Embolic artéria cerebral média Oclusão (MCAO) para Acidente Vascular Cerebral Isquêmico com homólogos Coágulos de sangue em ratos

Abstract

Terapia clínica, com uso de trombolítico ativador do plasminogênio tecidual recombinante (tPA) continua a ser o tratamento mais eficaz para AVC isquêmico agudo. No entanto, o uso de tPA é limitada pela sua estreita janela terapêutica e pelo aumento do risco de transformação hemorrágica. Há uma necessidade urgente de desenvolver modelos tempos adequados para estudar novos agentes e estratégias de trombolíticos para o tratamento de acidente vascular cerebral isquêmico. Actualmente, dois tipos principais de modelos isquémicos tempos têm sido desenvolvidos em ratos e ratinhos: intraluminal MCAO sutura e embólico MCAO. Embora os modelos de MCAO via a técnica de sutura intraluminal, têm sido amplamente utilizados em investigação orientada para o mecanismo de acidente vascular cerebral, estes modelos de sutura não mimetizar a situação clínica e não são adequados para estudos trombolíticos. Entre esses modelos, o modelo OACM embólico imita AVC isquêmico humano e é adequado para a investigação pré-clínica de terapia trombolítica. Este modelo embólico foi desenvolvido pela primeira vez em ratos por Overgaard et al. ¹ em 1992 e caracteriza-se por Zhang et al., em 1997 ^2. Embora embólico OACM ganha cada vez mais atenção, existem problemas técnicos enfrentados por muitos laboratórios. Para atender às necessidades crescentes de pesquisa trombolítica, apresentamos um modelo altamente reprodutível de embólico OACM no rato, que pode desenvolver um volume de infarto previsível dentro do território da ACM. Em resumo, um tubo de PE-50 modificado é avançada suavemente a partir da artéria carótida externa (ECA) para dentro do lúmen da artéria carótida interna (ICA), até que a ponta do cateter atinge a origem da MCA. Através do cateter, um coágulo de sangue homólogo único é colocado na origem da MCA. Para identificar o sucesso de oclusão MCA, o fluxo sanguíneo cerebral regional foi monitorizada, défices neurológicos e os volumes de enfarte foi medida. As técnicas apresentadas neste artigo deve ajudar os pesquisadores a superar problemas técnicos para o estabelecimento deste modelo para a pesquisa derrame. </ P>

Introduction

O AVC é a terceira principal causa de morte nos Estados Unidos, mas as opções de tratamento para o AVC agudo permanecem limitados. No momento, a perfusão intravenosa de ativador do plasminogênio tecidual recombinante (tPA) para dissolver os coágulos de sangue é a terapêutica mais eficaz para AVC isquêmico agudo. No entanto, o uso de tPA é limitada pela sua estreita janela terapêutica e pelo aumento do risco de hemorragia intracerebral. Portanto, um modelo de acidente vascular cerebral adequado para pesquisa trombolítica é urgentemente necessária.

A artéria cerebral média (MCA) é na maioria das vezes a artéria oclusa em acidente vascular cerebral em seres humanos. Focada em esta artéria, muitos modelos animais de acidente vascular cerebral isquêmico foram estabelecidas. Actualmente, dois tipos principais de modelos de isquemia focal de roedores por oclusão da MCA foram desenvolvidos: sutura modelo MCAO e embólico modelo MCAO. Embora os modelos de MCAO via a técnica de sutura intraluminal, têm sido amplamente utilizados em investigação orientada para o mecanismo de acidente vascular cerebral, estes modelos não fazer suturasacidente vascular cerebral humano mímico, como até 80% dos acidentes vasculares cerebrais humanos são causadas por trombose ou embolia. No entanto, o modelo de acidente vascular cerebral embólico usando coágulos sanguíneos imita traço humano e é considerado adequado para o estudo do trombolítico. Este modelo embólico foi desenvolvido pela primeira vez em ratos por Overgaard et al. ¹ em 1992 e caracteriza-se por Zhang et al., Em 1997, ² e por Dinapoli et al., Em 2006, ^3. Embora embólico OACM ganha cada vez mais atenção, há problemas técnicos enfrentados por muitos laboratórios.

Neste artigo, vamos demonstrar um método padrão para a produção de embólico OACM com coágulos de sangue homólogo no rato adulto, que pode desenvolver um infarto do previsível dentro do território da ACM. As técnicas apresentadas neste artigo deve ajudar os pesquisadores a superar problemas técnicos para o estabelecimento deste modelo para a pesquisa derrame.

