Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Nucleofection द्वारा मानव THP-1 मैक्रोफेज की अत्यधिक कुशल अभिकर्मक

Published: September 2, 2014 doi: 10.3791/51960
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Nutrition, Friedrich Schiller University Jena

Summary

इस प्रोटोकॉल उच्च सेल जीवन शक्ति और भेदभाव और ध्रुवीकरण के लिए पूर्ण बृहतभक्षककोशिका क्षमता को बनाए रखते हुए उच्च अभिकर्मक दक्षता के साथ electroporation द्वारा siRNA या प्लाज्मिड डीएनए के साथ मानव THP-1 मैक्रोफेज transfect करने के लिए एक कुशल और विश्वसनीय विधि प्रस्तुत करता है.

Abstract

मैक्रोफेज, सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के प्रमुख खिलाड़ी के रूप में, ऊतक homeostasis या विभिन्न विकृतियों के साथ काम कर अनुसंधान के फोकस पर हैं. SiRNA और प्लास्मिड डीएनए के साथ अभिकर्मक उनके कार्य के अध्ययन के लिए एक कुशल उपकरण है, लेकिन मैक्रोफेज की अभिकर्मक एक छोटी सी बात नहीं है. यूकेरियोटिक कोशिकाओं के अभिकर्मक के लिए कई अलग अलग दृष्टिकोण उपलब्ध हैं, केवल कुछ मैक्रोफेज के विश्वसनीय और कुशल अभिकर्मक, लेकिन कम सेल जीवन शक्ति और अक्सर मनाया जाता है भेदभाव या ध्रुवीकरण के लिए कम क्षमता की तरह गंभीर रूप से बदल सेल व्यवहार अनुमति देते हैं. इसलिए एक अभिकर्मक प्रोटोकॉल इस प्रकार सामान्य कोशिका व्यवहार के संदर्भ में siRNA के प्रभाव या प्लाज्मिड की जांच की अनुमति गंभीर दुष्प्रभाव के कारण के बिना मैक्रोफेज में siRNA और प्लास्मिड डीएनए स्थानांतरित करने में सक्षम है कि आवश्यक है. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल मज़बूती से और कुशलता से मानव THP-1 मैक्रोफेज और मो transfecting के लिए एक तरीका प्रदान करता हैउच्च सेल जीवन शक्ति, उच्च अभिकर्मक दक्षता, और सेल व्यवहार पर कम से कम प्रभाव के साथ nocytes. यह दृष्टिकोण nucleofection पर आधारित है और प्रोटोकॉल अभिकर्मक के बाद सेल सक्रियण के लिए अधिकतम क्षमता बनाए रखने के लिए अनुकूलित किया गया है. प्रोटोकॉल निलंबन में सेना की टुकड़ी के साथ ही कोशिकाओं के बाद पक्षपाती कोशिकाओं के लिए पर्याप्त है, और मध्यम नमूना संख्या के लिए छोटे के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रकार, प्रस्तुत विधि बृहतभक्षककोशिका भेदभाव और ध्रुवीकरण के दौरान जीन विनियामक प्रभाव की जांच के लिए उपयोगी है. इसके अलावा एक विकल्प रासायनिक विधि की तुलना में इस प्रोटोकॉल के अनुसार ट्रांसफ़ेक्ट मैक्रोफेज निस्र्पक नतीजे पेश से, सेल व्यवहार पर अभिकर्मक के बाद सेल संस्कृति के माध्यम चयन का प्रभाव भी चर्चा की है. प्रस्तुत आंकड़ों विभिन्न प्रयोगात्मक सेटिंग के लिए चयन मान्य के महत्व को इंगित करते हैं.

Introduction

मानव प्रतिरक्षा प्रणाली के सेलुलर घटकों के अलावा, मैक्रोफेज सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए बहुत महत्व के हैं. उनके कार्यों विविध रहे हैं; वे रोगजनकों और परिगलित सामग्री की phagocytosis में शामिल कर रहे हैं, वे ऊतक homeostasis में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और विनियमित करने और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 1 आर्केस्ट्रा साइटोकिन्स की एक बड़ी संख्या का उत्पादन और छिपाना. इसलिए मैक्रोफेज अभिन्न कई शारीरिक प्रक्रियाओं और pathophysiological शर्तों में शामिल हैं. कारण उनके कार्यों की विविधता के लिए, मैक्रोफेज एक बहुत ही विषम और बहुमुखी सेल प्रकार के होते हैं. यह अलग polarizations द्वारा हासिल की है; बाहरी उत्तेजनाओं मैक्रोफेज के आधार पर अलग phenotypes 2 में विकसित कर सकते हैं. प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पर मैक्रोफेज 'परिवर्तनशीलता और प्रभाव के लिए उन्हें एक बहुत ही दिलचस्प शोध विषय बना. इन विट्रो मॉडल में उनके जटिल चयापचय और विनियामक कार्यों, उचित बृहतभक्षककोशिका स्पष्ट करने के लिए आदेश में अनुरोध कर रहे हैंuired सही ढंग से मैक्रोफेज विविधता और परिवर्तनशीलता को प्रतिबिंबित करता है.

सेलुलर जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन करने के क्रम में प्लास्मिड डीएनए वैक्टर या छोटे दखल RNAs (siRNAs) के साथ कोशिकाओं के अभिकर्मक जीन विनियमन और जीन समारोह दोनों की जांच के लिए कोशिका जीव विज्ञान में एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया और शक्तिशाली उपकरण बन गया है. वर्तमान में कोशिकाओं के अभिकर्मक के लिए उपलब्ध विभिन्न उपकरणों का एक बड़ा चयन है. ये उपकरण कोशिकाओं 3 के वायरल वैक्टर, (जैसे जीन बंदूकों के रूप में) यांत्रिक विधियों, (न्यूक्लिक एसिड के साथ परिसरों फार्म कर सकते हैं कि पॉलिमर या लिपिड पर भरोसा है) रासायनिक दृष्टिकोण के आवेदन, और electroporation शामिल हैं. इन तरीकों के सभी के अपने फायदे और नुकसान है और एक विशेष सेल प्रकार और आवेदन के लिए इस व्यापक सरणी से सबसे उपयुक्त का चयन एक कठिन और समय लेने वाली प्रक्रिया हो सकती है.

