تحليل الهجرة خلية داخل الكولاجين مصفوفة ثلاثية الأبعاد
Summary
الهجرة الخلية هي ظاهرة البيولوجية التي تشارك في عدد كبير من الفسيولوجية، مثل التئام الجروح والاستجابات المناعية، والعمليات الفيزيولوجية المرضية، مثل السرطان. فحص الهجرة مصفوفة 3D الكولاجين هو أداة مرنة لتحليل خصائص المهاجرة من أنواع مختلفة من الخلايا داخل في مثل الفسيولوجية للبيئة 3D.
Abstract
القدرة على الهجرة هي السمة المميزة لمختلف أنواع الخلايا ويلعب دورا حاسما في العديد من العمليات الفسيولوجية، بما في ذلك التطور الجنيني، التئام الجروح، والاستجابات المناعية. ومع ذلك، الهجرة الخلية هي أيضا آلية رئيسية في سرطان تمكين هذه الخلايا السرطانية تنفصل عن الورم الرئيسي لبدء الانتشار النقيلي. خلال السنوات الماضية وقد وضعت مختلف المقايسات الهجرة الخلية لتحليل السلوك المهاجرة من أنواع مختلفة من الخلايا. لأن السلوك الحركي الخلايا تختلف بشكل ملحوظ بين ثنائي الأبعاد (2D) وثلاثية الأبعاد (3D) بيئة يمكن افتراض أن تحليل هجرة الخلايا التي هي جزء لا يتجزأ ضمن بيئة 3D سيحقق في الهجرة الخلية أكثر أهمية البيانات. ميزة لل3D الكولاجين مصفوفة فحص الهجرة وصفها هي أن الخلايا هي جزء لا يتجزأ ضمن شبكة 3D الفسيولوجية للألياف الكولاجين التي تمثل عنصرا رئيسيا في المصفوفة خارج الخلية. نظرا ليتم قياس الوقت الفاصل بين المجهري الفيديو خلية حقيقية الهجرة السماح تحديد العديد من المعلمات الهجرة وكذلك التعديلات في استجابة لعوامل الموالية للالمهاجرة أو مثبطات. يمكن تحليل مختلف أنواع الخلايا باستخدام هذه التقنية، بما في ذلك الخلايا الليمفاوية / الكريات البيضاء، والخلايا الجذعية، والخلايا السرطانية. وبالمثل، يمكن أن تكون جزءا لا يتجزأ أيضا مجموعات الخلايا أو الأجسام الشبه الكروية داخل يصاحب ذلك الكولاجين مصفوفة مع تحليل للهجرة الخلايا واحد من الكتلة الخلوية / كروي في شعرية الكولاجين. نستنتج أن 3D الكولاجين مصفوفة فحص الهجرة هي طريقة تنوعا لتحليل هجرة الخلايا في بيئة 3D الفسيولوجية مثل.
Introduction
مثل انصهار الخلية (لمحة عامة نرى 1،2) الهجرة الخلية هي ظاهرة بيولوجية أخرى التي تشارك في عدد كبير من العمليات الفسيولوجية بما في ذلك التطور الجنيني، التئام الجروح والاستجابات المناعية (للمراجعة رؤية 3). ومع ذلك، فإن القدرة على الهجرة هي أيضا شرط أساسي لخلايا الورم إلى metastasize (للمراجعة نرى 3،4).
الهجرة الخلية هي عملية معقدة، غير مفهومة تماما العملية التي يتم من إخراج التفاعل بين عدة مسارات نقل الإشارة التي بدأها مختلف يجند (على سبيل المثال، السيتوكينات، كيموكينات، عوامل النمو والهرمونات ومكونات المصفوفة خارج الخلية) مستقبلات (مثل مستقبلات التيروزين كيناز، مستقبلات chemokine، integrins) التفاعلات 5 مما تسبب في نهاية المطاف إعادة تنظيم الهيكل الخلوي الأكتين مع ما يصاحب ذلك اجتثاث وإعادة التجميع المجمعات التصاق التنسيق وإنتغرين بوساطة إشارات 6.
