Emboli Middle Cerebral artärocklusion (kortex) för ischemisk stroke med Homologa Blodproppar i råttor

Abstract

Kliniskt, trombolysbehandling med användning av rekombinant vävnadsplasminogenaktivator (tPA) är fortfarande den mest effektiva behandlingen för akut ischemisk stroke. Emellertid är användningen av tPA begränsad genom dess smala terapeutiska fönster och genom ökad risk för hemorragisk omvandling. Det finns ett akut behov av att utveckla lämpliga strokemodeller för att studera nya trombolytiska medel och strategier för behandling av ischemisk stroke. För närvarande har två huvudsakliga typer av ischemisk stroke modeller utvecklats i råttor och möss: intraluminal sutur kortex och emboli kortex. Även kortex modeller via intraluminal sutur tekniken har använts i stor utsträckning mekanism driven slag forskning, dessa sutur modellerna inte efterlikna den kliniska situationen och är inte lämpliga för trombolytiska studier. Bland dessa modeller, den emboli kortex modellen efterliknar nära mänskliga ischemisk stroke och är lämplig för preklinisk undersökning av trombolytisk behandling. Denna emboli modellen utvecklades först hos råttor med Overgaard et al. ¹ år 1992 och kännetecknas vidare av Zhang et al. 1997 ^2. Även embolisk kortex har fått allt större uppmärksamhet, det finns tekniska problem med många laboratorier står inför. För att möta ökade behov av trombolytisk forskning, presenterar vi en mycket reproducerbar modell för embolisk kortex i råtta, vilket kan utveckla en förutsägbar infarktvolymen inom MCA territorium. I korthet är en modifierad PE-50 slang försiktigt avancerat från den externa karotisartären (ECA) i lumen i den inre halsartären (ICA) tills kateterns spets når ursprunget för MCA. Genom katetern är en homolog blodpropp placerad i origo av MCA. För att identifiera framgång MCA ocklusion, var regionalt cerebralt blodflöde övervakas ades neurologiska underskott och infarktvolymen mätas. De tekniker som presenteras i detta dokument bör hjälpa utredarna att övervinna tekniska problem för upprättande denna modell för strokeforskning. </ P>

Introduction

Stroke är den tredje vanligaste dödsorsaken i USA, men behandlingsalternativ för akut stroke förblir begränsade. För närvarande är intravenös infusion av rekombinant vävnadsplasminogenaktivator (tPA) för att lösa upp blodproppar den mest effektiva behandlingen för akut ischemisk stroke. Emellertid är användningen av tPA begränsad genom dess smala terapeutiska fönster och genom ökad risk för intracerebral blödning. Därför behövs omgående en modell av stroke lämplig för trombolytisk forskning.

Den mellersta cerebral artär (MCA) är artären oftast täckas stroke hos människor. Fokuserade på denna artär har många djurmodeller av ischemisk stroke fastställts. För närvarande har två huvudsakliga typer av gnagare fokal ischemi modeller genom blockering av MCA utvecklats: sutur kortex modell och emboli kortex modell. Även kortex modeller via intraluminal sutur tekniken har använts i stor utsträckning mekanism driven slag forskning, dessa sutur modeller intehärma mänskligt stroke, som upp till 80% av humana stroke orsakas av trombos eller emboli. Men embolisk stroke modell med blodproppar efterliknar nära mänsklig stroke och anses lämpliga för trombolytisk studie. Denna emboli modellen utvecklades först hos råttor från Overgaard et al. ¹ år 1992 och kännetecknas vidare av Zhang et al. 1997 ² och Dinapoli et al. 2006 ^3. Även embolisk kortex har fått allt större uppmärksamhet, det finns tekniska problemen av många laboratorier.

I den här artikeln visar vi en standardmetod för att framställa embolisk kortex med homologa blodproppar i vuxen råtta, som kan utveckla ett förutsägbart infarkt inom MCA territorium. De tekniker som presenteras i denna artikel bör hjälpa utredarna att lösa tekniska problem för upprättande av denna modell för strokeforskning.