मैक्रोफेज के रूप में लगभग सभी अच्छी तरह से स्थापित transfe transfect के लिए बेहद मुश्किल हो जाता हैction दृष्टिकोण काफी मैक्रोफेज 'व्यवहार्यता को कम करने या उनके व्यवहार, यानी भेदभाव के साथ और विशेष ध्रुवीकरण में हस्तक्षेप. इसलिए, हम यहाँ डीएनए की कम मात्रा की आवश्यकता होती है एक अनुकूलित electroporation के दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है जो electroporation आधारित Nucleofector प्रौद्योगिकी का उपयोग करते हुए मानव THP-1 मैक्रोफेज transfect करने के लिए एक कुशल, गैर वायरल प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. Nucleofection ऐसे monocytes और मैक्रोफेज के रूप में संवेदनशील कोशिकाओं के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है. इस प्रोटोकॉल पहले प्रकाशित संस्करणों 4,5 का एक रूपांतर है.

संक्षेप में, phorbol 12 myristate 13-एसीटेट (पीएमए) पूर्व siRNA या प्लाज्मिड डीएनए के साथ अभिकर्मक के लिए समय से पहले मैक्रोफेज में 48 घंटे के लिए मानव THP-1 monocytes अंतर करने के लिए प्रयोग किया जाता है. अभिकर्मक के लिए predifferentiated मैक्रोफेज Accutase मैं उपचार द्वारा enzymatically अलग कर रहे हैं. अभिकर्मक कोशिकाओं की electroporation के लिए एक Nucleofector 2B डिवाइस का उपयोग किया जाता है. अभिकर्मक के बाद, अलगआवश्यक रूप entiation एक और 24 से 48 घंटे के लिए जारी रखा है. अंत में, परिपक्व ट्रांसफ़ेक्ट मैक्रोफेज कार्यात्मक अध्ययन के लिए यौगिकों के विभिन्न प्रकार के साथ incubated हैं.

यह दृष्टिकोण इस तरह के मानव THP-1 monocytes और मैक्रोफेज के रूप में सेल लाइनों के अभिकर्मक के लिए अनुमति देता है और सफलतापूर्वक पिछले 6-10 में लागू किया गया है. सबसे रासायनिक अभिकर्मक दृष्टिकोण के विपरीत, समय से पहले मैक्रोफेज का उपयोग हमारे संशोधित nucleofection प्रक्रिया वायरल वैक्टर का उपयोग करें या अज्ञात दुष्प्रभाव के साथ आगे वाहक यौगिकों को जोड़ने की आवश्यकता के बिना, अछूता सेल व्यवहार्यता के साथ संयोजन में उच्च अभिकर्मक क्षमता अर्जित करता है. इसके अलावा, मैक्रोफेज इस प्रकार अभिकर्मक 11 निम्नलिखित बेरोक कार्यात्मक जांच की अनुमति उनके पूर्ण भेदभाव के लिए संभावित रूप में अच्छी तरह से ध्रुवीकरण बरकरार रहती है.

इसके अलावा, nucleofection के बाद लागू सेल संस्कृति के माध्यम जोरदार कार्यात्मक अध्ययन के बाद ट्रॅन को प्रभावित करती हैsfection; विशेष रूप से, ध्रुवीकरण के लिए मैक्रोफेज 'क्षमता लागू संस्कृति के माध्यम के आधार पर प्रभावित किया जा सकता है. सेल संस्कृति मीडिया की यहाँ चार अलग अलग प्रकार (IMDM, एक्स विवो 20, LGM3 और माउस टी सेल Nucleofector मध्यम) इंटरल्यूकिन का उपयोग कर निष्क्रिय परिस्थितियों में परीक्षण किया गया (आईएल) 10 THP-1 मैक्रोफेज का उपयोग करना, हम IL10 को सेल जवाबदेही है कि मनाया माउस टी सेल Nucleofector मध्यम अन्य उपरोक्त संस्कृति मीडिया की तुलना में प्रयोग किया जाता है जब मजबूत. इन परिणामों के इन काफी प्रयोगात्मक परिणामों में सुधार हो सकता है के रूप में सभी सेल संस्कृति शर्तों का उचित अनुकूलन सफल अभिकर्मक und बाद कार्यात्मक अध्ययन के लिए आवश्यक है कि प्रदर्शित करता है.

मैक्रोफेज विभिन्न मानव रोगों में शामिल कर रहे हैं, अधिक से अधिक शोध बृहतभक्षककोशिका व्यवहार के रूप में अच्छी तरह से मैक्रोफेज द्वारा नियंत्रित मैक्रोफेज या बदले में प्रभावित करने नियामक तंत्र elucidating पर ध्यान केंद्रित किया है. इसलिए, इस प्रोटोकॉल में प्रासंगिक हैकई अलग अलग क्षेत्रों में शोध.

Protocol

THP-1 मैक्रोफेज की 1 Predifferentiation

  1. सीओ 2 में 10% (v / v) भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) और 1% (v / v) पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन / एल glutamin (पीएसजी) के साथ पूरक RPMI 1640 मध्यम में THP-1 कोशिकाओं खेती (5% 37 डिग्री सेल्सियस) इनक्यूबेटर.
  2. अभिकर्मक पहले, कोशिकाओं को विभाजित और पहले के रूप में ताजा RPMI मध्यम को हस्तांतरण. 24 घंटे के लिए कोशिकाओं खेती.
  3. बीज 1.0-1.5 एक्स 10 एक 75 सेमी ² टिशू कल्चर फ्लास्क में 7 कोशिकाओं या 2.5 x 10 7 RPMI 1640 मध्यम में एक 150 सेमी ² टिशू कल्चर फ्लास्क में कोशिकाओं और 10% (v / v) एफसीएस, 1% (v जोड़ने / 48 घंटे के लिए वी) पी एस जी, 1% (v / v) सोडियम पाइरूवेट, 1% (v / v) अनावश्यक अमीनो एसिड, 10 एनजी / एमएल पीएमए, और 50 माइक्रोन β-mercaptoethanol.