<p clasوقد تم تطوير ق = "jove_content"> تحليل الهجرة الخلية عدة في المختبر والمجراة المقايسات الهجرة خلية في العقود الماضية، بما في ذلك فحص غرفة بويدن / transwell 7، الصفر فحص / فحص 8-10 التئام الجروح، ثلاثي الأبعاد ( 3D) الكولاجين مصفوفة فحص الهجرة 11 وكذلك حيوي داخلي التصوير / المجهري (للمراجعة نرى 12). كل من هذه المقايسات الهجرة الخلية لديه إيجابيات وسلبيات، على سبيل المثال، بشأن التكاليف والحاجة لمعدات والمناولة أو موثوقية البيانات التي تم الحصول عليها.كل من غرفة بويدن / transwell الفحص وفحص الصفر / التئام الجروح الفحص سهلة ومنخفضة التكلفة وفحوصات متطورة لقياس الهجرة الخلية في المختبر 7-10. في غرفة بويدن / والمصنف transwell خلايا فحص على رأس لإدراج تحتوي على مسام (حوالي 8 ميكرون في القطر) – ما يسمى المقصورة العلوية 7. اختياري، يمكن أن تكون مغلفة مع إدراج متر خارج الخليةمكونات ATRIX، على سبيل المثال، فبرونيكتين، والكولاجين وغيرها، لتحاكي بيئة أكثر الفسيولوجية. وبالمثل، يمكن زراعة الخلايا البطانية فوق إدراج، وبالتالي محاكاة حاجز الخلايا البطانية 13. تلك الخلايا التي مرت من خلال المسام خلال فترة زمنية محددة في أقل مقصورة إيواء وسائل الإعلام والمكملات الغذائية، مثل عوامل النمو وكيموكينات، وتستخدم باعتبارها من قراءة لقياس الهجرة الخلية (أو التسرب).
في مقايسة خدش / هي المصنفة التئام الجروح فحص خلايا في لوحات، ونمت لconfluency 10. في اعتماد لوحات تجريبية يمكن وضع ما قبل المغلفة مع مكونات المصفوفة خارج الخلية، مثل فبرونيكتين. بعد إنشاء نقطة الصفر / الجرح عن طريق كشط الخلايا وحيدة الخلية أحادي الطبقة من كل جانب من الصفر / الجرح يمكن أن تهاجر إلى الفجوة، وبالتالي ملء / 10 فإنه شفاء. يتم تحديد المسافة بين الجانبين من الصفر / الجروحفي الاعتماد من الوقت ويستخدم كأساس التدريجي قراءة لنشاط الهجرة من الخلايا 10. ومع ذلك، للتمييز بين تكاثر الخلايا (التي يمكن أن يؤدي أيضا إلى ملء / الشفاء من الصفر / الجرح) وهجرة الخلايا فمن المستحسن أن الجمع بين الفحص مع مرور الزمن المجهري الفيديو وحيدة الخلية تتبع 10.
ومع ذلك، فإن كلا من غرفة بويدن / transwell فحص والصفر فحص / فحص التئام الجروح، والكمال بدلا بشأن بيئة الخلوية الفسيولوجية مثل. في غرفة بويدن / فحص خلايا transwell يجب أن تهاجر من خلال المسام البلاستيك، في حين أنه في نقطة الصفر هي المصنفة فحص / فحص خلايا التئام الجروح على مغلفة مسبقا لوحة من البلاستيك ثنائية الأبعاد. وبالمثل، فمن المسلم به جيدا أن سلوك الهجرة يختلف بشكل ملحوظ بين بيئة ثنائية الأبعاد 3D و3. على سبيل المثال، التصاقات ثلاثي الأبعاد مصفوفة من الخلايا الليفية تختلف من الالتصاقات البؤرية وييفي تتميز على اثنينركائز الابعاد في محتواها من α5β1 وintegrins αvβ3، paxillin، مكونات هيكل الخلية الأخرى، والتيروزين الفسفرة من الالتصاق البؤري كيناز 14. وبالمثل، كما عرض جزءا لا يتجزأ من الخلايا في بيئة 3D سلوك الهجرة غيرت 15. وبالتالي لتحليل الهجرة الخلية بشكل أكثر دقة ينصح فحص الهجرة السماح لقياس هجرة الخلايا واحد ضمن بيئة الفسيولوجية أو تشبه الفسيولوجية-3D.
حيوي داخلي التصوير / المجهري هو الذهب القياسية لقياس الهجرة الخلية في سياق الفسيولوجية 3D. هذا لا ينتمي فقط إلى خارج الخلية التفاعلات خلية مصفوفة، ولكن أيضا إلى التفاعلات بين أنواع مختلفة من الخلايا، مثل الخلايا السرطانية والخلايا البطانية تسرب خلال 16 أو الاتجار اللمفاويات ضمن العقدة الليمفاوية 17، والتي، حتى الآن، هو ممكن نظرا ل تحسين تقنيات مضان المجهري، مثل 2 الفوتونمتحد البؤر المجهر الليزر، واستخدام الأصباغ الفلورية الحيوية وسلالات الفئران المعدلة وراثيا معربا عن البروتينات الفلورية المشتقات 12،16،17. بالإضافة إلى ذلك، يمكن الجمع حيوي داخلي التصوير / المجهري مع خلية تتبع اليدوي والآلي 18. ومع ذلك، بسبب الحاجة ل2 الفوتون الليزر متحد البؤر المجهر وكذلك الحيوانات (والنماذج الحيوانية المعدلة وراثيا المناسبة) حيوي داخلي التصوير / المجهري هو أسلوب بدلا كثيفة التكلفة.