Protocol

Etik Uttalande: Manliga vuxna Sprague-Dawley (vägande 330-380 g) användes i detta protokoll. Detta protokoll godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid LSU Health Science Center-Shreveport och är i överensstämmelse med "Guide för skötsel och användning av försöksdjur" (åttonde upplagan, National Academy of Sciences, 2011 ).

1 Beredning av modifierad PE-50 Tube

1. Håll en 30 cm lång PE-50 röret ovanför en gas brand med händerna, gradvis mjuka upp röret. Sträcka försiktigt röret.
2. Välj en punkt på det sträckta röret med användning av ett digitalt skjutmått (Figur 1), markera det, och skär den modifierade PE-50 rör i ett 25 cm långt segment med en 1 cm lång spets (ytterdiameter: 0,30 till 0,34 mm).

2 Beredning av homologa blodproppar

1. Söva råttan med isofluran (5% för induktion, 2-3% för underhåll) i 70% _N2O och 30% O <sub> 2 med en ansiktsmask före samlingen blod. Bekräfta anestesi med en tå nypa.
2. Utför lårbensartärkanyle av en donator råtta med publicerade metod ⁴ och överföra lårbensartären blod direkt i en 20 cm lång PE-50 rör. Placera röret under 2 h vid rumstemperatur för att koagulera blod, och sedan hålla kvar röret i 22 h vid 4 ° C. Obs: Kanyle utförs med hjälp av aseptisk teknik enligt beskrivningen i steg 3.1. Givaren Råttan återvinnas för ytterligare provtagning.
3. Skär PE-50 röret i 50 mm segment och spola ut proppen ur röret i en steril petriskål med vanlig saltlösning.
4. Överför 50 mm lång propp i en 60 mm lång PE-10 rör och ansluta varje ände av PE-10 rör till en 20 cm lång PE-50 slang kopplad till 1 ml spruta med normal saltlösning med 23 G nål (figur 2) .
5. Flytta koagel genom kontinuerlig alternerande rörelse från en spruta till den andra i 5 min, vilket kan ta bort blodceller frånproppen och minimera den sköra av extravaskulär koagulerat koagel, utan att störa fibrin kärnan.
6. Skär koagel i en 40 mm långt segment och för över koagel segmentet i en modifierad PE-50 kateter som beskrivs i steg 1,2 under aseptiska förhållanden. OBS: Alla PE slang steriliseras med etylenoxid.

3. embolisk Middle Cerebral artärocklusion (figur 3A, B)