Protocol

Declaração de Ética: Adulto Masculino ratos Sprague-Dawley (pesando 330-380 g) foram utilizados neste protocolo. Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais Institucional (IACUC) na LSU Health Science Center, Shreveport e está em conformidade com o "Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório '(oitava edição, da Academia Nacional de Ciências, 2011 ).

1 Preparação da modificação do tubo de PE-50

1. Segure um tubo de 30 centímetros de comprimento PE-50 acima de uma lareira a gás por mãos, gradualmente suavizar o tubo. Gentilmente esticar o tubo.
2. Selecione um ponto no tubo alongado utilizando um paquímetro digital (Figura 1), marcá-lo e cortar o tubo PE-50 modificado em um longo segmento de 25 cm com uma ponta longa 1 cm (diâmetro externo: ,30-,34 mm).

2 Preparação de homólogos Coágulos de sangue

1. Anestesiar os ratos com isoflurano (5% para indução, 2-3% para manutenção) em 70% de _N2O e 30% de O <sub> 2 por uma máscara facial antes da coleta de sangue. Confirme anestesia por uma pitada dedo do pé.
2. Realizar a canulação arterial femural de um rato dador com o método publicado em ⁴ e transferir sangue da artéria femoral directamente num 20 cm de comprimento de tubo PE-50. Colocar o tubo durante 2 horas à temperatura ambiente para coagular o sangue, e em seguida reter o tubo durante 22 horas a 4 ° C. Nota: A canulação é realizado utilizando uma técnica asséptica tal como descrito na etapa 3.1. O rato doador é recuperado para posterior amostragem.
3. Cortar o tubo de PE-50 a 50 mm e segmentos de expulsar o coágulo do tubo numa placa de Petri estéril contendo solução salina normal.
4. Transferir os 50 mm de comprimento de coágulo num comprimento de 60 mm de PE-10 e tubo de ligar cada extremidade do tubo de PE-10 a uma 20 cm de comprimento de tubo PE-50 ligado a uma seringa contendo ml de solução salina normal com 23 L de agulha (Figura 2) .
5. Deslocar o coágulo por movimento alternativo contínuo de uma seringa para a outra durante 5 minutos, o que é possível remover as células de sangue a partir deo coágulo e minimizar a fragilidade dos coágulos coagulado extravascular, sem interromper o núcleo de fibrina.
6. Cortar o coágulo em um segmento de 40 milímetros de comprimento e transferir o segmento de coágulo modificado num cateter PE-50, tal como descrito na etapa 1.2, em condições assépticas. Nota: Todos os tubos PE é esterilizado com óxido de etileno.

