Summary

Analyse av celle migrasjon innenfor en tre-dimensjonal Kollagen Matrix

Published: October 05, 2014
doi:

Summary

Cell migrasjon er et biologisk fenomen som er involvert i en mengde av fysiologisk, slik som sårheling og immunresponser, og patofysiologiske prosesser, som kreft. Den 3D-migrasjon kollagen matriks-analysen er en allsidig verktøy for å analysere de trekkende egenskaper av forskjellige celletyper innenfor et 3D fysiologisk lignende miljø.

Abstract

Evnen til å migrere er et kjennetegn på ulike celletyper og spiller en avgjørende rolle i flere fysiologiske prosesser, inkludert embryoutvikling, sårheling og immunresponser. Imidlertid er cellemigrasjon også en viktig mekanisme i kreft slik at disse kreftceller til å løsne fra den primære tumor til å begynne metastatisk spredning. I løpet av de siste årene forskjellige cellemigrerings analyser har blitt utviklet for å analysere den vandringsadferd av forskjellige celletyper. Fordi motorisk oppførsel av cellene markert forskjellig mellom en to-dimensjonal (2D), og tre-dimensjonale (3D) miljø kan det antas at analysen av migrering av celler som er innebygd i et 3D-miljø ville gi mer signifikant cellemigrasjon data. Fordelen med den beskrevne 3D kollagenmatriksen migrasjon analysen er at cellene er innleiret i en fysiologisk 3D nettverk av kollagenfibre som representerer den viktigste komponent av ekstracellulær matriks. Grunnettime-lapse videomikros fast cellemigrasjon blir målt slik at bestemmelse av en rekke migrasjonsparametere så vel som deres endringer som respons på pro-trekkende faktorer eller inhibitorer. Ulike celletyper kan analyseres ved hjelp av denne teknikken, inkludert lymfocytter / leukocytter, stamceller og kreftceller. Likeledes kan også celle klynger eller sfæroider bli integrert i kollagenmatriksen samtidig med analyse av utvandring av enkeltceller fra celle klynge / sfæroide inn i kollagen gitteret. Vi konkluderer med at 3D-migrasjon kollagen matriks-analysen er en anvendelig metode for å analysere migreringen av celler i en fysiologisk lignende 3D miljø.

Introduction

Som cellefusjon (for en oversikt se 1,2) celle migrasjon er en annen biologisk fenomen som er involvert i en mengde fysiologiske prosesser, inkludert embryoutvikling, sårheling og immunresponser (for gjennomgang se 3). Imidlertid er evnen til å migrere videre en forutsetning for tumorceller til å metastasere (for gjennomgang se 3,4).

Cell migrering er en kompleks, ennå ikke fullt forstått prosess som er styrt av et samspill av flere signaltransduksjonsveier initieres med forskjellige ligand (f.eks, cytokiner, kjemokiner, vekstfaktorer, hormoner, ekstracellulære matriks-komponenter)-reseptor (for eksempel reseptor tyrosinkinaser, kjemokine reseptorer, inte) interaksjoner fem slutt forårsaker omorganisering av aktin cytoskjelettet samtidig med de- og remontering av fokale vedheft komplekser og inte-mediert signale seks.

<p class = "jove_content"> Å analysere cellemigrasjon flere in vitro og in vivo cellemigrasjon analyser har blitt utviklet de siste tiårene, inkludert Boyden kammer / Transwell analysen 7, scratch analysen / sårheling analysen 8-10, tredimensjonale ( 3D) kollagenmatriksen migrasjon assay 11 så vel som intravital avbildning / mikroskopi (for gjennomgang se 12). Hver av disse cellemigrasjon analyser har fordeler og ulemper, f.eks om kostnader og behov for utstyr, håndtering eller påliteligheten av innhentet data.

Både Boyden kammer / Transwell analysen og scratch analysen / sårheling analysen er enkle, rimelige og velutviklede metoder for å måle celle migrasjon in vitro 7-10. I Boyden kammer / Transwell analyse celler er sådd på toppen av en innsats inneholdende porer (ca. 8 mikrometer i diameter) – den såkalte øvre rom 7. Valgfritt, kan innsatsen være belagt med ekstracellulær mATRIX komponenter, f.eks, fibronektin, kollagen, etc., for å etterligne en mer fysiologisk miljø. Likeledes kan endotelceller dyrkes på toppen av innsatsen og dermed etterligne en endotelcelle barriere 13. De cellene som har gått gjennom porene i løpet av en definert tidsintervall i nedre kammer husing media og kosttilskudd, slik som vekstfaktorer og kjemokiner, blir brukt som et lese-out for å kvantifisere celle migrasjon (eller bloduttredelse).

I scratch analysen / sårtilheling analyse cellene er sådd i form av plater og er vokst til konfluens 10. I avhengighet av de eksperimentelle innstillingsplatene kan være forhåndsbelagt med ekstracellulære matriks-komponenter, slik som fibronektin. Etter å ha laget en ripe / såret ved skraping blir cellemonoskiktet enkeltceller fra hver side av bunnen / såret kan migrere inn i gapet, for derved å fylle / helbredende det 10. Avstanden mellom de to sider av skrape / sår bestemmesi avhengighet av tiden, og brukes som en lese-ut for den vandrende aktiviteten av cellene 10. Imidlertid, for å diskriminere mellom celleproliferasjon (som også kan føre til fylling / helbredelse av grunnen / sår) og cellemigrasjon er det anbefalt å kombinere analysen med time-lapse videomikroskopi og enkelt celle sporing 10.

Men både Boyden kammer / Transwell assay og ripe assay / sårheling analysen, er temmelig ufullkomment om en fysiologisk lignende cellulære miljø. I Boyden kammer / Transwell analysecellene har til å migrere gjennom en pore av plast, mens det i bunnen av assay / sårheling analyseceller sås på en to-dimensjonal pre-belagte plastplate. Likeledes er det velkjent at den vandrende oppførsel skiller seg markant mellom en to-dimensjonal og 3D miljø 3. For eksempel tredimensjonal matrise voksninger av fibroblaster avvike fra fokale og fibrillar sammenvoksninger karakteriseres på to-dimensjonale substrater i sitt innhold av α5β1 og αvβ3 integrinene, paxillin, andre cytoskeletal komponenter, og tyrosinfosforylering av fokus vedheft kinase 14. Likeledes, celler innebygd i et 3D-miljø også vises en endret trekkadferden 15. Således for å analysere cellemigrasjon mer nøyaktig en migreringsanalyse er anbefalt som tillater å måle overføringen av enkeltceller i et 3D fysiologiske eller fysiologisk lignende miljø.

Intravital avbildning / mikroskopi er gull-standarden for måling av cellemigrering innenfor et 3D fysiologisk sammenheng. Dette betyr ikke bare hører til ekstracellulære matriks-celle interaksjoner, men også til interaksjonene mellom forskjellige celletyper, slik som tumor-celler og endotelceller under ekstravasasjon 16 eller lymfocytt handel innen lymfeknute 17, som til dags dato, er mulig på grunn forbedrede fluorescensmikroskopi teknikker, for eksempel 2-fotonkonfokal laser scanning mikroskopi, bruk av vitale fluorescerende fargestoffer og transgene musestammer som uttrykker fluorescerende proteiner derivater 12,16,17. I tillegg kan intra bildebehandling / mikros kombineres med manuell og automatisert celle sporing 18. Imidlertid, på grunn av behovet for en 2-foton konfokal laser-skanning mikroskopi, så vel som dyr (og egnede transgene dyremodeller) intravital avbildning / mikroskopi er en ganske kostnadskrevende teknikk.