1. Sterilisera alla kirurgiska verktyg genom autoklavering (minst 121 ° C, 15 PSI, 15 min). Sanera operation bordet och tillhörande kirurgisk utrustning med hjälp av 70% etanol.
2. Söva råttan med isofluran som beskrivs i steg 2.1. Testa anestesidjupet genom att utföra en tå nypa på båda bakre fötterna, och alla observerade rörelser (dra tassen) tyder på att djuret inte är tillräckligt sövd för att göra operationen. Applicera en liten mängd veterinär salva på båda ögonen för att förhindra torrhet under narkos. Raka pälsen på den ventrala hals och huvud reregioner med elektriska Clippers att exponera områdena hud.
3. Placera råttan i ryggläge på en värmedyna. Sätt i en rektal sond, kontroll och upprätthålla kroppstemperaturen mellan 36,5 till 37,5 ° C med användning av en homeothermic filt styrenhet.
4. Desinficera rakade huden och omgivande päls med 10% povidon-jod, följt av 70% etanol.
5. Lägg till en 2-cm-lång mittlinjeincision på halsen under ett dissektionsmikroskop. Använd upprullningsdon att exponera det kirurgiska området och dissekera den högra gemensamma halspulsådern (CCA), yttre halspulsådern (ECA), inre halsartären (ICA), och pterygopalatine artär (PPA) fri från omgivande nerver och fascia (Figur 3A). Obs: Innan operation, ändra sterila handskar om ingen assistent hjälper till att förbereda djuret.
6. Dissekera CCA fritt från omgivande nerver (utan att skada vagusnerven) och placera en steril 5-0 silkesutur i artären. Knyt en ögla (# 1) och ta tag i suturen med en liten Hemostat och pull visas mot kroppen.
7. Dissekera revisionsrätten och dess två grenar, nack artären (OA) och den överlägsna sköldkörtel artär (STA). Koagulera två grenar med hjälp av en veterinär elektrokirurgiska enheten. Placera två bitar av sterila 6-0 silkessuturer under ECA.
8. Separera de två sidentyger som hänförts artären, ett stycke mot huvudet (distala änden) och den andra mot kroppen. Knyt en tät ligatur (# 2) på den sida som är närmast huvudet, ta tag i siden med små peanger och dra visas mot huvudet. Förbered en lös knut (# 3) med den andra silkes att använda senare.
9. Dissekera ICA och PPA från omgivande nerver (utan att skada vagusnerven). Knyt PPA med en 6-0 sutur (# 4). Gör en ögla med 6-0 sutur kring ICA (nr 5). Alternativt klipp ICA med hjälp av en mikrovaskulär klipp.
10. Skär ett litet hål (halv thru) i ECA mellan den snäva (# 2) och lös (# 3) ligaturer med Vannas stil våren sax. Sätt den modifierade PE-50 tube innehåller blodpropp i snittet och gå vidare till bifurkation av CCA. Dra den lösa ligatur (# 3) runt lumen bara tillräckligt för att säkra bevara rörlighet, kvarliggande rör.
11. Skär av revisionsrätten på platsen för små hål för att befria stubbe och placera stubben nedanför bifurkationen av revisionsrätten och ICA; detta gör att den modifierade röret lätt glida in i ICA. Öppna ICA och försiktigt flytta röret från lumen av ECA i ICA tills spetsen av katetern når ursprung MCA (~ 17 mm från bifurkationen). Observera: Innan in spetsen av röret i ECA, steril den yttre ytan av röret med 70% etanol, och tvätta sedan med steril fysiologisk koksaltlösning.
12. Injicera koagel genom den modifierade PE-50 kateter tillsammans med 10 pl saltlösning över 10 sek med hjälp av en 100 ^ Hamilton sprutan (figur 3B).
13. Dra ut katetern från ECA 5 min senare. Knyt ECA och öppna CCA. Sutur snittet på halsen.

4 Övervakning Regional Cerebral Blood Flow (rCBF)

1. Före MCA ocklusion, gör en 1,2 cm lång mittlinjen snitt i hårbotten för att exponera benet. Ta vävnaderna på skallbenet med en tandskrapa och sterila bomullsswappar. Obs: Innan operation, är den exponerade hårbotten området och omgivande päls desinficeras med 10% povidon-jod, följt av 70% etanol.
2. Borra ett 1,5 mm burr diameter hålet på 2 mm posteriort och 5 mm i sidled till bregma med hjälp av en 0,7 mm sfärisk rostfritt burr stål (Figur 4).
   OBS: Håll dura intakt.
3. Placera sonden 0.5 mm över dura ytan. Övervaka rCBF vid 0 (baseline), 5, 15, 30, 60, 90 och 120 min efter embolisering och fortsätta vid 5, 15, 30, 45 och 60 minuter efter intravenös administrering av tPA. Efter sista mätningen av rCBF, är hårbotten snitt stängs med sutur. Obs: Innan hals snitt mäter vi rCBF som baslinje före MCA occlusion. Post MCA ocklusion mäter vi rCBF efter sutur stängning av halsen snitt. Således är hals snittet hålls sterila.

5. Postoperativ vård

1. Injicera 2,5 ml koksaltlösning subkutant för att förhindra uttorkning och injicera Buprenex (0,05 mg / kg, SC) omedelbart efter operationen och varje 6-12 timmar som behövs för smärtlindring.
2. Sluta isoflurananestesi. Placera råttan i ett 37 ° C veterinäråtervinningskammaren (hålla djuret varmt) och hålla observation. Det tar vanligtvis 10 min för råttan att återhämta sig från anestesi. Sedan satte djuret i en steriliserad bur, placera en del fuktade mat i en petriskål i buren, och återgå buren djursteriliseringsrummet.
3. 24 h efter stroke, euthanize råttan med en överdos av natriumpentobarbital (100 mg / kg kroppsvikt, IP).

