Analyse av celle migrasjon innenfor en tre-dimensjonal Kollagen Matrix

Summary

Cell migrasjon er et biologisk fenomen som er involvert i en mengde av fysiologisk, slik som sårheling og immunresponser, og patofysiologiske prosesser, som kreft. Den 3D-migrasjon kollagen matriks-analysen er en allsidig verktøy for å analysere de trekkende egenskaper av forskjellige celletyper innenfor et 3D fysiologisk lignende miljø.

Abstract

Evnen til å migrere er et kjennetegn på ulike celletyper og spiller en avgjørende rolle i flere fysiologiske prosesser, inkludert embryoutvikling, sårheling og immunresponser. Imidlertid er cellemigrasjon også en viktig mekanisme i kreft slik at disse kreftceller til å løsne fra den primære tumor til å begynne metastatisk spredning. I løpet av de siste årene forskjellige cellemigrerings analyser har blitt utviklet for å analysere den vandringsadferd av forskjellige celletyper. Fordi motorisk oppførsel av cellene markert forskjellig mellom en to-dimensjonal (2D), og tre-dimensjonale (3D) miljø kan det antas at analysen av migrering av celler som er innebygd i et 3D-miljø ville gi mer signifikant cellemigrasjon data. Fordelen med den beskrevne 3D kollagenmatriksen migrasjon analysen er at cellene er innleiret i en fysiologisk 3D nettverk av kollagenfibre som representerer den viktigste komponent av ekstracellulær matriks. Grunnettime-lapse videomikros fast cellemigrasjon blir målt slik at bestemmelse av en rekke migrasjonsparametere så vel som deres endringer som respons på pro-trekkende faktorer eller inhibitorer. Ulike celletyper kan analyseres ved hjelp av denne teknikken, inkludert lymfocytter / leukocytter, stamceller og kreftceller. Likeledes kan også celle klynger eller sfæroider bli integrert i kollagenmatriksen samtidig med analyse av utvandring av enkeltceller fra celle klynge / sfæroide inn i kollagen gitteret. Vi konkluderer med at 3D-migrasjon kollagen matriks-analysen er en anvendelig metode for å analysere migreringen av celler i en fysiologisk lignende 3D miljø.

Introduction

Som cellefusjon (for en oversikt se ^1,2) celle migrasjon er en annen biologisk fenomen som er involvert i en mengde fysiologiske prosesser, inkludert embryoutvikling, sårheling og immunresponser (for gjennomgang se ^3). Imidlertid er evnen til å migrere videre en forutsetning for tumorceller til å metastasere (for gjennomgang se ^3,4).

Cell migrering er en kompleks, ennå ikke fullt forstått prosess som er styrt av et samspill av flere signaltransduksjonsveier initieres med forskjellige ligand (f.eks, cytokiner, kjemokiner, vekstfaktorer, hormoner, ekstracellulære matriks-komponenter)-reseptor (for eksempel reseptor tyrosinkinaser, kjemokine reseptorer, inte) interaksjoner ^fem slutt forårsaker omorganisering av aktin cytoskjelettet samtidig med de- og remontering av fokale vedheft komplekser og inte-mediert signale ^seks.

<p class = "jove_content"> Å analysere cellemigrasjon flere in vitro og in vivo cellemigrasjon analyser har blitt utviklet de siste tiårene, inkludert Boyden kammer / Transwell analysen ^7, scratch analysen / sårheling analysen ^8-10, tredimensjonale ( 3D) kollagenmatriksen migrasjon assay ¹¹ så vel som intravital avbildning / mikroskopi (for gjennomgang se ^12). Hver av disse cellemigrasjon analyser har fordeler og ulemper, f.eks om kostnader og behov for utstyr, håndtering eller påliteligheten av innhentet data.

Både Boyden kammer / Transwell analysen og scratch analysen / sårheling analysen er enkle, rimelige og velutviklede metoder for å måle celle migrasjon in vitro ^7-10. I Boyden kammer / Transwell analyse celler er sådd på toppen av en innsats inneholdende porer (ca. 8 mikrometer i diameter) – den såkalte øvre rom ^7. Valgfritt, kan innsatsen være belagt med ekstracellulær mATRIX komponenter, f.eks, fibronektin, kollagen, etc., for å etterligne en mer fysiologisk miljø. Likeledes kan endotelceller dyrkes på toppen av innsatsen og dermed etterligne en endotelcelle barriere ^13. De cellene som har gått gjennom porene i løpet av en definert tidsintervall i nedre kammer husing media og kosttilskudd, slik som vekstfaktorer og kjemokiner, blir brukt som et lese-out for å kvantifisere celle migrasjon (eller bloduttredelse).

I scratch analysen / sårtilheling analyse cellene er sådd i form av plater og er vokst til konfluens ^10. I avhengighet av de eksperimentelle innstillingsplatene kan være forhåndsbelagt med ekstracellulære matriks-komponenter, slik som fibronektin. Etter å ha laget en ripe / såret ved skraping blir cellemonoskiktet enkeltceller fra hver side av bunnen / såret kan migrere inn i gapet, for derved å fylle / helbredende det ^10. Avstanden mellom de to sider av skrape / sår bestemmesi avhengighet av tiden, og brukes som en lese-ut for den vandrende aktiviteten av cellene ^10. Imidlertid, for å diskriminere mellom celleproliferasjon (som også kan føre til fylling / helbredelse av grunnen / sår) og cellemigrasjon er det anbefalt å kombinere analysen med time-lapse videomikroskopi og enkelt celle sporing ^10.

Men både Boyden kammer / Transwell assay og ripe assay / sårheling analysen, er temmelig ufullkomment om en fysiologisk lignende cellulære miljø. I Boyden kammer / Transwell analysecellene har til å migrere gjennom en pore av plast, mens det i bunnen av assay / sårheling analyseceller sås på en to-dimensjonal pre-belagte plastplate. Likeledes er det velkjent at den vandrende oppførsel skiller seg markant mellom en to-dimensjonal og 3D miljø ^3. For eksempel tredimensjonal matrise voksninger av fibroblaster avvike fra fokale og fibrillar sammenvoksninger karakteriseres på to-dimensjonale substrater i sitt innhold av α5β1 og αvβ3 integrinene, paxillin, andre cytoskeletal komponenter, og tyrosinfosforylering av fokus vedheft kinase ^14. Likeledes, celler innebygd i et 3D-miljø også vises en endret trekkadferden ^15. Således for å analysere cellemigrasjon mer nøyaktig en migreringsanalyse er anbefalt som tillater å måle overføringen av enkeltceller i et 3D fysiologiske eller fysiologisk lignende miljø.

Intravital avbildning / mikroskopi er gull-standarden for måling av cellemigrering innenfor et 3D fysiologisk sammenheng. Dette betyr ikke bare hører til ekstracellulære matriks-celle interaksjoner, men også til interaksjonene mellom forskjellige celletyper, slik som tumor-celler og endotelceller under ekstravasasjon ¹⁶ eller lymfocytt handel innen lymfeknute ^17, som til dags dato, er mulig på grunn forbedrede fluorescensmikroskopi teknikker, for eksempel 2-fotonkonfokal laser scanning mikroskopi, bruk av vitale fluorescerende fargestoffer og transgene musestammer som uttrykker fluorescerende proteiner derivater ^12,16,17. I tillegg kan intra bildebehandling / mikros kombineres med manuell og automatisert celle sporing ^18. Imidlertid, på grunn av behovet for en 2-foton konfokal laser-skanning mikroskopi, så vel som dyr (og egnede transgene dyremodeller) intravital avbildning / mikroskopi er en ganske kostnadskrevende teknikk.