3. Embolic artéria cerebral média Oclusão (Figura 3A, B)

1. Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos por autoclavagem (mínimo 121 ° C, 15 PSI, por 15 min). Higienizar a mesa de cirurgia e equipamentos cirúrgicos associados com 70% de etanol.
2. Anestesiar os ratos com isoflurano, conforme descrito no passo 2.1. Teste da profundidade da anestesia através da realização de uma ponta de aperto em ambos os pés traseiros, e qualquer movimento observado (retirada da pata), indica que o animal não seja suficientemente anestesiado para fazer a cirurgia. Aplique uma pequena quantidade de pomada veterinário em ambos os olhos para evitar a secura sob anestesia. Raspar a pele no pescoço e cabeça ventral reregiões com cortador elétrico para expor as áreas da pele.
3. Coloque o rato em decúbito dorsal sobre uma almofada de aquecimento. Insira uma sonda rectal, controlar e manter a temperatura do corpo entre 36,5-37,5 ° C, utilizando uma unidade de controlo cobertor homeotérmica.
4. Desinfetar a pele raspada e pele circundante com 10% de iodopovidona seguido por 70% de etanol.
5. Faça uma incisão na linha média 2 cm de comprimento no pescoço sob um microscópio de dissecação. Use retratores para expor o campo cirúrgico e dissecção da artéria carótida comum direita (CCA), artéria carótida externa (ECA), artéria carótida interna (ACI) e artéria pterigopalatina (PPA), isenta de nervos circundantes e fáscia (Figura 3A). Nota: Antes da cirurgia, mudar luvas estéreis se não houver assistente ajuda a preparar o animal.
6. Dissecar o CCA livre dos nervos que rodeiam (sem prejudicar o nervo vago) e coloque um estéril sutura 5-0 seda sob a artéria. Amarre um nó corrediço (# 1) e compreender a sutura usando uma pequena hemostat e puxe ensinado em direção ao corpo.
7. Dissecar o ECA e seus dois ramos, a artéria occipital (OA) e da artéria tireoidiana superior (STA). Coagular dois ramos usando uma unidade eletrocirúrgica veterinária. Coloque dois pedaços de estéreis 6-0 seda sob o ECA.
8. Separa-se as duas sedas colocados por baixo da artéria, uma peça para a cabeça (extremidade distal) e o outro na direcção do corpo. Amarre uma ligadura apertada (# 2) no lado mais próximo da cabeça, segure a seda com pequenas hemostatos e puxe ensinado em direção à cabeça. Prepare um nó frouxo (# 3) com a outra de seda para usar mais tarde.
9. Dissecar o ICA e PPA dos nervos circundantes (sem causar danos ao nervo vago). Amarre o PPA com um 6-0 (# 4). Faça um nó corrediço com 6-0 ao redor do ICA (# 5). Alternativamente, o clipe de ICA usando um clipe microvascular.
10. Corte um pequeno buraco (meia thru) na ECA entre o apertado (# 2) e soltos (# 3) ligaduras com uma tesoura primavera Vannas de estilo. Insira o modificada 50 PE-banheirae contendo coágulo de sangue na incisão e avançar para a bifurcação da CCA. Aperte a ligadura solta (# 3) em torno do lúmen apenas o suficiente para garantir a preservação da mobilidade do tubo em que habitam.
11. Corte o ECA no site do pequeno buraco para liberar o coto e posicionar o tronco abaixo da bifurcação da ECA e da ACI; isso vai permitir que o tubo modificado facilmente deslizar para o ICA. Abra o ICA e avançar suavemente o tubo a partir do lúmen da ECA na ICA até que a ponta do cateter atinge a origem da MCA (~ 17 mm da bifurcação). Nota: Antes de introduzir a ponta do tubo para o CEA, estéril a superfície exterior do tubo com etanol a 70%, e, em seguida, lava-se com solução salina normal estéril.
12. Injectar o coágulo através da modificação do cateter PE-50, juntamente com 10 ul de solução salina durante 10 segundos, utilizando uma seringa Hamilton de 100 l (Figura 3B).
13. Retirar o cateter da ECA cinco minutos mais tarde. Amarre o ECA e reabrir CCA. Suturar a incisão no pescoço.

4 Monitoramento Regional Cerebral Blood Flow (rCBF)

1. Antes de oclusão MCA, fazer um 1,2 centímetros de comprimento incisão na linha média do couro cabeludo em expor o osso do crânio. Retire os tecidos no osso do crânio com um raspador dental e swaps de algodão estéril. Nota: Antes da cirurgia, a área do couro cabeludo exposto e pele circundante são desinfetados com 10% de iodopovidona seguido por 70% de etanol.
2. A broca de 1,5 mm de orifício de trépano diâmetro localizado a 2 mm posterior e 5 mm lateral ao bregma usando uma rebarba esférica de aço inoxidável de 0,7 milímetros (Figura 4).
   Nota: Mantenha a dura intacta.
3. Coloque a sonda de 0,5 milímetros acima da superfície da dura-máter. Monitorizar o rCBF a 0 (linha de base), 5, 15, 30, 60, 90, e 120 minutos após a embolização e continuar a 5, 15, 30, 45, e 60 min após a administração intravenosa de tPA. Depois da última medição de rCBF, a incisão no couro cabeludo é fechada por sutura. Nota: Antes da incisão no pescoço medimos rCBF como base antes MCA Occlusião. Oclusão pós MCA medimos rCBF após o fechamento da sutura de incisão no pescoço. Assim, a incisão do pescoço é mantida estéril.

Cuidados 5. Pós-operatório

1. Injectar 2,5 mL de solução salina por via subcutânea para evitar desidratação e injectar Buprenex (0,05 mg / kg, SC), imediatamente após a cirurgia a cada 6-12 horas e quando necessário para alívio da dor.
2. Pare de anestesia isoflurano. Colocar o rato numa câmara de recuperação veterinária 37 ° C (manter animais quente) e manter observação. Geralmente, leva 10 min para o rato para se recuperar da anestesia. Em seguida, coloque o animal em uma gaiola esterilizado, coloque um pouco de comida molhada em uma placa de Petri na gaiola, e voltar a gaiola para sala de esterilização animal.
3. 24 horas após o derrame, a eutanásia ratos com uma overdose de pentobarbital de sódio (100 mg / kg de peso corporal, IP).

6. Neurological Pontuação Deficit

1. Execute o placar Bederson antes e 2 horas após a embolização. Use uma classificação de scale de 0-3 como descrito anteriormente ^5: 0, levantando o rato pela cauda, ​​a animais que se estende para ambos os membros anteriores e apresentando o piso sem outros déficits (movimento normal); 1, elevando o rato pela cauda, ​​flexionar o membro anterior contralateral; 2, diminuição da resistência à pressão lateral (e membro anterior flexão), sem circular; 3, o mesmo comportamento de grau 2 com circulando.
   NOTA: Os ratos que mostram Bederson score = 0 (sem déficit) em 2 horas após a embolização são excluídos do estudo mais aprofundado.

Representative Results

A fluxometria de Doppler a laser (LDF) foi utilizado para monitorizar rCBF durante a indução da isquémia cerebral ^6,7. Muitos laboratórios, incluindo o nosso laboratório tem usado rCBF para identificar os animais com oclusão MCA bem sucedido, mas os limites de linha de base variou entre os laboratórios que estão relacionados com o local de medição. A sonda do LDF está posicionado a 2 mm posterior a 5 mm lateral ao bregma como descrito anteriormente ^6. rCBF foi monitorizada nos tempos 0, 5, 15, 30, 60, 90, e 120 minutos após a injecção do coágulo. Na base destes dados, apenas os animais que exibem uma redução da rCBF> 70% da linha de base são considerados oclusão embólica bem sucedida da MCA (Figura 5). Às 2 horas após a injecção de coágulo, uma dose de rato padrão de tPA (10 mg / kg) foi administrada por via intravenosa ^7,8 com um bolus de 10% e 90% de infusão contínua ao longo de 30 min, utilizando uma bomba de infusão de seringa ^7,8. Observou-se que os níveis de FSCr Increas gradualmenteed a> 70% da linha de base dentro de 30 min de terapia tPA (Figura 5).

Em 24 horas após a embolização, os animais foram eutanasiados e perfundidos transcardialmente com 200 ml de PBS para remover o sangue intravascular. Estudos anteriores ^2,3,7,8 e os nossos dados (Figura 6) demonstraram enfartes tecido substancialmente maiores produzidas em 24 horas após a embolização. Os cérebros foram coletadas e tirado fotos. No grupo tratado com solução salina, o coágulo de sangue foi prontamente visualizados na origem da MCA e ACA, mas o coágulo foi quase completamente dissolvido em grupo tratado com tPA (Figura 6A). Depois disso, o cérebro foi cortado em sete secções coronais de 2 milímetros, com uma matriz de cérebro de rato sobre o gelo. Incubar as fatias de cérebro em 2% de cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC) a 37 ° C durante 30 min ^9,10. Após a coloração de TTC, as secções coronais foram colocados sobre uma placa e fotografado (Figura 6B). A área de inf arction em cada fatia foi determinada pelo sistema de análise de imagem computadorizada (National Institutes of Health imagem), e o volume médio de enfarte foi calculado através da multiplicação da distância entre as secções. Este modelo de acidente vascular cerebral embólico produzido enfarte do tecido dentro do território da ACM, como visto nas regiões neocórtex e estriado (Figura 6B). Inicial de reperfusão foi estabelecida através de administração intravenosa de tPA a 2 horas após a embolização, os volumes de enfarte foram significativamente reduzidas no grupo tratado com tPA (229,1 ± 45,7 milímetros ^3, n = 12) comparado com o grupo tratado com solução salina (394,2 ± 68,2 milímetros ^3, n = 9) (P <0,01). A taxa de mortalidade de 24 horas é de 16% (4/25).

Figura 1 Medição do diâmetro externo do tubo de PE-50 modificado utilizando um compasso digital.

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Figura 2. lavar coágulo de sangue em um tubo de PE-10. O coágulo de sangue foi lavado por alternativa empurrando as duas seringas ligadas com a extremidade de tubo de PE-50.

Figura 3 (A) Simplificado esquema de rato hemisfério direito isolado artérias mostrando suturas sucessivas para preparar a introdução de modificação PE-50 tubo. (B) Esquema da arquitetura arterial no cérebro do rato, eo cateter avançado do ECA para o ICA do rato. Um coágulo de sangue único (preta) foi contido no tubo.

Figura 4 A bufuro rr (1,5 mm de diâmetro) localizada a 2 mm posterior a 5 mm lateral ao bregma.

Figura 5 do fluxo sanguíneo cerebral regional (rCBF) foi medido utilizando um medidor de vazão laser Doppler (LDF). A injeção coágulo levou a> 70% de redução rCBF do valor inicial. tPA (10 mg / kg) tratados em 2 horas após a injecção de coágulo restaurado rCBF perto da linha de base após 30 min de tratamento de tPA. Os dados foram expressos em média ± SD.

Figura 6 (A) mostra imagens representativas dos coágulos sanguíneos (setas pretas) na origem da artéria cerebral média (ACM) e da artéria cerebral anterior (ACA) às 24 horas após o derrame. Esquerda, rato tratados com solução salina; Certo, tPA-tratados rato, bar = 5 mm.

Discussion

Neste estudo, foi demonstrado um método padrão para a realização de um modelo de acidente vascular cerebral embólico MCAO em ratos, em que a origem da MCA é tapada por um coágulo rico em fibrina. A principal vantagem deste modelo é: a oclusão da haste de MCA com um coágulo de sangue ricos em fibrina, é semelhante ao derrame tromboembólico em humanos, o modelo de acidente vascular cerebral embólico é adequado para a realização de investigação pré-clínica da terapêutica fibrinolítica, e que este modelo pode desenvolver um volume de infarto reprodutível e previsível no território fornecido pelo MCA.

Para a realização do modelo MCAO embólico, a introdução do coágulo, a estabilidade e guarida são difíceis de controlar, o que leva a variações no tamanho do enfarte e as regiões do cérebro afectadas ^2,3. Estudos anteriores demonstraram que as lesões isquêmicas reprodutíveis no território MCA só poderia ser alcançado quando os coágulos que obstruem estão alojados no tronco de MCA ^2,3. Para apresentar precisamente o coágulo eproduzir um modelo de acidente vascular cerebral embólico reprodutível, no presente estudo, que demonstram como preparar um tubo de PE-50 modificado e a forma de introduzir a ponta do tubo modificado para a origem da MCA e a forma de injectar um coágulo rico em fibrina na ACM. Consistente com o relatório anterior ^2, o coágulo foi injectado facilmente visualizado na origem da MCA em todos os ratos tratados com solução salina (n = 9), mas foi largamente dissolvido em todos os ratos tratados com tPA (n = 12), 24 h depois embolização.

Para avaliar o sucesso de OACM, o rCBF, déficits neurológicos, eo padrão e distribuição de lesões cerebrais foram avaliadas. Após a injecção de coágulo, rCBF foi diminuída para 30% da linha de base e esta diminuição de rCBF persistiu durante pelo menos 2 horas após a embolização, consistentes com relatos anteriores ^6,7. Depois do tratamento com tPA a 2 horas após a embolização, os níveis de rCBF foram restauradas perto da linha de base após 30 min de tratamento de tPA. Escore neurológico foi medido 10 minantes de o tratamento medicamentoso com o escore de Bederson modificado para ajudar avaliar o sucesso de OACM. Esta pontuação neurológica é uma maneira simples e rápida para detectar a função neurológica global na fase aguda do acidente vascular cerebral. Os animais que apresentem comportamentos normais (escore = 0) foram excluídos do tratamento medicamentoso e posterior análise. Além disso, demonstrou-se que a lesão do tecido foi produzido principalmente dentro do território da ACM, como visto nas regiões neocórtex e estriado, e tratamento de tPA (no 2 h) reduziu significativamente o tamanho do enfarte em 24 horas após o acidente vascular cerebral. Juntos, nossos dados demonstram que o modelo de acidente vascular cerebral embólico apresentada neste trabalho pode desenvolver um volume de infarto previsível dentro do território da ACM.