Nucleofection की 2. तैयारी

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में Accutase मैं और सभी मीडिया रखें.
  2. कुप्पी से महाप्राण संस्कृति मध्यम और 6 मिलीग्राम (75 सेमी ² कुप्पी) या 12 मिलीलीटर (150 सेमी ² कुप्पी) के साथ की जगहAccutase मैं और कोशिकाओं की पूरी टुकड़ी के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं. कोशिकाओं एक दौर उपस्थिति है कि यह सुनिश्चित करने के लिए Accutase मैं उपचार के बाद सेल आकारिकी का निरीक्षण करें. कुछ कोशिकाओं को अभी भी संलग्न होना दिखाई देते हैं, तो ध्यान से एक micropipette साथ फ्लास्क कुल्ला या धीरे टुकड़ी को पूरा करने के लिए यह नल. इस सेल जीवन शक्ति पर नकारात्मक प्रभाव पड़ेगा ही, सेल स्क्रेपर्स का प्रयोग न करें. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब सेल निलंबन स्थानांतरण.
  3. Accutase मैं उपचार के दौरान, निम्नलिखित मीडिया को तैयार:
    1. अभिकर्मक मध्यम तैयार: पूरक सेल संस्कृति के माध्यम 1% (v / v) पी एस जी के साथ, 1% (v / v) अनावश्यक अमीनो एसिड, 1% (v / v) सोडियम पाइरूवेट, और 5% (v / v) मानव सीरम (प्लास्मिड डीएनए के लिए) मानव सीरम (siRNA के लिए) या 20% (v / v); दो 12 अच्छी तरह प्लेटों के लिए एक 6 अच्छी तरह से थाली या 4 मिलीग्राम / नमूना के लिए या तो 3 मिलीग्राम / नमूना के अंतिम मात्रा तैयार करते हैं.
    2. खेती मध्यम तैयार: पूरक संस्कृति मध्यम 1% (v / v) पी एस जी के साथ, 1% (v / v) अनावश्यक अमीनो एसिड की, 1% (v / v) सोडियम पाइरूवेट, और 5% (v / v) हूआदमी (siRNA के लिए) सीरम या 20% (प्लाज्मिड के लिए) (वी / वी) मानव सीरम, 2.5 एनजी / एमएल पीएमए, और 50 माइक्रोन β-mercaptoethanol; दो 12 अच्छी तरह प्लेटों के लिए एक 6 अच्छी तरह से थाली या 4 मिलीग्राम / नमूना के लिए या तो 3 मिलीग्राम / नमूना के अंतिम मात्रा तैयार करते हैं.
  4. कमरे के तापमान पर 300 XG पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र सेल निलंबन.
  5. RPMI मध्यम 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गरम के 1 मिलीलीटर में महाप्राण Accutase मैं और resuspend कोशिकाओं; सेल नंबर निर्धारित करने के लिए कोशिकाओं गिनती.
    नोट: तेजी से स्वचालित सेल गिनती प्रक्रियाओं उपयोग किया जाता है, 2.4 कदम और 2.5 हटाया जा सकता है और कोशिकाओं टुकड़ी Accutase मैं करने के लिए लंबे समय तक निवेश से परहेज है बशर्ते कि तुरंत बाद गिना जा सकता है.
  6. प्रत्येक अभिकर्मक नमूना के लिए 2.0-2.5 एक्स 10 6 कोशिकाओं से युक्त ट्यूब में aliquots तैयार करते हैं.

THP-1 मैक्रोफेज की 3 nucleofection

  1. अपकेंद्रित्र कमरे के तापमान पर 250 XG पर 10 मिनट के लिए सभी aliquots.
  2. Nuclease मुक्त में प्लास्मिड डीएनए या siRNA पतलापानी या एक उपयुक्त बफर. संभव के रूप में छोटे रूप में प्लास्मिड डीएनए या siRNA के लिए आवश्यक मात्रा रखें.
  3. प्रत्येक अभिकर्मक के लिए प्लास्मिड डीएनए की 1 siRNA के ग्राम या 0.5 माइक्रोग्राम के साथ या तो एक Nucleofector क्युवेट तैयार करें.
  4. एक समय में एक अभिकर्मक प्रदर्शन करना. सेल विभाज्य से सतह पर तैरनेवाला Aspirate.
  5. डीएनए / siRNA और Nucleofector समाधान के 100 μl की कुल मात्रा उपज Nucleofector समाधान में pelleted कोशिकाओं Resuspend. एक न्यूनतम करने के लिए शुद्ध Nucleofector समाधान के लिए जोखिम के समय रखें और 15 मिनट से अधिक नहीं है कि जोखिम समय किया जाता है.
  6. कोमल दोहन द्वारा Nucleofector क्युवेट में resuspended कोशिकाओं और डीएनए / siRNA मिलाएं.
  7. Nucleofector 2B डिवाइस में कार्यक्रम वाई -001 प्रदर्शन से Transfect कोशिकाओं.
  8. डिस्पोजेबल प्लास्टिक पाश्चर pipettes का उपयोग कर एक प्रतिक्रिया शीशी में ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं स्थानांतरण.
  9. तुरंत तैयार अभिकर्मक माध्यम के 500 μl जोड़ें.
  10. दोहराएँ 3.4 प्रत्येक अभिकर्मक नमूना के लिए 3.9 करने के लिए कदम.

  1. ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के लिए 6 अच्छी तरह से या 12 अच्छी तरह से या तो प्लेटों की तैयारी. पिपेट 2.5 6 अच्छी तरह से थाली में से प्रत्येक कुएं में अभिकर्मक मध्यम (1 अच्छी तरह / अभिकर्मक) की मिलीलीटर या एक 12 अच्छी तरह से थाली में से प्रत्येक कुएं में अभिकर्मक मध्यम से 1.75 मिलीलीटर (2 कुओं / अभिकर्मक).
  2. एक micropipette के साथ अच्छी तरह से सेल निलंबन मिलाएं.
  3. तैयार कुओं में ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं हस्तांतरण (या तो एक अच्छी तरह से एक 12 अच्छी तरह से थाली में एक 6 अच्छी तरह से थाली या दो में).
  4. एक humidified इनक्यूबेटर (5% सीओ 2, 37 डिग्री सेल्सियस) में 4 घंटे के लिए प्लेटें सेते हैं.
  5. Microscopically कोशिकाओं की reattachment की जाँच करें.
    नोट: कोशिकाओं के अधिकांश फिर से पक्षपाती होना चाहिए. कभी कभी, 1 घंटा से ऊष्मायन अवधि का विस्तार अपर्याप्त reattachment के मामले में पक्षपाती कोशिकाओं की संख्या बढ़ जाती है.
  6. ध्यान से एक micropipette साथ अभिकर्मक मध्यम aspirate और खेती मध्यम के बराबर राशि के साथ बदलें. एक समय में महाप्राण केवल एक अच्छी तरह से.
    7. <ली> प्लाज्मिड या siRNA (24-72 घंटा) की अधिक से अधिक प्रभाव के लिए आवश्यक समय अवधि के लिए कोशिकाओं को सेते हैं. ऊष्मायन अवधि 48 घंटे से अधिक है, 48 घंटे के बाद मध्यम जगह.
  7. प्रभावोत्पादक साथ अतिरिक्त उपचार के लिए (जैसे., साइटोकिन्स, एगोनिस्ट, गरम और अवरोधकों) पीएमए बिना सीरम मुक्त मध्यम और β-mercaptoethanol का उपयोग करें. समय प्लाज्मिड या siRNA के अधिक से अधिक प्रभाव के समय के साथ प्रेरक के ऊष्मायन अवधि के अंत और मध्यम और तदनुसार प्रेरक के अलावा के परिवर्तन की योजना है. अब से 24 घंटे के लिए सीरम मुक्त शर्तों के तहत कोशिकाओं को बनाए रखने मत करो.