For å overvinne begrensningene i Boyden kammer / Transwell analysen og ripe assay / sårheling assay og for å analysere migrering av forskjellige celletyper innenfor et 3D miljø 3D kollagenmatriksen migrering assay ble utviklet 11,19. Derved blir migrerende celler innleiret i en 3D-kollagen fibernett, som mer ligner til in vivo-situasjonen. Conjointly, på grunn av time-lapse video mikros ekte cellemigrasjon måles slik at bestemme strnasjon av flere migrasjonsparametere så vel som deres forandringer i respons på pro-trekkende faktorer eller inhibitorer. Ulike celletyper kan analyseres ved hjelp av denne teknikken, inkludert lymfocytter og leukocytter 11,20, blodkreft stilk / stamceller 21-24, og kreftceller 5,25-29. I tillegg til enkle celler også celleklynger eller sfæroider kan være innebygd i kollagenmatriksen samtidig med analyse av utvandring av enkeltceller fra celle klynge / sfæroide inn i kollagen gitter 30,31.

Denne protokollen gir en oversikt om et enkelt, men kraftig teknikk for å analysere vandringsadferd av forskjellige celletyper innenfor et 3D miljø – en in vitro fremgangsmåte gir resultater som er i nærheten av den in vivo-situasjon.

Protocol

1. Utarbeidelse av Migration Chambers Tilbered en parafinvoks / vaselin (1: 1) blanding og varme inntil blandingen har smeltet. Ved hjelp av en maling-børste og trekke 2-3 lag av parafinvoks / vaselin (1: 1) Bland i midten av glass-slide i henhold til figurene 1B-1D. MERK: Vi bruker vanlige glassplater (76 x 26 x 1,0-1,5 mm (B / D / H)) Påfør smeltet parafinvoks / vaselin mix raskt på glasset lysbilde for å unngå størkning mens du tegner. Sørg for at parafinvoks / vas…

Representative Results

Den brukte 3D-kollagen matrise migrasjon analysen kombinert med time-lapse video-mikroskopi og datastøttet celle sporing gjør for bestemmelse av ulike cellemigrasjon parametere inkludert både populasjonsbasert parameter (f.eks, mener motorisk aktivitet) og enkeltcellebaserte parametere (for eksempel tidspunktet for aktiv bevegelse, hastighet, avstand migrert). Et eksempel på de oppnådde celle sporing datasett, databehandling og datapresentasjons er gitt i figur 2. En celle sporing…

Discussion

Evnen til å migrere er et kjennetegn på kreftceller fire. Uten mulighet til å løsne fra den primære tumor, og til å migrere gjennom den omkringliggende bindevev tumorceller ikke vil være i stand til frø sekundære lesjoner, som er den viktigste årsaken til død nesten alle kreftpasienter. På grunn av dette forholdet mange studier fokuserer på kreft celle migrasjon. Målet med disse studiene er identifisering av nye målmolekyler og mål-baner som effektivt blokkerer tumorcellemigrering, og derved s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Fritz-Bender-Foundation, Munich, Germany

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Leica DM IL inverted microscope Leica, Wetzlar, Germany
Microscope stage heater Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany
JVC C1431 video camera JVC, Bad Vilbel, Germany
Axis 241Q video server Axis communication GmbH, Ismaning, Germany
Mac G5 Computer Apple Macintosh
iMac Apple Macintosh
FileMaker Pro FileMaker GmbH, Unterschleißheim, Germany
Multi-camera video surveillance software(Security Spy) Bensoftware, London, UK
Runtime Revolution Media 2.9.0 RunRev Ltd., Edinburgh, UK
Paraffin Applichem GmbH, Darmstadt, Germany A4264
Petrolatum jelly local drug store
Purecol (liquid collagen) Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands contains 2.9-3.3 mg/ml bovine collagen (95% collagen type I, 5% collagen type IV)
10x MEM Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany M0275
7.5% Sodium Bicarbonate solution Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany S8761
EGF Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany E9644
U73122 Merck Millipore, Darmstadt, Germany 662035 dissolve first in CHCL3; reconstitute in DMSO just prior to use

References

  1. Dittmar, T., Zänker, K. S. . Cell Fusion in Health and Disease. 1, (2011).
  2. Dittmar, T., Zänker, K. S. . Cell Fusion in Health and Disease. 2, (2011).
  3. Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
  4. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  5. Heyder, C., et al. Role of the beta1-integrin subunit in the adhesion, extravasation and migration of T24 human bladder carcinoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 22, 99-106 (2005).
  6. Mitra, S. K., Hanson, D. A., Schlaepfer, D. D. Focal adhesion kinase: in command and control of cell motility. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 56-68 (2005).
  7. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
  8. Haudenschild, C. C., Schwartz, S. M. Endothelial regeneration. II. Restitution of endothelial continuity. Lab. Invest. 41, 407-418 (1979).
  9. Todaro, G. J., Lazar, G. K., Green, H. The initiation of cell division in a contact-inhibited mammalian cell line. J. Cell. Physiol. 66, 325-333 (1965).
  10. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2, 329-333 (2007).
  11. Friedl, P., Noble, P. B., Zänker, K. S. Lymphocyte locomotion in three-dimensional collagen gels. Comparison of three quantitative methods for analysing cell trajectories. J. Immunol. Methods. 165, 157-165 (1993).
  12. Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
  13. Akedo, H., Shinkai, K., Mukai, M., Komatsu, K. Establishment of an experimental model for tumor cell invasion and potentiation and inhibition of the invasive capacity. Gan To Kagaku Ryoho. 14, 2048-2055 (1987).
  14. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
  15. Friedl, P., Brocker, E. B. The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matrix. Cell. Mol. Life Sci. 57, 41-64 (2000).
  16. Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nat. Med. 16, 116-122 (2010).
  17. Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 2604-2609 (2003).
  18. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
  19. Shields, E. D., Noble, P. B. Methodology for detection of heterogeneity of cell locomotory phenotypes in three-dimensional gels. Exp. Cell Biol. 55, 250-256 (1987).
  20. Entschladen, F., Gunzer, M., Scheuffele, C. M., Niggemann, B., Zanker, K. S. T lymphocytes and neutrophil granulocytes differ in regulatory signaling and migratory dynamics with regard to spontaneous locomotion and chemotaxis. Cell. Immunol. 199, 104-114 (2000).
  21. Kasenda, B., et al. The stromal cell-derived factor-1alpha dependent migration of human cord blood CD34 haematopoietic stem and progenitor cells switches from protein kinase C (PKC)-alpha dependence to PKC-alpha independence upon prolonged culture in the presence of Flt3-ligand and interleukin-6. Br. J. Haematol. 142, 831-845 (2008).
  22. Kassmer, S. H., et al. Cytokine combinations differentially influence the SDF-1alpha-dependent migratory activity of cultivated murine hematopoietic stem and progenitor cells. Biol. Chem. 389, 863-872 (2008).
  23. Seidel, J., et al. The neurotransmitter gamma-aminobutyric-acid (GABA) is a potent inhibitor of the stromal cell-derived factor-1. Stem Cells Dev. 16, 827-836 (2007).
  24. Weidt, C., Niggemann, B., Hatzmann, W., Zanker, K. S., Dittmar, T. Differential effects of culture conditions on the migration pattern of stromal cell-derived factor-stimulated hematopoietic stem cells. Stem Cells. 22, 890-896 (2004).
  25. Balz, L. M., et al. The interplay of HER2/HER3/PI3K and EGFR/HER2/PLC-gamma1 signalling in breast cancer cell migration and dissemination. J. Pathol. 227, 234-244 (2012).
  26. Berndt, B., et al. Fusion of CCL21 non-migratory active breast epithelial and breast cancer cells give rise to CCL21 migratory active tumor hybrid cell lines. PLoS ONE. 8, e63711 (2013).
  27. Dittmar, T., et al. Induction of cancer cell migration by epidermal growth factor is initiated by specific phosphorylation of tyrosine 1248 of c-erbB-2 receptor via EGFR. FASEB J. 16, 1823-1825 (2002).
  28. Ozel, C., et al. Hybrid cells derived from breast epithelial cell/breast cancer cell fusion events show a differential RAF-AKT crosstalk. Cell Commun Signal. 10, (2012).
  29. Katterle, Y., et al. Antitumour effects of PLC-gamma1-(SH2)2-TAT fusion proteins on EGFR/c-erbB-2-positive breast cancer cells. Br. J. Cancer. 90, 230-235 (2004).
  30. Friedl, P., et al. Migration of Coordinated Cell Clusters in Mesenchymal and Epithelial Cancer Explants in Vitro. Cancer Res. 55, 4557-4560 (1995).
  31. Keeve, P. L., et al. Characterization and analysis of migration patterns of dentospheres derived from periodontal tissue and the palate. J. Periodontal Res. 48, 276-285 (2013).
  32. Kreger, S. T., et al. Polymerization and matrix physical properties as important design considerations for soluble collagen formulations. Biopolymers. 93, 690-707 (2010).
  33. Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1, 2753-2758 (2006).
  34. Friedl, P., et al. Migration of Highly Aggressive MV3 Melanoma Cells in 3-Dimensional Collagen Lattices Results in Local matrix Reorganization and Shedding of alpha2 and alpha1 Integrins and CD44. Cancer Res. 57, 2061-2070 (1997).
  35. Falasca, M., et al. Activation of phospholipase C gamma by PI 3-kinase-induced PH domain-mediated membrane targeting. EMBO J. 17, 414-422 (1998).
  36. Palm, D., et al. The norepinephrine-driven metastasis development of PC-3 human prostate cancer cells in BALB/c nude mice is inhibited by beta-blockers. Int. J. Cancer. 118, 2744-2749 (2006).
  37. Melhem-Bertrandt, A., et al. Beta-blocker use is associated with improved relapse-free survival in patients with triple-negative breast cancer. J. Clin. Oncol. 29, 2645-2652 (2011).
  38. Dittmar, T., Heyder, C., Gloria-Maercker, E., Hatzmann, W., Zanker, K. S. Adhesion molecules and chemokines: the navigation system for circulating tumor (stem) cells to metastasize in an organ-specific manner. Clin. Exp. Metastasis. 25, 11-32 (2008).
  39. Berndt, B., Zanker, K. S., Dittmar, T. Cell Fusion is a Potent Inducer of Aneuploidy and Drug Resistance in Tumor Cell/ Normal Cell Hybrids. Crit. Rev. Oncog. 18, 97-113 (2013).
  40. Dittmar, T., Nagler, C., Niggemann, B., Zänker, K. S. The dark side of stem cells: triggering cancer progression by cell fusion. Curr.Mol. Med. 13, 735-750 (2013).
  41. Polacheck, W. J., Charest, J. L., Kamm, R. D. Interstitial flow influences direction of tumor cell migration through competing mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 11115-11120 (2011).
  42. Haessler, U., Teo, J. C., Foretay, D., Renaud, P., Swartz, M. A. Migration dynamics of breast cancer cells in a tunable 3D interstitial flow chamber. Integr. Biol. 4, 401-409 (2012).
  43. Zervantonakis, I. K., et al. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 13515-13520 (2012).
  44. Alberts, B., et al. . The extracellular matrix of animals. , (2002).
  45. Humphries, J. D., Byron, A., Humphries, M. J. Integrin ligands at a glance. J. Cell Sci. 119, 3901-3903 (2006).
  46. Reyes-Reyes, M., Mora, N., Gonzalez, G., Rosales, C. beta1 and beta2 integrins activate different signalling pathways in monocytes. Biochem. J. 363, 273-280 (2002).
  47. Di Lullo, G. A., Sweeney, S. M., Korkko, J., Ala-Kokko, L., San Antonio, J. D. Mapping the ligand-binding sites and disease-associated mutations on the most abundant protein in the human, type I collagen. J. Biol. Chem. 277, 4223-4231 (2002).
  48. Mempel, T. R., et al. Regulatory T cells reversibly suppress cytotoxic T cell function independent of effector differentiation. Immunity. 25, 129-141 (2006).
  49. Reiner, T., Earley, S., Turetsky, A., Weissleder, R. Bioorthogonal small-molecule ligands for PARP1 imaging in living cells. Chembiochem. 11, 2374-2377 (2010).

Play Video

Cite This Article
Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zänker, K. S., Dittmar, T. Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix. J. Vis. Exp. (92), e51963, doi:10.3791/51963 (2014).

View Video