For å overvinne begrensningene i Boyden kammer / Transwell analysen og ripe assay / sårheling assay og for å analysere migrering av forskjellige celletyper innenfor et 3D miljø 3D kollagenmatriksen migrering assay ble utviklet ^11,19. Derved blir migrerende celler innleiret i en 3D-kollagen fibernett, som mer ligner til in vivo-situasjonen. Conjointly, på grunn av time-lapse video mikros ekte cellemigrasjon måles slik at bestemme strnasjon av flere migrasjonsparametere så vel som deres forandringer i respons på pro-trekkende faktorer eller inhibitorer. Ulike celletyper kan analyseres ved hjelp av denne teknikken, inkludert lymfocytter og leukocytter ^11,20, blodkreft stilk / stamceller ^21-24, og kreftceller ^5,25-29. I tillegg til enkle celler også celleklynger eller sfæroider kan være innebygd i kollagenmatriksen samtidig med analyse av utvandring av enkeltceller fra celle klynge / sfæroide inn i kollagen gitter ^30,31.

Denne protokollen gir en oversikt om et enkelt, men kraftig teknikk for å analysere vandringsadferd av forskjellige celletyper innenfor et 3D miljø – en in vitro fremgangsmåte gir resultater som er i nærheten av den in vivo-situasjon.

Protocol

1. Utarbeidelse av Migration Chambers Tilbered en parafinvoks / vaselin (1: 1) blanding og varme inntil blandingen har smeltet. Ved hjelp av en maling-børste og trekke 2-3 lag av parafinvoks / vaselin (1: 1) Bland i midten av glass-slide i henhold til figurene 1B-1D. MERK: Vi bruker vanlige glassplater (76 x 26 x 1,0-1,5 mm (B / D / H)) Påfør smeltet parafinvoks / vaselin mix raskt på glasset lysbilde for å unngå størkning mens du tegner. Sørg for at parafinvoks / vas…

Representative Results

Den brukte 3D-kollagen matrise migrasjon analysen kombinert med time-lapse video-mikroskopi og datastøttet celle sporing gjør for bestemmelse av ulike cellemigrasjon parametere inkludert både populasjonsbasert parameter (f.eks, mener motorisk aktivitet) og enkeltcellebaserte parametere (for eksempel tidspunktet for aktiv bevegelse, hastighet, avstand migrert). Et eksempel på de oppnådde celle sporing datasett, databehandling og datapresentasjons er gitt i figur 2. En celle sporing…

Discussion

Evnen til å migrere er et kjennetegn på kreftceller ^fire. Uten mulighet til å løsne fra den primære tumor, og til å migrere gjennom den omkringliggende bindevev tumorceller ikke vil være i stand til frø sekundære lesjoner, som er den viktigste årsaken til død nesten alle kreftpasienter. På grunn av dette forholdet mange studier fokuserer på kreft celle migrasjon. Målet med disse studiene er identifisering av nye målmolekyler og mål-baner som effektivt blokkerer tumorcellemigrering, og derved s…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Leica DM IL inverted microscope	Leica, Wetzlar, Germany
Microscope stage heater	Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany
JVC C1431 video camera	JVC, Bad Vilbel, Germany
Axis 241Q video server	Axis communication GmbH, Ismaning, Germany
Mac G5 Computer	Apple Macintosh
iMac	Apple Macintosh
FileMaker Pro	FileMaker GmbH, Unterschleißheim, Germany
Multi-camera video surveillance software(Security Spy)	Bensoftware, London, UK
Runtime Revolution Media 2.9.0	RunRev Ltd., Edinburgh, UK
Paraffin	Applichem GmbH, Darmstadt, Germany	A4264
Petrolatum jelly	local drug store
Purecol (liquid collagen)	Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands		contains 2.9-3.3 mg/ml bovine collagen (95% collagen type I, 5% collagen type IV)
10x MEM	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	M0275
7.5% Sodium Bicarbonate solution	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	S8761
EGF	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	E9644
U73122	Merck Millipore, Darmstadt, Germany	662035	dissolve first in CHCL3; reconstitute in DMSO just prior to use