6. Neurologisk Deficit Score

1. Utför Bederson poäng före och vid 2 h efter embolisering. Använd en betygs scale av 0-3 som tidigare beskrivits ^5: 0, höja råtta genom svansen, det djur som sträcker sig både framben till golvet och uppvisar inga andra underskott (normal rörelse); 1, höja råttan med svansen, böj den kontra forelimb; 2, minskad motståndskraft mot laterala tryck (och forelimb flexion) utan kretsande; 3, samma beteende som klass 2 med cirklar.
   OBS: Råttor som visar Bederson poäng = 0 (ingen underskott) vid 2 h efter embolisering utesluts från vidare studier.

Representative Results

Laser Doppler flowmetry (LDF) användes för att övervaka rCBF under induktion av cerebral ischemi ^6,7. Många laboratorier inklusive vårt laboratorium har använt rCBF att identifiera djur med framgångsrika MCA ocklusion, men trösklarna för baslinjen varierade mellan laboratorier som är relaterade till platsen för mätningen. Sonden enligt LDF är positionerad vid 2 mm posteriort och 5 mm lateralt till bregma som beskrivits tidigare ^6. rCBF övervakades vid 0, 5, 15, 30, 60, 90 och 120 min efter injektion av koaglet. På grundval av dessa uppgifter, endast djur som uppvisar en minskning av rCBF> 70% av utgångsvärdet anses lyckat embolisk ocklusion av MCA (Figur 5). Vid 2 h efter injektion av koagel ades en standardrått dos av tPA (l-10 mg / kg) ^7,8 administreras intravenöst med en 10% bolus och 90% kontinuerlig infusion under 30 min med användning av en sprutinfusionspump ^7,8. Vi observerade att rCBF nivåerna gradvis increased att> 70% av baslinjen inom 30 min av tPA behandling (Figur 5).

Vid 24 h efter embolisering ades djuren avlivades och transkardiellt perfusion med 200 ml PBS för att avlägsna intravaskulära blod. Tidigare studier ^2,3,7,8 och våra data (Figur 6) har visat betydligt större vävnadsinfarkter som produceras vid 24 h efter embolisering. Hjärnorna samlades in och tagit bilder. I koksaltbehandlade gruppen, var blodproppen lätt visualiseras i origo av MCA och ACA, men proppen var nästan helt upplöst i tPA-behandlade gruppen (figur 6A). Efter det var hjärnan skivas i sju 2 mm koronala sektioner med en råtthjärna matris på is. Inkubera hjärnan skivor i 2% 2,3,5-trifenyltetrazoliumklorid (TTC) vid 37 ° C i 30 min ^9,10. Efter TTC färgning ades de koronala sektioner ut på en platta och fotograferades (Figur 6B). Området inf arction i varje skiva bestämdes genom datoriserad bildanalys systemet (National Institutes of Health Image), och den genomsnittliga infarktvolymen beräknades genom multiplikation av avståndet mellan sektionerna. Denna embolisk stroke modell producerad vävnadsinfarkt inom MCA territorium som sett i hjärnbarken och striatum regioner (figur 6B). Tidig reperfusion etablerades genom intravenös administrering av tPA vid 2 h efter embolisering ades infarktvolymer signifikant reducerad i tPA-behandlade gruppen (229,1 ± 45,7 mm ^3, n = 12) jämfört med den saltlösningsbehandlade gruppen (394,2 ± 68,2 mm ^3, n = 9) (P <0,01). Den 24 hr Dödligheten är 16% (4/25).

Figur 1 Mätning av den yttre diametern av den modifierade PE-50 rör med hjälp av ett digitalt skjutmått.

nt "fo: keep-together.within-page =" always ">
Figur 2 Tvätt blodpropp i en PE-10 rör. Den blodpropp tvättades med alternativ att trycka de två sprutorna är anslutna till änden av PE-50 rör.