Finalmente, observamos que há várias questões técnicas que podem afetar o sucesso do modelo OACM embólico. Um problema comum encontrado na realização modelo OACM embólico é reperfusão precoce espontânea após a embolização. A ocorrência de espontânea i reperfusãoé susceptível de ser associada com a fragilidade dos coágulos coagulado extravascular e o comprimento do coágulo utilizado para ocluir o MCA ^2,3,10. Acreditamos que o método que descrevemos (passo 2) para preparar coágulo de sangue minimizaria a frágil do coágulo coagulado extravascular. O comprimento do coágulo sanguíneo único usado para ocluir MCA variou de laboratório para laboratório entre 25 mm a 50 mm de comprimento ^2,3,6-8,10. Nós descobrimos que a utilização de um coágulo de 35-40 mm de comprimento, idealmente ocluído a MCA e produzido o volume de enfarte altamente reprodutível. Modificando o tubo de PE-50 com o diâmetro da ponta entre 0,30-0,34 mm. Se o diâmetro da ponta é> 0,34 milímetros, não pode atingir a origem da MCA. Se o diâmetro da ponta é <0,30 milímetros, o coágulo no interior do tubo de PE-50 modificado é difícil passar através da ponta. A taxa de mortalidade está intimamente relacionado ao inchaço cerebral grave e hemorragia intracerebral. Neste trabalho, a taxa de mortalidade de 24 horas é de 16% (4/25; ver resultados representativos), e todos os ratos mortos mostrou inchaço cerebral graveção, embora nós não ver hemorragia intracerebral (possivelmente devido à dimensão limitada da amostra). Um fator de mortalidade controlável é a temperatura corporal durante a cirurgia. Ao controlar a temperatura do corpo entre 36,5-37,5 ° C a partir do início da cirurgia até à recuperação completa da anestesia. A temperatura do corpo afecta significativamente a extensão do dano no tecido cerebral. A hipotermia diminui e aumenta a hipertermia ^11,12 volume de enfarte. Realizar a cirurgia em um curto período de tempo (cerca de 20-25 minutos) de acordo com o protocolo, a fim de produzir o tamanho do infarto altamente reprodutível. As complicações infecciosas são a principal causa de morte em pacientes com AVC agudo ^13. Para reduzir a incidência de complicações infecciosas e melhorar a taxa de sobrevivência após o AVC, técnica asséptica deve ser usado durante a cirurgia.

Em conclusão: as técnicas apresentadas neste artigo deve ajudar os pesquisadores a superar problemas técnicos para o estabelecimento de thé um modelo de pesquisa para acidente vascular cerebral.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
rh-tPA	Chemical	Genentech
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride	Chemical	Sigma	T8877
Anesthesia vaporizer	Equipment	Soma Technology	Drager Vapor 19.1
Rechargeable high speed micro drill	Equipment	Fine Science Tools	18000-17
Curved scissors	Equipment	Fine Science Tools	14117-14
Dumont forceps (Medical #7)	Equipment	Fine Science Tools	11270-20
Dumont forceps (Medical #5)	Equipment	Fine Science Tools	11251-35
Vannas-style spring scissors	Equipment	Fine Science Tools	15000-03
Veterinary recovery chamber	Equipment	Peco Services	V1200
Genie plus syringe pump	Equipment	Kent Scientific Corporation
Rat brain matrix	Equipment	Kent Scientific Corporation	RBMA-310C
Digital caliper	Equipment	World Precision Instruments	501601
Dissecting microscope	Equipment	World Precision Instruments	PZMTIII-BS-LWD
Hamilton syringe	Equipment	Hamilton	model 710
Homeothermic blanket control unit	Equipment	Harvard Apparatus
Electric clipper	Equipment	Braintree Scientific	CLP-9931
Veterinary electrosurgical unit	Equipment	MACAN Manufacturing Company	MV-9
Blood flowmeter	Equipment	Adinstruments
PowerLab 4/30	Equipment	Adinstruments
LabChart 7.2	software	Adinstruments
1 ml syringe	Consumable	Becton, Dickinson and Company	309659
23 G needle	Consumable	Becton, Dickinson and Company	305143
30 G needle	Consumable	Becton, Dickinson and Company	305106
PE-50 tubing	Consumable	Becton, Dickinson and Company	427517
PE-10 tubing	Consumable	Becton, Dickinson and Company	427400
6-0 Silk suture	Consumable	Harvard apparatus	723287
5-0 Silk suture	Consumable	Harvard Apparatus	517607