للتغلب على القيود المفروضة على بويدن غرفة / transwell الفحص وفحص الصفر / التئام الجروح فحص وتحليل الهجرة من أنواع مختلفة من الخلايا في بيئة 3D تم تطوير 3D الكولاجين مصفوفة فحص الهجرة 11،19. وبالتالي، يتم تضمين الخلايا المهاجرة ضمن شبكة ألياف الكولاجين 3D، والذي يشبه إلى المزيد من المجراة الوضع. سوية، بسبب ضيق الوقت الفاصل بين المجهري الفيديو خلية حقيقية الهجرة يقاس السماح للdetermiأمة من العديد من المعلمات الهجرة وكذلك التعديلات في استجابة لعوامل الموالية للالمهاجرة أو مثبطات. يمكن تحليل مختلف أنواع الخلايا باستخدام هذه التقنية، بما في ذلك الخلايا الليمفاوية وكريات الدم البيضاء 11،20، الجذعية المكونة للدم / الخلايا الاصلية 21-24، والخلايا السرطانية 5،25-29. بالإضافة إلى خلايا مفردة أو مجموعات الخلية أيضا يمكن أن تكون جزءا لا يتجزأ الكروية داخل يصاحب ذلك الكولاجين مصفوفة مع تحليل للهجرة الخلايا واحد من الكتلة الخلوية / كروي في الكولاجين شعرية 30،31.
يعرض هذا البروتوكول لمحة عامة عن تقنية بسيطة، ولكنها قوية لتحليل السلوك المهاجرة من أنواع مختلفة من الخلايا في بيئة 3D – طريقة في المختبر العائد في النتائج التي هي قريبة من الوضع في الجسم الحي.
Protocol
Representative Results
Discussion
القدرة على الهجرة هي السمة المميزة للخلايا السرطانية 4. دون القدرة على الانفصال عن الورم الرئيسي وللهجرة من خلال المحيطة الخلايا السرطانية الأنسجة الضامة لن تكون قادرة على البذور الآفات الثانوية، والتي هي السبب الرئيسي للوفاة في مرضى السرطان تقريبا. بسبب هذه ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Fritz-Bender-Foundation, Munich, Germany
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Leica DM IL inverted microscope | Leica, Wetzlar, Germany | ||
| Microscope stage heater | Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany | ||
| JVC C1431 video camera | JVC, Bad Vilbel, Germany | ||
| Axis 241Q video server | Axis communication GmbH, Ismaning, Germany | ||
| Mac G5 Computer | Apple Macintosh | ||
| iMac | Apple Macintosh | ||
| FileMaker Pro | FileMaker GmbH, Unterschleißheim, Germany | ||
| Multi-camera video surveillance software(Security Spy) | Bensoftware, London, UK | ||
| Runtime Revolution Media 2.9.0 | RunRev Ltd., Edinburgh, UK | ||
| Paraffin | Applichem GmbH, Darmstadt, Germany | A4264 | |
| Petrolatum jelly | local drug store | ||
| Purecol (liquid collagen) | Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands | contains 2.9-3.3 mg/ml bovine collagen (95% collagen type I, 5% collagen type IV) | |
| 10x MEM | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | M0275 | |
| 7.5% Sodium Bicarbonate solution | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | S8761 | |
| EGF | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | E9644 | |
| U73122 | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | 662035 | dissolve first in CHCL3; reconstitute in DMSO just prior to use |
References
- Dittmar, T., Zänker, K. S. . Cell Fusion in Health and Disease. 1, (2011).
- Dittmar, T., Zänker, K. S. . Cell Fusion in Health and Disease. 2, (2011).
- Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Heyder, C., et al. Role of the beta1-integrin subunit in the adhesion, extravasation and migration of T24 human bladder carcinoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 22, 99-106 (2005).
- Mitra, S. K., Hanson, D. A., Schlaepfer, D. D. Focal adhesion kinase: in command and control of cell motility. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 56-68 (2005).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Haudenschild, C. C., Schwartz, S. M. Endothelial regeneration. II. Restitution of endothelial continuity. Lab. Invest. 41, 407-418 (1979).
- Todaro, G. J., Lazar, G. K., Green, H. The initiation of cell division in a contact-inhibited mammalian cell line. J. Cell. Physiol. 66, 325-333 (1965).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2, 329-333 (2007).
- Friedl, P., Noble, P. B., Zänker, K. S. Lymphocyte locomotion in three-dimensional collagen gels. Comparison of three quantitative methods for analysing cell trajectories. J. Immunol. Methods. 165, 157-165 (1993).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Akedo, H., Shinkai, K., