Mycket effektiv Transfektion av mänskliga THP-1 makrofager från Nucleofection

Summary

Detta protokoll utgör en effektiv och tillförlitlig metod för att transfektera humana THP-1 makrofager med siRNA eller plasmid-DNA genom elektroporering med hög transfektionseffektivitet bibehållen hög cell vitalitet och full makrofag förmåga till differentiering och polarisering.

Abstract

Makrofager, som nyckelspelare i det medfödda immunsvaret, är i fokus för forskningen behandlar vävnad homeostas eller olika patologier. Transfektion med siRNA och plasmid-DNA är ett effektivt verktyg för att studera deras funktion, men transfektion av makrofager är ingen bagatell. Även om många olika metoder för transfektion av eukaryota celler finns tillgängliga, bara ett fåtal ger tillförlitlig och effektiv transfektion av makrofager, men minskad cell vitalitet och allvarligt förändrad cellbeteende som minskad förmåga till differentiering eller polarisering ofta observeras. Därför kan en transfektion protokoll krävs som är i stånd att överföra siRNA och plasmid-DNA in i makrofager utan att orsaka allvarliga biverkningar sålunda möjliggör undersökning av effekten av siRNA eller plasmid i samband med den normala cellbeteende. Protokollet presenteras här tillhandahåller en metod för att tillförlitligt och effektivt transfektera humana THP-1 makrofager och monocytes med hög cell vitalitet, hög transfektionseffektivitet och minimala effekter på cellens beteende. Detta synsätt bygger på Nucleofection och protokollet har optimerats för att upprätthålla maximal kapacitet för cellaktivering efter transfektion. Protokollet är tillräcklig för adherenta celler efter avlossning liksom celler i suspension, och kan användas för små till tal medelprov. Sålunda är den metod som presenteras användbar för undersökning av genreglerande effekter under makrofagdifferentiering och polarisation. Förutom att presentera resultat som kännetecknar makrofager transfekterade enligt detta protokoll i jämförelse med ett alternativt kemiskt metod effekterna av cellkulturmedium urvalet efter transfektion på cellens beteende diskuteras. De presenterade uppgifterna visar vikten av att bekräfta valet för olika experimentella inställningar.

Introduction

Bland de cellulära komponenterna i det humana immunsystemet, makrofager är av stor betydelse för den medfödda immunresponsen. Deras uppgifter är olika; de är inblandade i fagocytos av patogener och nekrotiskt material, spelar de en viktig roll i vävnad homeostas och producera och utsöndra ett stort antal cytokiner för att reglera och orkestrera immunsvaret ^1. Därför makrofager är integrerat inblandade i många fysiologiska processer och patofysiologiska förhållanden. På grund av mångfalden av sina uppgifter, makrofager är en mycket heterogen och mångfacetterad celltyp. Detta uppnås genom olika polarisation; beroende på yttre stimuli makrofager kan utvecklas till olika fenotyper ^2. Makrofager 'variabilitet och påverkan på immunsvaret gör dem ett mycket intressant forskningsobjekt. För att belysa deras komplexa metabola och reglerande funktioner, lämplig makrofager in vitro-modeller är required som korrekt återspeglar makrofag heterogenitet och variabilitet.

Transfektion av celler med plasmid DNA-vektorer eller små störande RNA (siRNA) för att ändra cellens genuttryck har blivit en allmänt använd och kraftfullt verktyg inom cellbiologi för att undersöka både genreglering och geners funktion. För närvarande finns det ett stort urval av olika verktyg som finns för transfektion av eukaryota celler. Dessa verktyg inkluderar tillämpningen av virala vektorer, mekaniska metoder (såsom gen vapen), kemiska metoder (som är beroende av polymerer eller lipider som kan bilda komplex med nukleinsyror), och elektroporering av celler ^3. Alla dessa metoder har sina fördelar och nackdelar och välja bäst lämpade från detta breda spektrum för en specifik celltyp och tillämpning kan vara en svår och tidskrävande process.

Makrofager är notoriskt svåra att transfektera som nästan alla väletablerade överfction metoder drastiskt minska makrofager "livskraft eller störa deras beteende, dvs differentiering särskilt polarisering. Därför presenterar vi här en effektiv, icke-viral protokoll för att transfektera humana THP-1 makrofager som använder elektrobaserade Nucleofector teknik, vilket är en optimerad elektroporering tillvägagångssätt som kräver minskade mängder DNA. Nucleofection är väl lämpad för känsliga celler såsom monocyter och makrofager. Detta protokoll är en anpassning av tidigare publicerade versioner ^4,5.

I korthet är forbol 12-myristat 13-acetat (PMA) användes för att differentiera humana THP-1-monocyter i 48 h i prematura makrofager före transfektion med siRNA eller plasmid-DNA. För transfektion de predifferentiated makrofagerna lösgörs enzymatiskt genom Accutase I-behandling. Transfektionen utförs med användning av en Nucleofector 2b anordning för elektroporering av cellerna. Efter transfektion, skiljerentiation fortsätts under ytterligare 24 till 48 h efter behov. Slutligen är mogna transfekterade makrofager inkuberades med olika typer av föreningar för funktionella studier.

Detta tillvägagångssätt möjliggör för transfektion av cellinjer, såsom humana THP-1-monocyter och makrofager, och har med framgång tillämpats tidigare ^6-10. I motsats till de flesta kemiska transfektion metoder, våra modifierade Nucleofection proceduren med prematura makrofager ger höga transfektionseffektiviteter i kombination med felfri cellviabilitet, utan att behöva använda virala vektorer eller lägga till ytterligare bärarföreningar med okända biverkningar. Dessutom makrofagerna behåller sina möjligheter till differentiering och polarisering vilket möjliggör obehindrat funktionella undersökningar efter transfektion ^11.

Vidare cellodlingsmediet appliceras efter Nucleofection starkt påverkar funktionella studier följande transfection; i synnerhet, kan makrofagerna förmåga till polarisation påverkas beroende på den applicerade odlingsmediet. Här fyra olika typer av cellodlingsmedia (IMDM, X-VIVO 20, LGM3 och mus T Cell Nucleofector medium) testades under deaktiverande förhållanden med hjälp av interleukin (IL) 10 Använda THP-1 makrofager, konstaterade vi att cell lyhördhet för IL10 är starkast när Mus T Cell Nucleofector medium används i jämförelse med den andra odlingsmedier som nämns ovan. Dessa resultat visar att lämplig optimering av samtliga cellodlingsförhållanden är avgörande för framgångsrik transfektion und efterföljande funktionella studier eftersom de kan avsevärt förbättra experimentella resultat.

Eftersom makrofager är inblandade i olika mänskliga sjukdomar, är mycket forskning inriktad på att belysa makrofag beteende samt reglerande mekanismer som påverkar makrofager eller i sin tur kontrolleras av makrofager. Därför är detta protokoll av relevans imånga olika forskningsområden.

Protocol

1. Predifferentiation av THP-1 makrofager

1. Cultivate THP-1-celler i RPMI-1640-medium kompletterat med 10% (vol / vol) fetalt kalvserum (FCS) och 1% (volym / volym) penicillin / streptomycin / L-glutamin (PSG) i en _CO2 (5% ) inkubator vid 37 ° C.
2. Före transfektion, dela upp celler och överföra dem till frisk RPMI-medium som tidigare. Odla cellerna under 24 tim.
3. Seed 1,0-1,5 x 10 ⁷ celler i en 75 cm vävnadsodlingskolv eller 2,5 x 10 ⁷ celler till en 150-cm vävnadsodlingskolv i RPMI-1640-medium och tillsätt 10% (v / v) FCS, 1% (v / v) PSG, 1% (volym / volym) natriumpyruvat, 1% (v / v) icke-essentiella aminosyror, 10 ng / ml PMA och 50 pM β-merkaptoetanol under 48 timmar.