Representative Results

हम आमतौर पर सेल जीवन शक्ति का महत्वपूर्ण कमी के बिना 90 से ऊपर% की अभिकर्मक दर हासिल siRNA साथ THP-1 मैक्रोफेज की अभिकर्मक के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना. 1 चित्रा 24 घंटा एक untransfected बनाम siRNA लेबल fluorescently साथ अभिकर्मक के बाद कोशिकाओं के राज्य निस्र्पक प्रतिनिधि डेटा से पता चलता है nucleofection अभिकर्मकों के साथ इलाज किया और नाड़ी या siRNA लेकिन ट्रांसफ़ेक्ट नमूने के रूप में संस्कृति मीडिया के सभी परिवर्तनों को प्राप्त नहीं कर रहे थे, जो नियंत्रण,. चित्रा 1 ए में सेलुलर आकृति विज्ञान प्रवाह cytometric माप के अनुसार दिखाया गया है. . सूक्ष्म छवियों चित्रा 1 बी में दिखाया आंकड़े 1C और 1D कम apoptosis के लिए एक्सचेंज (नियंत्रण: 1.5%; nucleofection: 5.4%) का प्रतिनिधित्व कर रहे हैं:;: अप्रभावित सेल जीवन शक्ति का संकेत है और नेक्रोसिस (3.2% नियंत्रण nucleofection 2.0%). ट्रांसफ़ेक्ट THP-1 मैक्रोफेज अधिक कर रहे हैं के रूप में परिगलन और apoptosis ट्रांसफ़ेक्ट नमूना के लिए कुछ अधिक होती हैंuntransfected कोशिकाओं, टुकड़ी बढ़ जाती दौरान सेल नुकसान का, इस प्रकार संभावना से अलग करने के लिए मुश्किल. अंत में अभिकर्मक दक्षता चित्रा 1E में प्रस्तुत किया है. पूरे ट्रांसफ़ेक्ट जनसंख्या नियंत्रण के खिलाफ स्थानांतरित कर दिया जाता है, यह सभी कोशिकाओं प्रतिदीप्ति सूक्ष्म छवियों (चित्रा 2B) द्वारा पुष्टि की है जो ट्रांसफ़ेक्ट हैं कि इंगित करता है. दोनों सभी कोशिकाओं लगातार कोशिकाओं के बीच के रूप में अच्छी तरह से कोशिकाओं के भीतर siRNA के समरूप वितरण के साथ ट्रांसफ़ेक्ट हैं संकेत मिलता है कि cytometric डेटा के साथ ही प्रतिदीप्ति सूक्ष्म छवियों प्रवाह. इस तुलना आंकड़े 2A के लिए, कई रासायनिक अभिकर्मक अभिकर्मकों के विपरीत है और 2 बी एक लिपिड आधारित दृष्टिकोण का उपयोग कर एक रासायनिक अभिकर्मक एजेंट के लिए संबंधित प्रवाह cytometric डेटा और प्रतिदीप्ति सूक्ष्म छवियों दिखा. ये आंकड़े ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की दो अलग आबादी से पता लगाया जा सकता है. पहले आबादी follo ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के समान हैविंग nucleofection. वे कम समग्र प्रतिदीप्ति और कोशिकाओं के भीतर siRNA के समरूप वितरण की विशेषता है. दूसरी आबादी siRNA के बहुत उज्ज्वल intracellular agglomerates से निकलती है, जो एक और अधिक तीव्र प्रतिदीप्ति द्वारा चिह्नित है. चित्रा -2 में अंतर हस्तक्षेप विपरीत द्वारा दिखाया के रूप में सेलुलर आकारिकी दोनों अभिकर्मक दृष्टिकोण के लिए अप्रभावित रहता है. प्रभावी रूप से इसी तरह के परिणाम प्लास्मिड डीएनए उपज का उपयोग transfections, उदाहरण के लिए Robenek एट अल. (2009) 9 या झी कृपया देखें एट अल. (2006) 7.

अभिकर्मक के बाद सेल संस्कृति के माध्यम से चुनाव महान प्रासंगिकता की है; इसलिए अलग सेल संस्कृति मीडिया तुलना में परीक्षण किया गया. चयनित मीडिया सभी THP-1 कोशिकाओं की खेती के लिए उपयुक्त हैं और बाद nucleofection खेती के लिए लागू मीडिया के रूप में Lonza की सिफारिशों के अनुसार चुने गए हैं. 3 siRNA mediat प्रतिनिधित्व करता चित्राएड IL10RB (इंटरल्यूकिन 10 रिसेप्टर β श्रृंखला) mRNA के खिलाफ निर्देशित एक siRNA का उपयोग दक्षता पछाड़ना. सभी परीक्षण मीडिया के लिए IL10RB की अभिव्यक्ति काफी नियंत्रण स्तर के बारे में 10 से 20% करने के लिए (चित्रा 3) कम हो गया था. हालांकि ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं ध्रुवीकरण के लिए अपनी क्षमता में मध्यम संस्कृति के आधार पर भिन्न होते हैं. Unspecific नियंत्रण siRNA या IL10RB विशेष या तो siRNA साथ ट्रांसफ़ेक्ट THP-1 मैक्रोफेज अभिकर्मक के बाद विभिन्न मीडिया में खेती और IL10 साथ इलाज किया गया. IL10 प्रेरित जीन SOCS3 mRNA के स्तर पर (साइटोकाइन 3 संकेत का शमन) के बाद अभिव्यक्ति के स्तर RT-qPCR द्वारा मापा गया. संस्कृति मीडिया के बीच मतभेद SOCS3 mRNA अभिव्यक्ति की प्रेरण की सीमा के संबंध में होते हैं (चित्रा 4), परीक्षण मीडिया माउस टी सेल Nucleofector मध्यम से प्रत्येक के लिए inductions, LGM3, एक्स विवो 20 और IMDM थे 19.5 [17.7-21.5 ], 11.5 [8.5-15.7], 8.0 [4.6-14.2] और 7.2 [5.6-9.5] क्रमश: गुना.माउस टी सेल Nucleofector माध्यम की refore आवेदन महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, IL10 उपचार के बाद SOCS3 अभिव्यक्ति पर IL10RB की पछाड़ना के प्रभाव में मतभेद नमूदार थे, SOCS3 mRNA की अभिव्यक्ति के स्तर 9.5 [8.8-10.3] में गुना माउस टी सेल Nucleofector मध्यम करने के लिए कम हो गई थी, 2.1 [1.1-4.1] गुना LGM3 में, 4.8 [3.2-7.2] एक्स विवो 20 और 3.3 [2.7-3.9] में गुना IMDM में गुना. इन मूल्यों को क्रमशः 49%, 18%, 60%, और 45%, के लिए अलग मीडिया में SOCS3 अभिव्यक्ति की कटौती के अनुरूप हैं. IL10RB siRNA के अभिकर्मक के बाद आईएल -10 प्रेरित SOCS3 अभिव्यक्ति की कमी अभिकर्मक से IL10RB की सफल डाउनरेगुलेशन पुष्टि करता है.