Figur 3 (A) Förenklad ordning för råtta högra hjärnhalvan isolerade artärer som visar successiva suturer för att förbereda införandet av modifierad PE-50 rör. (B) Scheme av arteriell arkitektur i råtthjärna, och katetern avancerade från revisionsrätten till ICA hos råttan. En enda blodkoagel (svart) var inrymd i röret.

Figur 4. burr hål (1,5 mm diameter) som lokaliseras på 2 mm posteriort och 5 mm i sidled till bregma.

Figur 5 Regionalt cerebralt blodflöde (rCBF) mättes med hjälp av en laser Doppler flödesmätare (LDF). Proppen injektion ledde till> 70% rCBF reduktion av utgångsvärdet. tPA (10 mg / kg) behandlades vid 2 h efter koaglet injektion restaurerade rCBF nära baslinjen efter 30 min av tPA-behandlingen. Data uttrycktes som medelvärde ± SD.

Figur 6 (A) Representativa bilder som visar blodproppar (svarta pilar) i ursprunget till den mellersta hjärnartären (MCA) och främre cerebral artär (ACA) vid 24 timmar efter stroke. Vänster, koksaltbehandlade råtta; Höger, tPA-behandlade råtta, bar = 5 mm.

Discussion

I denna studie visade vi en standardmetod för att utföra en embolisk kortex stroke modell i råtta, där ursprunget till MCA är tilltäppt av en fibrin rika koagel. Den stora fördelen med denna modell är: ocklusion av stammen av MCA med fibrin rikt blodpropp liknar tromboembolisk stroke hos människor, är embolisk stroke modell lämplig för att utföra preklinisk undersökning av fibrinolytisk terapi, och att denna modell kan utvecklas en reproducerbar och förutsägbar infarktvolymen inom det territorium som tillhandahålls av MCA.

För att utföra den emboliska MCAO modellen koaglet introduktion, stabilitet och ingivande är svåra att hantera, vilket leder till variationer i infarktstorlek och drabbade hjärnregioner ^2,3. Tidigare studier visade att reproducerbara ischemiska lesioner i MCA territorium endast kan uppnås när som hindrar blodproppar lämnades in i stammen av MCA ^2,3. För att exakt lämna blodproppen ochproducera en reproducerbar embolisk stroke modell, i denna studie, visar vi hur man förbereder en modifierad PE-50 rör och hur man introducerar spetsen på den modifierade röret till ursprunget för MCA och hur man injicerar ett fibrin rika koagel i MCA. I överensstämmelse med den föregående rapporten ^2, var den injicerade blodpropp lätt visualiseras i origo av MCA i alla koksaltbehandlade råttor (n = 9), men till stor del löst i alla tPA-behandlade råttor (n = 12) vid 24 h efter embolisering.

För att utvärdera framgång kortex, var det rCBF, neurologiska bortfall, och mönstret och distribution av cerebrala lesioner bedömas. Efter koagel injektionen var rCBF minskade till 30% av utgångsvärdet och denna minskning av rCBF kvarstod i minst 2 timmar efter embolisering, i linje med tidigare rapporter ^6,7. Efter behandling med tPA vid 2 h efter embolisering, var nivåerna av rCBF restaurerade nära baslinjen efter 30 min av tPA-behandlingen. Neurologisk poäng mättes 10 mininnan läkemedelsbehandling med hjälp av modifierade Bederson poäng för att utvärdera framgång kortex. Detta neurologisk scoring är ett enkelt och snabbt sätt att upptäcka världen neurologisk funktion vid akuta fasen av stroke. Djur som uppvisar normala beteenden (score = 0) uteslöts från missbruksbehandling och vidare analys. Dessutom visade vi att vävnadsskada producerades mestadels inom MCA territorium som sett i hjärnbarken och striatum regioner, och tPA behandling (vid 2 tim) minskade signifikant infarktstorleken vid 24 timmar efter stroke. Tillsammans våra data visade att embolisk stroke modell som presenteras i detta arbete kan utveckla en förutsägbar infarktvolymen inom MCA territorium.

Slutligen noterar vi att det finns flera tekniska problem som kan påverka framgången för emboli kortex modellen. Ett vanligt problem i att utföra embolisk kortex modell är tidig spontan reperfusion efter embolisering. Den förekomst av spontan reperfusion is sannolikt att förknippas med den bräckliga av extravaskulära koagulerade koagel och längden av koagel används för att ockludera MCA ^2,3,10. Vi anser att den metod vi beskrivit (steg 2) för att förbereda blodpropp skulle minimera den sköra av extravaskulär koagulerat koagulera. Längden på enstaka blodpropp som används för att täppa MCA varierade från labb till labb mellan 25-mm till 50 mm längd ^2,3,6-8,10. Vi fann att användningen av en 35-40 mm lång koagulera idealt tilltäppt MCA och producerade mycket reproducerbar infarktvolymen. Modifiera PE-50 rör med spetsen diameter mellan 0,30-0,34 mm. Om spetsdiametern är> 0,34 mm, kan den inte nå ursprung MCA. Om spetsdiameter är <0,30 mm är koagel inuti den modifierade PE-50 slang svårt att gå genom spetsen. Dödligheten är nära relaterad till svår hjärnsvullnad och intracerebral blödning. I detta arbete är 24 hr dödligheten 16% (4/25, se representativa resultat), och alla döda råttor visade allvarlig hjärn svällaing även om vi inte ser intracerebral blödning (möjligen på grund av begränsade urvalet). En kontrollerbar dödlighet faktor är kroppstemperatur under operationen. Vid reglering av kroppstemperatur mellan 36,5 till 37,5 ° C från början av operation tills fullständig återhämtning från anestesi. Kroppstemperaturen inverkar väsentligt på omfattningen av hjärnvävnadsskada. Hypotermi minskar och hypertermi ökar infarktvolymen ^11,12. Utföra operationen på kort tid (ca 20-25 min) enligt protokollet för att producera mycket reproducerbar infarktstorlek. Infektionskomplikationer är en ledande dödsorsaken hos patienter med akut stroke ^13. För att minska förekomsten av infektiösa komplikationer och förbättra överlevnaden efter stroke bör aseptisk teknik skall användas under operation.

Sammanfattningsvis: de tekniker som presenteras i denna artikel bör hjälpa utredarna att lösa tekniska problem för upprättande thär modell för stroke forskning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
rh-tPA	Chemical	Genentech
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride	Chemical	Sigma	T8877
Anesthesia vaporizer	Equipment	Soma Technology	Drager Vapor 19.1
Rechargeable high speed micro drill	Equipment	Fine Science Tools	18000-17
Curved scissors	Equipment	Fine Science Tools	14117-14
Dumont forceps (Medical #7)	Equipment	Fine Science Tools	11270-20
Dumont forceps (Medical #5)	Equipment	Fine Science Tools	11251-35
Vannas-style spring scissors	Equipment	Fine Science Tools	15000-03
Veterinary recovery chamber	Equipment	Peco Services	V1200
Genie plus syringe pump	Equipment	Kent Scientific Corporation
Rat brain matrix	Equipment	Kent Scientific Corporation	RBMA-310C
Digital caliper	Equipment	World Precision Instruments	501601
Dissecting microscope	Equipment	World Precision Instruments	PZMTIII-BS-LWD
Hamilton syringe	Equipment	Hamilton	model 710
Homeothermic blanket control unit	Equipment	Harvard Apparatus
Electric clipper	Equipment	Braintree Scientific	CLP-9931
Veterinary electrosurgical unit	Equipment	MACAN Manufacturing Company	MV-9
Blood flowmeter	Equipment	Adinstruments
PowerLab 4/30	Equipment	Adinstruments
LabChart 7.2	software	Adinstruments
1 ml syringe	Consumable	Becton, Dickinson and Company	309659
23 G needle	Consumable	Becton, Dickinson and Company	305143
30 G needle	Consumable	Becton, Dickinson and Company	305106
PE-50 tubing	Consumable	Becton, Dickinson and Company	427517
PE-10 tubing	Consumable	Becton, Dickinson and Company	427400
6-0 Silk suture	Consumable	Harvard apparatus	723287
5-0 Silk suture	Consumable	Harvard Apparatus	517607