2 Beredning av Nucleofection

1. Placera Accutase I och alla medier i vattenbad vid 37 ° C.
2. Sug odlingsmedium från kolven och ersätta med 6 ml (75 cm kolv) eller 12 ml (150 cm kolv) avAccutase I och inkubera under 30 min vid 37 ° C för fullständig lösgöring av cellerna. Observera cellmorfologin efter Accutase I behandlingen för att säkerställa att cellerna har en rund utseende. Om vissa celler verkar fortfarande fästas, noggrant skölja kolven med en mikropipett eller försiktigt knacka den är klar lossnar. Använd inte cellskrapor, eftersom detta kommer att ha en negativ effekt på cell vitalitet. Överför cellsuspensionen till en 15 ml tub.
3. Under Accutase I behandling, förbereda följande medier:
   1. Förbered transfektion medium: tillägg cellkulturmedium med 1% (volym / volym) PSG, 1% (vol / vol) av icke-essentiella aminosyror, 1% (volym / volym) natriumpyruvat, och 5% (vol / vol) humanserum (för siRNA) eller 20% (volym / volym) humant serum (för plasmid-DNA); förbereda en slutlig volym av antingen 3 ml / prov för en 6-brunnsplatta eller 4 ml / prov för två 12-brunnars plattor.
   2. Bered odlingsmediet: supplement odlingsmedium med 1% (volym / volym) PSG, 1% (vol / vol) av icke-essentiella aminosyror, 1% (volym / volym) natriumpyruvat, och 5% (volym / volym) humannen serum (för siRNA) eller 20% (volym / volym) humant serum (för plasmid), 2,5 ng / ml PMA och 50 pM β-merkaptoetanol; förbereda en slutlig volym av antingen 3 ml / prov för en 6-brunnsplatta eller 4 ml / prov för två 12-brunnars plattor.
4. Centrifugera cellsuspensionen under 5 min vid 300 xg vid rumstemperatur.
5. Aspirera Accutase I-och återsuspendera cellerna i 1 ml RPMI-medium förvärmas till 37 ° C; räkna celler för att bestämma cellantalet.
   OBS! När snabba automatiska rutiner cellräkning används, steg 2,4 och 2,5 kan utelämnas och celler kan räknas direkt efter lösgör förutsättning att långvarig exponering för Accutase I undviks.
6. För varje transfektion prov förbereda alikvoter i centrifugrör innehållande 2,0-2,5 x 10 ⁶ celler.

3. Nucleofection av THP-1 makrofager

1. Centrifugera alla portioner i 10 min vid 250 xg vid rumstemperatur.
2. Späd plasmid-DNA eller siRNA i nukleasfrittvatten eller en lämplig buffert. Håll den erforderliga volymen av plasmid-DNA eller siRNA så liten som möjligt.
3. Förbered en Nucleofector kyvett med antingen 1 pg av siRNA eller 0,5 pg av plasmid-DNA för varje transfektion.
4. Utför en transfektion i taget. Sug ut supernatant från cell delmängd.
5. Resuspendera pelleterade cellerna i Nucleofector lösning för erhållande av en total volym av 100 | il DNA / siRNA och Nucleofector lösning. Håll tiden för exponering för ren Nucleofector lösning till ett minimum och se till att exponeringstiden inte överstiger 15 minuter.
6. Blanda resuspenderade celler och DNA / siRNA i Nucleofector kyvett genom att klappa försiktigt.
7. Transfektera celler genom att utföra programmet Y-001 i Nucleofector 2b enhet.
8. Överför transfekterade celler i ett reaktionsflaska i engångsplast Pasteur pipetter.
9. Omedelbart tillsätt 500 l av beredd transfektion medium.
10. Upprepa steg från 3,4 till 3,9 för varje transfektion prov.

1. Förbered antingen 6 brunnar eller 12 brunnar för transfekterade celler. Pipettera 2,5 ml av transfektion mediet i varje brunn i en 6-brunnsplatta (1 brunn / transfektion) eller 1,75 ml av transfektion mediet i varje brunn i en 12-brunnars platta (två brunnar / transfektion).
2. Blanda cellsuspensioner noggrant med en mikropipett.
3. Överför transfekterade cellerna i de preparerade brunnarna (antingen en brunn i en 6 brunnar eller två i en 12 brunnar).
4. Inkubera plattorna under 4 h i en fuktsatt inkubator (5% _CO2, 37 ° C).
5. Kontrollera återfästning av celler i mikroskop.
   OBS: En majoritet av cellerna bör vara anhängare igen. Ibland förlänga inkubationstiden med 1 timme ökar antalet vidhäftande celler vid otillräcklig återfastsättning.
6. Försiktigt aspirera transfektion medium med en mikropipett och ersätta med lika mängd odlingsmedium. Sug bara en bra på en gång.
<li> Inkubera cellerna för krävs tid för maximal effekt av plasmid eller siRNA (24-72 timmar). Om inkubationsperioder överstiger 48 timmar, byt medium efter 48 timmar.
7. För ytterligare behandling med effektorer (t.ex.., Cytokiner, agonister, antagonister och hämmare) använder serumfritt medium utan PMA och β-merkaptoetanol. Tid slutet av inkubationsperioden av effektorn med tidpunkten för maximal effekt av plasmiden eller siRNA och planera förändring av mediet och tillsats av effektorn därefter. Inte upprätthålla celler under serumfria betingelser under längre tid än 24 timmar.

Representative Results

Med hjälp av detta protokoll för transfektion av THP-1 makrofager med siRNA vi brukar uppnå transfektion andelen över 90% utan betydande minskning av cell vitalitet. Figur 1 visar representativa uppgifter som karakteriserar tillståndet i cellerna 24 timmar efter transfektion med fluorescerande siRNA kontra en otransfekterad kontroll, som inte behandlades med nucleofection reagenser och puls eller siRNA men fick alla förändringar av odlingsmedier som transfekterade prover. I figur 1 A den cellulära morfologi visas enligt flödesmätning cytometrisk. Mikroskopiska bilder visas i figur 1B Figurerna 1C och 1D representerar låga priser för apoptos (kontroll: 1,5%; Nucleofection: 5,4%). Och nekros (kontroll: 2,0%; Nucleofection: 3,2%) indikerar opåverkade cell vitalitet. Nekros och apoptos är något högre för transfekterade provet transfekterade THP-1 makrofager är mersvår att lossa än otransfekterade celler, alltså sannolikheten för cellskador under lösgör ökar. Slutligen transfektionseffektiviteten presenteras i figur 1E. Eftersom hela transfekterade befolkningen förskjuts mot kontrollen, betyder det att alla celler transfekteras vilket bekräftas av fluorescens mikroskopiska bilder (Figur 2B). Båda Flödescytometrisk data samt fluorescens mikroskopiska bilder visar att alla celler konsekvent transfekteras med homogen fördelning av siRNA bland celler samt inom celler. Detta står i kontrast till många kemiska transfektionsreagens, för jämförelse Figurerna 2A och 2B visar respektive flödescytometriska data och fluorescens mikroskopiska bilder för en kemisk transfektion agenten med en lipid baserad metod. Dessa siffror visar att två olika populationer av transfekterade celler kan detekteras. Den första populationen liknar de transfekterade cellerna FollOvinge Nucleofection. De kännetecknas av låg total fluorescens och homogen fördelning av siRNA i cellerna. Den andra populationen markeras av en intensivare fluorescens som härrör från mycket ljusa intracellulära agglomerat av siRNA. Det cellulära morfologi påverkas inte både transfektion metoder som visas av differential interferenskontrast i figur 2C. Transfektioner effektivt använder plasmid-DNA ger liknande resultat, för exempel se Robenek et al. (2009) ⁹ eller Xie et al. (2006) ^7.

Valet av cellodlingsmediet efter transfektion är av stor betydelse; därför olika cellodlingsmedia testades i jämförelse. De utvalda medierna är alla lämpliga för odling av THP-1-celler och valdes enligt rekommendationer från Lonza som är tillämpligt media för post-Nucleofection odling. Figur 3 representerar siRNA Mediated VÄLDIGANDE effektivitet med hjälp av en siRNA riktad mot IL10RB (interleukin 10 receptor β-kedjan) mRNA. För alla testade medier uttrycket av IL10RB var signifikant reducerad till ungefär 10 till 20% av kontrollnivån (Figur 3). Men de transfekterade cellerna variera beroende på odlingsmediet i deras potential för polarisation. THP-1 makrofager transfekterade med antingen ospecifik kontroll siRNA eller IL10RB-specifika siRNA odlades i olika medier efter transfektion och behandlades med IL10. Därefter uttrycksnivåer IL10-inducerad gen SOCS3 (suppressor av cytokin signalering 3) på mRNA-nivå mättes med RT-qPCR. Skillnader mellan odlingsmedier förekommer med avseende på graden av induktion av SOCS3 mRNA-expression (Figur 4), de induktioner för var och en av de testade medierna Mus T Cell Nucleofector Medium, LGM3, X-VIVO 20 och IMDM var 19,5 [17,7-21,5 ], 11.5 [8,5-15,7], 8,0 [4,6-14,2] och 7,2 [5,6-9,5] lägga sig, respektive. Denlåtas tillämpning av Mouse T Cell Nucleofector medium är viktigt. Dessutom skillnader i effekten av knockdown av IL10RB på SOCS3 uttryck efter IL10 behandlingen var observerades expressionsnivåer av SOCS3 mRNA minskas till 9,5 [8,8-10,3] vika in mus T Cell Nucleofector medium, 2,1 [1,1-4,1] vik i LGM3, 4,8 [3,2-7,2] vika i X-VIVO 20 och 3,3 [2,7-3,9] vika i IMDM. Dessa värden motsvarar minskningar av SOCS3 uttryck i olika medier till 49%, 18%, 60% och 45%, respektive. Minskning av IL-10-inducerad SOCS3 expression efter transfektion av IL10RB siRNA bekräftar framgångsrik nedreglering av IL10RB genom transfektion.

Figur 1 Karakterisering av transfekterade THP-1 makrofager. Det karakteristiska status av cellerna är opåverkat såsom avslöjas genom Ijusmikroskopisk och flödescytometrisk analys av otransfekterade control celler kontra THP-1 makrofager transfekterades enligt den presenterade protokollet. THP-1 makrofager differentierade med 10 ng / ml PMA under 48 timmar och transfekteras med fluorescensmärkt (Alexa 488) ospecifik kontroll siRNA. 24 h efter transfektion antingen bilder av levande celler togs (B), eller cellerna lossades genom Accutase I-behandling och analyserades med flödescytometri (A). Apoptos och nekros färgning utfördes med användning av Annexin V-fykoerytrin (PE) (C) och 7-Aminoactinomycin (7-AAD) (D). Transfektionseffektivitet (E) bestämdes med flödescytometri med fluorescens etikett på siRNA. Fluorescenssignalen av de transfekterade cellerna (svarta) visas mot styrsignalen (grå). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2 Jämförelse av intracellulär distribution av siRNA efter Nucleofection kontra lipofektion. THP-1-celler differentieras under 48 timmar enligt detta protokoll och sedan transfekteras antingen Nucleofection eller lipofektion. De presenterade lipofektionsmetoder resultat erhölls med användning av Xtremegene siRNA kit enligt tillverkarens rekommendationer med en laddningsförhållande av reagens till siRNA av 4: 1. 24 timmar efter transfektion cellerna antingen fristående med Accutase I för flödescytometrisk analys eller utvärderade mikroskopiskt med levande celler. (A) Transfektionseffektivitet och distribution av siRNA per cell i populationen bestämdes med flödescytometri med fluorescens etiketten på siRNA är kontroller transfekterade utan siRNA visas i grått, prover transfekterade med siRNA visas i svart. (B) Fluorescensmikroskopibilder som visar intracellulära fördelningen av fluorescensmärkt siRNA (Alexa Fluor 488); skalan stapel representerar 40 pm. (C) Differentiell interferenskontrastbild som motsvarar den fluorescensbild; skalan stapel representerar 40 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3 siRNA-medierad knockdown av IL10RB i transfekterade THP-1 makrofager. THP-1 makrofager transfekterades enligt det skisse protokollet. Efter transfektion cellerna odlades i fyra olika odlingsmedier, nämligen Mouse T Cell Nucleofector medium (A), IMDM (B), LGM3 (C), och X-VIVO 20 (D), kompletterat enligt beskrivningen i protokollet avsnittet. Calnar antingen transfekterades med ospecifik kontroll siRNA (Ctrl) eller IL10RB specifika siRNA (IL10RB). Som ytterligare kontroller följande prover ingick: Pulskontroll, dvs. celler som genomgick transfektion i frånvaro av siRNA (Pulse) och en mediumkontroll, dvs. celler som fick endast de förändringar av odlingsmedier, men förblev i övrigt obehandlad. 24 h efter transfektion inkuberades cellerna i serumfritt medium med eller utan 50 ng / ml IL10 för ytterligare 24 timmar. IL10RB expression mättes genom RT-qPCR; diagram visar medelvärdet av tre oberoende försök, felstaplar representerar standardfel medelvärdet; * P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001 vs Ctrl. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4. IL10-beroende reglering av SOCS3 efter knockdown av IL10RB i transfekterade THP-1 makrofager. THP-1 makrofager transfekterades enligt det beskrivna protokollet. Efter transfektion av cellerna odlades i fyra olika odlingsmedier Mus T Cell Nucleofector medium (A), IMDM (B), LGM3 (C) och X-VIVO 20 (D) kompletterat såsom beskrivet i protokollet sektion. Celler antingen transfererats med ospecifik kontroll siRNA (Ctrl) eller IL10RB specifika siRNA (IL10RB). Som ytterligare kontroller följande prover ingick: Pulskontroll, det vill säga celler som genomgick transfektion i avsaknad av siNRA (Pulse) och ett medium kontroll, dvs. celler som fick endast de förändringar av odlingsmedier, men förblev i övrigt obehandlad. 24 h efter transfektion inkuberades cellerna i serumfritt medium med eller utan 50 ng / ml IL10 för ytterligare 24 timmar. SOCS3 Expression mättes genom RT-qPCR; diagram visar medelvärdet av tre oberoende försök, felstaplar representerar standardfel medelvärdet; *, # P <0,05; **, ## P <0,01; ***, ### P <0,001 vs Ctrl och vs Ctrl + IL-10, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Det protokoll som beskrivs här utgör ett tillförlitligt och effektivt sätt att transfektera THP-1 makrofager som vanligtvis ganska svårt att transfektera. Transfektion kan åstadkommas med transfektionseffektiviteter av ovan 90% för siRNA utan signifikant minskning av cell vitalitet. Effektivitetsvinster för plasmider kan vara mindre på grund av deras storlek, men transfektionseffektiviteter på cirka 70% kan oftast uppnås. Effektiviteten av siRNA-förmedlad knockdown kan nå 80 till 90% beroende på den applicerade siRNA. En stor fördel med detta protokoll är att det inte interfererar med celldifferentiering. Efter transfektion cellerna reagerar fortfarande normalt differentiering agenten PMA (Figur 1A till 1B och figur 4) ^12. Dessutom cellulär polarisering av cytokin stimuli såsom IL10 eller LPS / IFNy påverkas inte ^12, även om detta beror också mycket på det valda för odling efter transfektion ett mediums som visas i figur 4.

Det finns flera alternativ inom det förfarande som kan modifieras för att anpassa protokollet till specifika krav. Såsom visas i fig 4 cellerna reagerar olika på samma IL10 stimulans beroende på odlingsmedium valt efter transfektion. Detta tyder på att medel kompositionen har en stark påverkan på cellulär beteende. Eftersom effekten ut av mediet kan skilja sig för olika experimentella stimuli, är det möjligt att den optimala mediet kan ändras och därför finns det ett behov av att kontrollera lämpligheten av medium för olika experiment självständigt. Men RPMI-1640-medium, vilket är standard medium som används för odling av THP-1-celler, har visat sig vara olämpliga för odling efter transfektion som en betydande förlust i cell vitalitet observerades. Vidare kan även tillämpas protokollet till THP-1-monocyter utan föregående PMA-inducerad differentiering, dettauppenbarligen tar bort behovet av cellen lossnar under förfarandet, men alla återstående steg inte behöver justeras. THP-1-monocyter kan differentieras efteråt om det behövs.

De mest kritiska delarna av protokollet är för det första lossnar och för det andra den tid som krävs för transfektion. Den lösgör måste utföras så försiktigt som möjligt, för att upprätthålla hög cellviabilitet. Därför rekommenderar vi förhållandevis mild enzymatiska lossnar från Accutase jag över ganska aggressiva metoder såsom trypsinization. Ytterligare lösgör metoder såsom behandling med Lidocain eller skrapa befanns vara ganska skadligt och bör inte användas. I det fall att 30 min av Accutase I behandlingen inte skulle vara tillräcklig för att lösgöra alla celler på rätt sätt det är oftast ett tecken på felaktigt lagrad eller förfallit Accutase I lösning eller av för många frys-tö cykler. Vi har fått goda resultat genom att lagra små portioner av Accutase I vid -20 °C för att minska antalet frysnings-upptiningscykler. Men när det inte finns tillräckligt lösgör antingen ersätta Accutase I med färsk Accutase eller öka inkubationstid på upp till 1 timme. Dessutom försiktigt packas eller sköljning av kolven eller plattan kan hjälpa lossnar. När det krävs tid för transfektion exponeringstiden för cellerna till ren Nucleofector lösning har fått stor påverkan på cellöverlevnad och därför bör vara så kort som möjligt. Det bästa sättet att uppnå detta är att utföra varje transfektion i taget (steg från 2,10 till 2,15) och inte flera transfektioner parallellt.

Om knockdown effektiviteten är låg, detta oftast inte orsakas av låg transfektionseffektivitet, men detta kan lätt kontrolleras med hjälp av flödescytometri eller fluorescensmikroskopi och fluorescerande siRNA eller GFP kodande plasmid. Mestadels orsaken är ett ineffektivt siRNA eller plasmid-DNA. Under dessa omständigheter bör man överväga att öka mängden siRNA (upp till 2-3 mikrogram) ellerplasmid-DNA (upp till 1-2 mikrogram) eller använda ett annat siRNA eller expressionsvektor om det finns. Alternativt kan tillfredsställande resultat även uppnås genom användning av en pool av flera olika siRNA riktade mot samma mål. Dessutom kan tidsförloppet experiment att krävas för att noggrant fastställa tiden för maximal effekt, som vanligtvis uppnås efter 24 till 72 h efter transfektion.

Bortsett från transfektion genom elektroporation det finns ytterligare väletablerade tekniker för transfektion av däggdjursceller. Ofta tillämpade system är kemiska transfektionsmedel som kan bilda komplex med den last nukleinsyran och därefter underlätta transport in i cellerna. De vanligast använda reagensen är antingen baserade på olika lipid arter eller kan väljas från ett antal katjoniska polymerer ^3. För båda närmar sig ett mångsidigt utbud är kommersiellt tillgänglig. Dessa transfektionsreagens erbjuder fördelen att de vanligen ärlätt att använda, inte kräver mycket tid, och arbeta med vidhäftande celler också, vilket tar bort behovet av avskildhet. Olyckligtvis makrofager är ganska svåra att transfektera med dessa metoder, eftersom de inte prolifererar signifikant in vitro och besitter försvarsmekanismer riktas mot främmande cytosoliska DNA ^13-15. Således kemiska transfektion metoder ofta leda till en kraftig minskning av cellernas livskraft. Men som visas i figur 2 finns det kemiska transfektionsmedel som framgångsrikt kan överföra siRNA in i makrofager, men som flödescytometrisk (Figur 2A) och fluorescerande mikroskopisk (Figur 2B) analyser indikerar att de misslyckas med att uppnå samma homogen fördelning av siRNA i cellerna som erhålles genom Nucleofection. Faktum är att de flödescytometriska data indikerar att två olika populationer av transfekterade celler uppträder, för det första en population med liknande fluorescens som cellerna efter Nucleofectiden upptäcks och för det andra finns det en befolkning med mer intensiv fluorescens. Definitiv bekräftelse krävs fortfarande men vi antar att den första befolkningen i fluorescensmikroskopi identiska med de celler som uppvisar en homogen fördelning av fluorescerande siRNA i cytosolen, medan den andra populationen sannolikt motsvarar cellerna med mycket ljusa agglomerat. De flödescytometriska data som visas i figur 2A visar att Nucleofection resulterar i mindre siRNA per cell än alternativet lipofektion tillvägagångssätt. Men data i figur 3 visar att även den jämförelsevis liten mängd av siRNA införlivas genom Nucleofection är redan tillräcklig för 80 till 90% knockdown av målgenen. Därför extra belopp på siRNA införlivas genom den andra populationen efter kemisk transfektion är mycket troligt överskott och är därför mer sannolikt att orsaka oönskade biverkningar än att ytterligare öka VÄLDIGANDE effektivitet. Bortsett från attbildning av intracellulära agglomerat redan oönskad i sig eftersom dessa siRNA-molekyler sannolikt inte funktionella eller åtminstone mindre effektiva än fria siRNA-molekyler och kan orsaka off target effekter. Dessutom är den sanna naturen av dessa agglomerat ännu inte klart. Det är möjligt att dessa ljuspunkter representerar endosomer indikerar att siRNA var internaliseras av cellerna men därefter släppa från endosomer misslyckades och siRNA förblir instängd och därmed ineffektiva. Alternativt fläckarna kan vara agglomerat, som bildas intracellulärt. Funktionella utvärderingar av kemiska transfektion pågår, kan därför inte gjort några definitiva uttalanden om knockdown effektivitet ännu, ändå att det finns två distinkta populationer redan ogynnsam eftersom detta innebär att alla resultat beskriver medelvärdet för båda populationerna, det betyder alltså inte motsvarar antingen av befolkningarna. Därför Nucleofection är överlägsen strategi.

det vill säga program och compossition av Nucleofector lösning, har ändrats i enlighet med, det måste bestämmas om våra protokoll kan överföras till dessa system.

Men trots dessa begränsningar protokollet presenteras här ger efter en pålitlig och effektiv transfektion av THP-1-celler, som är överlägsen alla andra icke-virala metoder. Detta protokoll möjliggör undersökning av effekterna av förändrade genuttryck i THP-1-celler, som i alla andra aspekter differentierar och polariserar normalt och på så sätt visa så lite biverkningar av transfektion som möjligt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase I	Sigma-Aldrich	A6964
Amino acids, nonessential	PAA	M11-003
Centrifuge tubes (15 ml)	TPP	TPP91015
Fetal calf serum (FCS gold)	PAA	A15-151
Human Monocyte Nucleofector Kit	Lonza	VPA-1007	Contains Nucleofector Solution, cuvettes, and Pasteur pipettes
Human serum off the clot	Lonza	C11-020
Isove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) with 25 mM HEPES and 25 mM L-glutamine	Lonza	12-722F
Lymphocyte Growth Medium 3 (LGM3)	Lonza	CC-3211
Mouse T Cell Nucleofector Medium	Lonza	VZB-1001
Nucleofector 2b	Lonza	AAD-1001
Penicillin / streptomycin / L-glutamine (100x)	Sigma-Aldrich	G1146
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Fisher Scientific	BP685
Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI 1640)	PAA	E15-840
siRNA / plasmid
Sodium pyruvate (100 mM)	Sigma-Aldrich	S8636
THP-1 human leukemia monocytes	CLS	300356
Tissue culture flasks (75 cm²; 150 cm²)	TPP	TPP90076/TPP90151
Tissue culture plates (6-well; 12-well)	TPP	TPP92406/TPP92012
Tubes (1.5 ml)	StarLab	S 1615-5500
Water (nuclease-free) or appropriate siRNA/plasmid buffer
X-Vivo 20 with gentamycin	Lonza	BE04-448Q
β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148