चित्रा 1
प्रकाश सूक्ष्म से पता चला है और cytometric प्रवाह untransfected सह के विश्लेषण के रूप में ट्रांसफ़ेक्ट THP-1 मैक्रोफेज की संख्या 1 विशेषता. कोशिकाओं की विशेषता स्थिति अप्रभावित हैTHP-1 मैक्रोफेज बनाम ntrol कोशिकाओं प्रस्तुत प्रोटोकॉल के अनुसार ट्रांसफ़ेक्ट. THP-1 मैक्रोफेज 48 घंटे के लिए 10 एनजी / एमएल पीएमए के साथ भेदभाव और fluorescently लेबल (एलेक्सा 488) unspecific नियंत्रण siRNA साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे. अभिकर्मक के बाद 24 घंटे या तो जीवित कोशिकाओं की छवियों (बी) ले जाया गया, या कोशिकाओं Accutase मैं उपचार से अलग और फ्लो (ए) द्वारा विश्लेषण किया गया. Apoptosis और परिगलन धुंधला Annexin वि phycoerythrin (पीई) (सी) और 7 aminoactinomycin (7 AAD) (डी) का उपयोग किया गया था. अभिकर्मक दक्षता (ई) siRNA से जुड़ी प्रतिदीप्ति लेबल का उपयोग प्रवाह cytometry द्वारा निर्धारित किया गया था. ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं (काला) के प्रतिदीप्ति संकेत नियंत्रण संकेत (ग्रे) के खिलाफ दिखाया गया है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2 चित्रा lipofection बनाम nucleofection के बाद siRNA के intracellular वितरण का 2 तुलना करें. THP-1 कोशिकाओं इस प्रोटोकॉल के अनुसार 48 घंटे के लिए भेदभाव और फिर nucleofection द्वारा या lipofection द्वारा या तो ट्रांसफ़ेक्ट थे. प्रस्तुत lipofection परिणाम 4 के siRNA अभिकर्मक के प्रभारी अनुपात के साथ निर्माता की सिफारिशों के अनुसार Xtremegene siRNA किट का उपयोग कर प्राप्त किया गया है: 1. अभिकर्मक कोशिकाओं के बाद 24 घंटा या तो प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए Accutase मैं साथ अलग या जीवित कोशिकाओं के साथ microscopically मूल्यांकन किया गया. जनसंख्या के भीतर (ए) अभिकर्मक दक्षता और सेल प्रति siRNA के वितरण siRNA से जुड़ी प्रतिदीप्ति लेबल का उपयोग प्रवाह cytometry द्वारा निर्धारित किया गया था, siRNA बिना ट्रांसफ़ेक्ट नियंत्रण ग्रे में दिखाए जाते हैं, siRNA साथ ट्रांसफ़ेक्ट नमूने काले रंग में दिखाया गया है. (बी) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपीsiRNA (एलेक्सा Fluor 488) लेबल fluorescently के intracellular वितरण दिखा छवियों; पैमाने बार 40 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है. (सी) प्रतिदीप्ति छवि को इसी अंतर हस्तक्षेप विपरीत छवि; पैमाने बार 40 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3 ट्रांसफ़ेक्ट THP-1 मैक्रोफेज में IL10RB की पछाड़ना siRNA मध्यस्थता. THP-1 मैक्रोफेज उल्लिखित प्रोटोकॉल के अनुसार ट्रांसफ़ेक्ट थे. अभिकर्मक कोशिकाओं चार अलग संस्कृति मीडिया, अर्थात् माउस टी सेल Nucleofector मध्यम (ए), IMDM (बी) में खेती की जाती थी बाद प्रोटोकॉल खंड में वर्णित के रूप में, LGM3 (सी), और एक्स विवो 20 (डी), पूरक. सीएल्स या तो unspecific नियंत्रण siRNA (Ctrl) या IL10RB विशिष्ट siRNA (IL10RB) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे. पल्स नियंत्रण, यानी: निम्नलिखित नमूने शामिल थे अतिरिक्त नियंत्रण के रूप में. यानी siRNA (पल्स) का अभाव है, और एक मध्यम नियंत्रण में अभिकर्मक कराना पड़ा जो कोशिकाओं. संस्कृति मीडिया के केवल परिवर्तन प्राप्त लेकिन अन्यथा अनुपचारित बनी कि कोशिकाओं. 24 घंटा अभिकर्मक के बाद कोशिकाओं के साथ या आगे 24 घंटे के लिए 50 एनजी / एमएल IL10 बिना सीरम मुक्त माध्यम में incubated रहे थे. IL10RB अभिव्यक्ति RT-qPCR द्वारा मापा गया था; चित्र तीन स्वतंत्र प्रयोगों का मतलब, त्रुटि सलाखों के मतलब की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व दिखाने; * पी 0.05 <; ** पी 0.01 <; *** Ctrl बनाम पी <0.001. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4 चित्रा ट्रांसफ़ेक्ट THP-1 मैक्रोफेज में IL10RB की पछाड़ना के बाद SOCS3 के 4 IL10 निर्भर विनियमन. THP-1 मैक्रोफेज वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार ट्रांसफ़ेक्ट थे. अभिकर्मक कोशिकाओं चार अलग संस्कृति मीडिया माउस टी सेल Nucleofector मध्यम (ए), IMDM (बी) में खेती की जाती थी बाद प्रोटोकॉल खंड में वर्णित के रूप में, LGM3 (सी) और एक्स विवो 20 (डी) पूरक. कोशिकाओं या तो unspecific नियंत्रण siRNA (Ctrl) या IL10RB विशिष्ट siRNA (IL10RB) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे. यानी पल्स नियंत्रण, siNRA (पल्स) की अनुपस्थिति में अभिकर्मक कराना पड़ा जो यानी कोशिकाओं, और एक मध्यम नियंत्रण,: अतिरिक्त निम्न नमूने शामिल थे नियंत्रण के रूप में. संस्कृति मीडिया के केवल परिवर्तन प्राप्त लेकिन अन्यथा अनुपचारित बनी कि कोशिकाओं. 24 घंटा अभिकर्मक के बाद कोशिकाओं के साथ या आगे 24 घंटे के लिए 50 एनजी / एमएल IL10 बिना सीरम मुक्त माध्यम में incubated रहे थे. SOCS3 expression RT-qPCR द्वारा मापा गया था; चित्र तीन स्वतंत्र प्रयोगों का मतलब, त्रुटि सलाखों के मतलब की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व दिखाने; * # पी 0.05 <; **, ## पी 0.01 <; ***, ### Ctrl बनाम और बनाम पी <0.001 Ctrl + आईएल -10, क्रमशः. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

यहाँ उल्लिखित प्रोटोकॉल आमतौर पर transfect बल्कि मुश्किल हैं जो THP-1 मैक्रोफेज transfect करने के लिए एक विश्वसनीय और कुशल तरीके से प्रस्तुत करता है. अभिकर्मक सेल जीवन शक्ति का महत्वपूर्ण कमी के बिना siRNA के लिए ऊपर 90% की अभिकर्मक क्षमता के साथ प्राप्त किया जा सकता है. Plasmids के लिए क्षमता आम तौर पर प्राप्त किया जा सकता है लगभग 70% की उनके आकार लेकिन अभिकर्मक क्षमता को कम होने के कारण हो सकता है. siRNA मध्यस्थता पछाड़ना की दक्षता लागू siRNA के आधार पर 80 से 90% तक पहुँच सकते हैं. इस प्रोटोकॉल का एक बड़ा फायदा यह सेल भेदभाव के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है. अभिकर्मक के बाद कोशिकाओं को अभी भी 12 भेदभाव एजेंट पीएमए (1 बी और चित्रा 4 के लिए चित्रा 1 ए) के लिए सामान्य रूप से जवाब. यह भी अभिकर्मक एक के बाद खेती के लिए चयनित माध्यम पर दृढ़ता से निर्भर करता है, हालांकि इस तरह के IL10 या LPS रूप साइटोकाइन उत्तेजनाओं से अतिरिक्त सेलुलर ध्रुवीकरण में / IFNγ, अप्रभावित 12 हैचित्रा 4 में दिखाया गया है.

विशिष्ट आवश्यकताओं के लिए प्रोटोकॉल अनुकूलित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है, जो प्रक्रिया के भीतर कई विकल्प हैं. चित्रा 4 में दिखाया गया है कोशिकाओं अभिकर्मक के बाद चयनित संस्कृति के माध्यम के आधार पर एक ही IL10 प्रोत्साहन के लिए अलग तरह से प्रतिक्रिया. यह मध्यम रचना सेलुलर व्यवहार पर मजबूत प्रभाव है कि इंगित करता है. विभिन्न प्रयोगात्मक उत्तेजनाओं के लिए अलग हो सकता है मध्यम द्वारा लगाए प्रभाव के रूप में, यह इष्टतम मध्यम बदल सकता है और इसलिए स्वतंत्र रूप से विभिन्न प्रयोगों के लिए माध्यम की उपयुक्तता को सत्यापित करने की जरूरत है कि संभव है. हालांकि THP-1 कोशिकाओं की खेती के लिए इस्तेमाल डिफ़ॉल्ट माध्यम है जो RPMI 1640 मध्यम,, सेल जीवन शक्ति में एक महत्वपूर्ण नुकसान मनाया गया के रूप में अभिकर्मक के बाद खेती के लिए बीमार अनुकूल साबित हो गया है. इसके अलावा प्रोटोकॉल भी पूर्व पीएमए प्रेरित भेदभाव के बिना THP-1 monocytes के लिए लागू किया जा सकता है, इसजाहिर प्रक्रिया के दौरान सेल टुकड़ी के लिए जरूरत को हटाता है, लेकिन सभी बचे हुए चरणों को समायोजित करने की जरूरत नहीं है. यदि आवश्यक THP-1 monocytes बाद में भेदभाव किया जा सकता है.

प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण तत्व सबसे पहले टुकड़ी और दूसरी अभिकर्मक के लिए आवश्यक समय हैं. टुकड़ी उच्च सेल व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए, के रूप में धीरे संभव के रूप में किया जाना चाहिए. इसलिए हम Accutase मैं ऐसी trypsinization के रूप में काफी आक्रामक तरीके से अपेक्षाकृत हल्के एंजाइमी टुकड़ी की सलाह देते हैं. ऐसे Lidocain या स्क्रैप के साथ इलाज के रूप में आगे टुकड़ी तरीकों बल्कि हानिकारक हो पाया गया और नहीं किया जाना चाहिए. Accutase मैं उपचार के 30 मिनट सभी कोशिकाओं को अलग करने के लिए पर्याप्त नहीं होना चाहिए कि मामले में ठीक से यह आम तौर पर गलत तरीके से संग्रहीत या समाप्त हो गई है Accutase मैं समाधान की या बहुत अधिक फ्रीज पिघलना चक्र का एक संकेत है. हम -20 डिग्री पर Accutase मैं के छोटे aliquots संग्रहीत करके अच्छे परिणाम प्राप्त किया हैसी फ्रीज पिघलना चक्र की संख्या को कम करने के लिए. अपर्याप्त टुकड़ी है हालांकि जब ताजा Accutase साथ Accutase मैं जगह या 1 घंटे के लिए ऊष्मायन समय को बढ़ाने के लिए या तो. इसके अलावा कोमल दोहन में या टुकड़ी सहायता कर सकते हैं कुप्पी या थाली के rinsing. अभिकर्मक के लिए आवश्यक समय के बारे में शुद्ध Nucleofector समाधान करने के लिए कोशिकाओं का जोखिम समय यथासंभव कम किया जाना चाहिए, इस प्रकार सेल अस्तित्व पर उच्च प्रभाव हो गया और किया गया है. इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए सबसे अच्छा तरीका एक समय समानांतर में (कुछ कदमों 2.10-2.15) और नहीं कई transfections में प्रत्येक अभिकर्मक प्रदर्शन करना है.

पछाड़ना दक्षता कम है, तो यह आम तौर पर कम अभिकर्मक दक्षता के कारण नहीं है, लेकिन यह आसानी से प्रवाह cytometry या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग सत्यापित और fluorescently siRNA या एक GFP एन्कोडिंग प्लाज्मिड लेबल किया जा सकता. अधिकतर कारण एक अक्षम siRNA या प्लास्मिड डीएनए है. इन परिस्थितियों में यह (2-3 ग्राम तक) siRNA की राशि बढ़ाने के लिए विचार किया जाना चाहिए याप्लास्मिड डीएनए (अप करने के लिए 1-2 ग्राम) या यदि उपलब्ध हो तो एक अलग siRNA या अभिव्यक्ति वेक्टर उपयोग करने के लिए. वैकल्पिक रूप से, संतोषजनक परिणाम भी एक ही लक्ष्य के विरुद्ध कई अलग siRNAs की एक पूल का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है. इसके अलावा, समय पाठ्यक्रम प्रयोगों सही रूप में आमतौर पर अभिकर्मक के बाद 24 से 72 घंटे के बाद तक पहुँच जाता है जो अधिक से अधिक प्रभाव, की अवधि निर्धारित करने के लिए आवश्यक हो सकता है.

इसके अलावा अभिकर्मक से electroporation द्वारा स्तनधारी कोशिकाओं के अभिकर्मक के लिए अच्छी तरह से स्थापित तकनीक आगे रहे हैं. अकसर लागू प्रणाली कार्गो न्यूक्लिक एसिड के साथ परिसरों फार्म और फिर कोशिकाओं में परिवहन सुविधा कर सकते हैं, जो रासायनिक अभिकर्मक एजेंट हैं. सबसे अधिक इस्तेमाल किया अभिकर्मकों या तो अलग लिपिड प्रजातियों के आधार पर कर रहे हैं या cationic पॉलिमर 3 के एक नंबर से चुना जा सकता है. दोनों एक विविध चयन दृष्टिकोण के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है. ये अभिकर्मक अभिकर्मकों वे आम तौर पर कर रहे हैं कि लाभ की पेशकशइस प्रकार टुकड़ी के लिए आवश्यकता को दूर करने, अधिक समय की आवश्यकता है, और साथ ही साथ पक्षपाती कोशिकाओं के साथ काम नहीं करते, प्रयोग करने में आसान. दुर्भाग्य से, मैक्रोफेज वे इन विट्रो में काफी संख्या में बढ़ना और विदेशी साइटोसोलिक डीएनए 13-15 खिलाफ निर्देशित रक्षा तंत्र के पास नहीं है के रूप में इन तरीकों से transfect बल्कि मुश्किल हैं. इस प्रकार, रासायनिक अभिकर्मक दृष्टिकोण अक्सर सेल व्यवहार्यता की एक गंभीर कमी का परिणाम. वहाँ सफलतापूर्वक मैक्रोफेज में siRNA स्थानांतरित कर सकते हैं, जो रासायनिक अभिकर्मक एजेंट हैं, लेकिन प्रवाह cytometric (2A चित्रा) और फ्लोरोसेंट सूक्ष्म रूप में (चित्रा 2 बी) का विश्लेषण करती है चित्रा 2 में दिखाया गया है हालांकि वे के रूप में कोशिकाओं के रूप में भीतर siRNA के एक ही समरूप वितरण प्राप्त करने में विफल संकेत मिलता है nucleofection द्वारा प्राप्त की. वास्तव में, प्रवाह cytometric डेटा, ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की दो अलग अलग आबादी होती है कि Nucleofecti के बाद कोशिकाओं के रूप में इसी तरह की प्रतिदीप्ति के साथ सबसे पहले एक जनसंख्या से संकेत मिलता हैपर पता चला है और दूसरी और अधिक तीव्र प्रतिदीप्ति साथ एक जनसंख्या है. निश्चित पुष्टि अभी भी आवश्यक है, लेकिन हम पहले आबादी दूसरी आबादी की संभावना बहुत उज्ज्वल agglomerates साथ कोशिकाओं से मेल खाती है, जबकि cytosol के भीतर फ्लोरोसेंट siRNA के एक समरूप वितरण दिखा जो उन कोशिकाओं के साथ समान प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी में है कि लगता है. चित्रा 2A में दिखाया प्रवाह cytometric डेटा सुझाव है कि वैकल्पिक lipofection दृष्टिकोण से सेल प्रति कम siRNA में nucleofection परिणाम है. हालांकि चित्रा 3 में डेटा nucleofection द्वारा शामिल siRNA के भी अपेक्षाकृत छोटी राशि पहले से ही लक्ष्य जीन के 80 से 90% पछाड़ना के लिए पर्याप्त है कि पता चलता है. इसलिए रासायनिक अभिकर्मक के बाद दूसरा आबादी द्वारा शामिल siRNA की अतिरिक्त राशि बहुत संभावना अधिशेष है और आगे बढ़ाने के पछाड़ना दक्षता के लिए अधिक से अवांछित साइड इफेक्ट पैदा करने के लिए इस प्रकार की संभावना है. इसके अलावाउन siRNA अणुओं की संभावना नहीं कार्यात्मक या मुफ्त siRNA अणुओं से कम से कम कम कुशल हैं और लक्ष्य प्रभाव बंद के कारण हो सकता क्योंकि intracellular agglomerates के गठन के पहले से ही अपने आप में अवांछनीय है. इसके अलावा इन agglomerates की वास्तविक प्रकृति को अभी तक स्पष्ट नहीं है. यह इन चमकीले धब्बों siRNA कोशिकाओं द्वारा भली भाँति लेकिन endosomes विफल रही है और siRNA फंस रहे हैं और इसलिए अप्रभावी रहता से बाद में जारी किया गया था यह दर्शाता है कि endosomes का प्रतिनिधित्व करते हैं कि संभव है. वैकल्पिक रूप से स्पॉट intracellularly गठन कर रहे हैं जो agglomerates हो सकता है. रासायनिक अभिकर्मक के कार्यात्मक मूल्यांकन इसलिए पछाड़ना दक्षता पर कोई निश्चित बयान अभी भी दो अलग आबादी के अस्तित्व को इस सब के परिणाम दोनों आबादी का मतलब वर्णन अर्थ यह है कि जैसा कि पहले ही प्रतिकूल है, अभी तक बनाया जा सकता है, लंबित हैं, यह इसलिए के अनुरूप नहीं है या तो आबादी की. कारण है कि nucleofection बेहतर तरीका है.

यानी कार्यक्रमों और जवाबदेही के साथ काम हालांकि के रूप मेंNucleofector समाधान की ition, यह हमारे प्रोटोकॉल उन सिस्टम के लिए हस्तांतरित किया जा सकता है अगर निर्धारित करने की आवश्यकता है, तदनुसार बदल दिया है.

हालांकि, इन सीमाओं के बावजूद प्रोटोकॉल अन्य सभी गैर वायरल दृष्टिकोण से बेहतर है जो THP-1 कोशिकाओं का एक विश्वसनीय और प्रभावी अभिकर्मक उपज है यहाँ प्रस्तुत किया. इस प्रोटोकॉल अन्य सभी पहलुओं में अंतर और सामान्य रूप से और इस तरह के रूप में संभव अभिकर्मक के रूप में छोटे दुष्प्रभाव दिखाने फूट डालना जो THP-1 कोशिकाओं में बदल जीन अभिव्यक्ति के प्रभाव की जांच के लिए सक्षम बनाता है.

Disclosures

इस वीडियो लेख के लिए प्रकाशन लागत Lonza समूह लिमिटेड द्वारा प्रायोजित कर रहे हैं

Acknowledgments

हम प्रकाशन की लागत को कवर द्वारा इस प्रकाशन को प्रायोजित करने के लिए Lonza समूह लिमिटेड के आभारी हैं. हम SL करने के लिए वित्तीय सहायता के लिए und Kultur Wissenschaft ड्यूश Infarktforschungshilfe, विल्हेम-Vaillant-Stiftung, अर्नेस्ट-सोल्वे-Stiftung, और थुरिंगर Ministerium फर Bildung, धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accutase I Sigma-Aldrich A6964
Amino acids, nonessential PAA M11-003
Centrifuge tubes (15 ml) TPP TPP91015
Fetal calf serum (FCS gold) PAA A15-151
Human Monocyte Nucleofector Kit Lonza VPA-1007 Contains Nucleofector Solution, cuvettes, and Pasteur pipettes
Human serum off the clot Lonza C11-020
Isove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) with 25 mM HEPES and 25 mM L-glutamine Lonza 12-722F
Lymphocyte Growth Medium 3 (LGM3) Lonza CC-3211
Mouse T Cell Nucleofector Medium Lonza VZB-1001
Nucleofector 2b Lonza AAD-1001
Penicillin / streptomycin / L-glutamine (100x) Sigma-Aldrich G1146
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Fisher Scientific BP685
Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI 1640) PAA E15-840
siRNA / plasmid
Sodium pyruvate (100 mM) Sigma-Aldrich S8636
THP-1 human leukemia monocytes CLS 300356
Tissue culture flasks (75 cm²; 150 cm²) TPP TPP90076/TPP90151
Tissue culture plates (6-well; 12-well) TPP TPP92406/TPP92012
Tubes (1.5 ml) StarLab S 1615-5500
Water (nuclease-free) or appropriate siRNA/plasmid buffer
X-Vivo 20 with gentamycin Lonza BE04-448Q
β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ricardo, S. D., van Goor, H., Eddy, A. A. Macrophage diversity in renal injury and repair. J Clin Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).
  2. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
  3. Morille, M., Passirani, C., Vonarbourg, A., Clavreul, A., Benoit, J. P. Progress in developing cationic vectors for non-viral systemic gene therapy against cancer. Biomaterials. (24-25), 3477-3496 (2008).
  4. Schnoor, M., et al. Efficient non-viral transfection of THP-1 cells. J Immunol Methods. 344 (2), 109-115 (2009).
  5. Maeß, M. B., Buers, I., Robenek, H., Lorkowski, S. Improved protocol for efficient nonviral transfection of premature THP-1 macrophages. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (5), (2011).
  6. Ma, W., Liu, Y., Ellison, N., Shen, J. Induction of C-X-C chemokine receptor type 7 (CXCR7) switches stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling and phagocytic activity in macrophages linked to atherosclerosis. J Biol Chem. 288 (22), 15481-15494 (2013).
  7. Xie, Q., et al. Cell surface localization of ABCG1 does not require LXR activation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26 (11), 143-144 (2006).
  8. Buers, I., Robenek, H., Lorkowski, S., Nitschke, Y., Severs, N. J., Hofnagel, O. TIP47, a lipid cargo protein involved in macrophage triglyceride metabolism. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (5), 767-773 (2009).
  9. Robenek, H., Buers, I., Hofnagel, O., Lorkowski, S., Severs, N. J. GFP-tagged proteins visualized by freeze-fracture immuno-electron microscopy: A new tool in cellular and molecular medicine. J Cell Mol Med. 13 (7), 1381-1390 (2009).
  10. Guh, J. H., et al. Development of novel adenosine monophosphate-activated protein kinase activators. J Med Chem. 53 (6), 2552-2561 (2010).
  11. Park, E. K., Jung, H. S., Yang, H. I., Yoo, M. C., Kim, C., Kim, K. S. Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli. Inflamm Res. 56 (1), 45-50 (2007).
  12. Maeß, M. B., Wittig, B., Cignarella, A., Lorkowski, S. Reduced PMA enhances the responsiveness of transfected THP-1 macrophages to polarizing stimuli. J Immunol Methods. 402 (1-2), 76-81 (2014).
  13. Angosto, D., et al. Evolution of inflammasome functions in vertebrates: Inflammasome and caspase-1 trigger fish macrophage cell death but are dispensable for the processing of IL-1b. Innate Immun. 18 (6), 815-824 (2012).
  14. Latz, E., Xiao, T. S., Stutz, A. Activation and regulation of the inflammasomes. Nat Rev Immunol. 13 (6), 397-411 (2013).
  15. Muruve, D. A., et al. The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response. Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).

Tags

संक्रमण अंक 91 THP-1 मैक्रोफेज अभिकर्मक electroporation siRNA प्लास्मिड डीएनए प्रोटोकॉल ध्रुवीकरण nucleofection
Nucleofection द्वारा मानव THP-1 मैक्रोफेज की अत्यधिक कुशल अभिकर्मक
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maeß, M. B., Wittig, B.,… More

Maeß, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection. J. Vis. Exp. (91), e51960, doi:10.3791/51960 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter