum (FCS) i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM), är då 25 enheter av DNas I tillsatt före centrifugering vid RT, tvättades flera gånger för att avlägsna serum och cellerna återsuspenderas i 500 | il av DMEM och såddes vid 1 x 10 5 celler / cm 2. Cellerna odlas till 5 dagar in vitro och deras livskraft värderade med hjälp av levande / döda analys. Renheten av kulturen bestäms först genom mikroskopisk observation under experimentet. Renheten sedan valideras genom sådd och fixering celler på en histologisk bild och analysera med hjälp av en kanin polyklonala anti-SAG, en ljusmätare markör och mus monoklonal anti-RHO, en stång ljusmätare specifik markör. Alternativt kan fotoreceptorskiktet (97% stavar) användas för gen- eller proteinuttrycksanalys och för transplantation.
Näthinnan är en integrerad del av det centrala nervsystemet som har en bevarad arkitektur bland ryggradsdjur. Nervceller av neurala näthinnan är organiserade i skikt, med de mest avlägsna för det infallande ljuset, fotoreceptorskiktet i nära kontakt med det retinala pigmenterade epitel (RPE) i bakre delen av ögat. Rod och kon photorecptors är ljuskänsliga celler som är beroende av opsin känsliga molekyler för foton capture. Dessa molekyler är inneslutna på skivmembran hos en cellulär struktur, som ligger på den yttre segment av fotoreceptor som pekar i den riktning i RPE 1. Denna struktur, som oftast drabbas mycket tidigt i fall av fotoreceptor degeneration, förnyas i en takt av 10% varje dag. Den så kallade inre skiktet innehåller de flesta av de andra nervceller som beräknar den mottagna signalen från de fotoreceptorer, den bipolära, amakrina och horisontella celler såväl som de ganglieceller. Dessa senare med sina axonerbildar en stråle som är synnerven. Denna skiktning är så bevarad att biologerna har använt termen förskjuts amakrina celler när cellerna finns utanför den inre plexiform lagret 2. Lager av nervceller är fördelade inom en armatur för radiell Müller gliaceller. Bipolära celler länka fotoreceptorer till ganglieceller. De är belägna mellan det yttre plexiformskiktet och innerplexiformskiktet. De ganglieceller bilda den inre plexiform skiktet i samband med de bipolära cellerna. De amacrin cellerna namnges som föreningens celler belägna i det inre plexiform lagret mellan bipolära celler och ganglieceller. Det yttre plexiformskiktet innehåller horisontella celler. Denna unika arrangemang av neuronala lager av det centrala nervsystemet tillåter isolering av fotoreceptorskiktet från den inre cellskiktet genom skärning flatmonterade näthinnan med hjälp av en vibratome.
Ursprungligen var denna teknik för att isolera fotoreceptorer för transplantation i ögat av RD1 mus, en modell av mänsklig retinitis pigmentosa (RP) 3. Den RD1 musen bär en recessiv mutation i Pde6b genen som kodar för stav specifikt fosfodiesteras betasubenhet. Recessiva mutationer av denna gen resultatet i RP hos människor 4. Efter spö fotoreceptorer har urartat, förlorar patienten mörkerseende, och förvånansvärt kon fotoreceptorer, som inte uttrycker den muterade genen, urartar i ett andra steg. Eftersom konerna krävs för färgseende och synskärpa, patienterna blir successivt blinda och en effektiv behandling för sjukdomen har ännu inte utvecklats. Genom ympning fotoreceptorskiktet från en vild typ mus konen degeneration av värd musen fördröjs 3,5. Stavarna förlorade i stav kon degenerativ modellen kunde inte ersättas av en transplantation eftersom det synaptiska förbindelsen mellan stavar och bipolära celler endast kan erhållas i ett visst skede av retinal utveckling, präglad av uppkomsten av Nrl uttryck 6. Skiktet av fotoreceptorer införes genom kirurgi i sub-retinala utrymmet hos den stav mindre RD1 näthinnan, mellan RPE och den yttre näthinnan motsvarar endast 3% av de återstående fotoreceptorer, konerna. Två veckor efter operationen, 40% av konerna från djuret transplanteras med en normal ljusmätare skikt levde jämfört med djuret transplanteras med ett normalt lager av inre retinala celler, eller till skenopererade djur. Topografin av kon överlevnad, sprids ut över hela ytan av den muterade näthinnan belägen vid läget för den transplanterade vävnaden indikerar att den skyddande effekten beror på ett diffunderbart molekyl 7.
Därefter använde vi en samodlingssystemet liksom konditionerade odlingsmedier för att validera det faktum att den skyddande effekten är beroende av sekretionen av ett protein av stänger 8,9. Vår hypotes är att detta protein kommer att ExprEssed kontinuerligt och specifikt av stavar och att deras död under den första fasen av sjukdomen kommer att utlösa sekundära kon degeneration av förlusten av en skyddande signal från stavar i en icke-cell självständigt 10. På grund av betydelsen av konen medierad centrala seendet hos primater denna förmodade protein kommer att bli en mycket relevant terapeutiskt verktyg för RP. Bevara konerna i RP skulle teoretiskt förhindra totalt 1,5 miljoner patienter världen över för att bli blinda 11. Vi har använt en hög halt screening eller kon berikad kulturmodell för att identifiera ett cDNA som kodar Rod-härledda Cone Viability Factor (RdCVF) från en retinal-cDNA-bibliotek 12. RdCVF är skarvade produkten av NXNL1 gen som är intressant homolog den gen som kodar för thioredoxin proteiner involverade i redox homeostas 13. Den andra splitsade produkten av genen, är RdCVFL ett enzym som skyddar sitt mål, den TAU-protein mot oxidativ dAmage 14. Administration av RdCVF förhindrar sekundär degeneration av kottar och förlusten av deras visuella funktion i ett recessivt och dominant modell av RP 12,15. Detta visar två viktiga aspekter av denna innovativa behandlingsstrategi 16. För det första kan det tillämpas på de flesta av de RP fallen i en gen-oberoende sätt. För det andra, är i strid med konkurrerande faktor CNTF, RdCVF överlevnad i samband med underhåll av synfunktionen 17. Frånvaron av funktionell effekt kan förklara orsaken till frånvaron av kliniska nyttan av administrationen av CNTF till RP patienter 18. RdCVF är mest sannolikt en av de viktiga överlevnadssignalen mellan stavar och koner eftersom kon räddning in vitro hämmas av RdCVF immunotömning 12. Dessutom avbrottet i stavhärledda kon livskraft genen leder till fotoreceptor dysfunktion och mottaglighet för oxidativ stress 19.
Användningen avljusmätare lagret är till grund för identifieringen av RdCVF och av en ny redox signal inblandad i neurodegenerativa sjukdomar 20. Detta manuskript beskriver det protokoll som används för att isolera och odla celler från fotoreceptorskiktet att karakterisera aktiviteten hos RdCVF. De fotoreceptorer kan bibehållas i odling under 5 till 7 dagar 21. Denna teknik kan också användas för att studera uttrycket av fotoreceptor specifika gener.
Näthinnan är en modell orgel i biologi. Studie av näthinnan ledde till 6 stora upptäckter inom biologin. Det är ursprunget till den första tumörsuppressorgenen RB1. Det avslöjar molekylärt samband mellan receptortyrosinkinaser och MAP-kinaser genom samverkan med Son sevenless. Det var inblandad i upptäckten av Pax6, den första huvudstyr genen för organ morfogenes. Det är i centrum av den genetiska sammanslutning av komplementfaktor H (CFH) med åldersrelaterad makuladegeneration (AMD), den första sjukdomssårbarhetsgenen identifieras av genomet bred sammanslutning skärm (GWAS). Slutligen ledde det till den första framgångsrika genterapi för Leber kongenitala amauros, den första korrigerande genterapi rättegång i människa av någon ärftlig sjukdom. Strukturen för detta organ är konserverad i de flesta ryggradsdjur. Dess tillgänglighet för manipulation in vivo har uppmuntrat tidigt funktionell genomik utredningar på denna del av centRAL nervsystemet.
Vi visar här hur man skall separera det fotoreceptorskiktet från det inre skiktet av retina genom vibratome snittning. Detta steg är avgörande för att få rena fotoreceptor kulturer. Vår dissektion protokoll gör angreppen av RPE-celler mycket osannolikt.
En av de stora utmaningarna är tillplattning av näthinnan som är nödvändig för att sektionen ordentligt den inre och den yttre näthinnan. Den sektione av näthinnan är bäst på näthinnan med liten diameter som de från gnagare och denna diameter är en begränsning av tekniken med nuvarande tillgängliga material.
Det är tillrådligt innan ett biologiskt menings experiment för att öva på ett urval av näthinnan. Vi illustrerar metoden genom representativa resultat som erhållits från odlade ljusmätare celler, med hjälp av material för att utföra uttryck studie av både mRNA och proteiner. Expressionsstudier kan också utföras alternativt på avsnns erhållits genom laser capture microdissection, men kulturerna bäst utförs med hjälp vibratome sektione. Vi kunde ha använt tekniken med microdissection laser med en helt annan strategi. Men, för att samla in ljusmätare lagret med microdissection apparater för kultur, skulle det vara nödvändigt att undvika fixativ och detta skulle komplicera den nuvarande metoden avsevärt.
Vi utvecklar ett protokoll som syftar till att studera kinetiken för gen- och proteinuttryck i vibratome sektioner under degeneration av fotoreceptorer i modeller av retinitis pigmentosa. Vi tror att den detaljerade beskrivningen av protokollet kommer att vara till nytta för forskare inom området av retinal biologi, och i synnerhet för proteomik och metabolomic studier.
The authors have nothing to disclose.
Igal Gery and David Hicks for anti-SAG antibodies. Ram Fridlich for reading the manuscript.
Name of Material / Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Cytidine 5′-diphosphocholin* | Sigma-Aldrich | C0256 | 4.7 µM Cytidine 5′-diphosphocholin |
Cytidine 5′-diphosphoethanolamine* | Sigma-Aldrich | C0456 | 2.7 µM Cytidine 5′-diphosphoethanolamine |
Linoleïc acid/ bovine serum albumin (BSA)* | Sigma-Aldrich | L8384 | 100 µg/ml linoleïc acid/ bovine serum albumin (BSA) |
Triiodo-L-thyronine* | Sigma-Aldrich | T6397 | 0.03 µM Triiodo-L-thyronine |
96-wells plate | Greiner bio-one | 655-095 | |
Binocular microscope | Leica | MZ-75 | |
CO2 independent (CO2-i) | Life Technologies | 18045054 | |
DMEM | Life Technologies | 41966029 | |
Forceps n°5 Dumont | Bionic | 11254-20 | |
Gelatin from porcin skin type A | Sigma-Aldrich | G2500 | |
GeneChip | Affymetrix | U74v2 | |
Gentamicin solution | Life Technologies | 15710049 | |
Hydrocortison* | Sigma-Aldrich | H0888 | 0.55 µM hydrocortison |
Insulin* (I) | Sigma-Aldrich | I1884 (ITS) | 0.86 µM insulin (I) |
Papain | Worthington-biochem | WOLS03124 | |
Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P-6407 | |
Progesterone* | Sigma-Aldrich | P7556 | 2.0 µM progesterone |
Prostaglandin* | Sigma-Aldrich | P5172 | 0.28 µM prostaglandin |
Putrescine* | Sigma-Aldrich | P5780 | 182 µM putrescine |
Scalpel Albion | EMS | 72000 | |
Scissor | Moria | 15396-00 | |
Sodium Pyruvate* | Sigma-Aldrich | S8636 | 1 mM sodium pyruvate |
Sodium Selenite* (S) | Sigma-Aldrich | I1884 (ITS) | 0.29 µM Na2SeO3 (S) |
Taurine* | Sigma-Aldrich | T8691 | 3 mM taurine |
Transferrin* (T) | Sigma-Aldrich | I1884 (ITS) | 0.07 µM transferrin (T) |
Vibratome apparatus | Leica | VT1000-S | |
* Supplements |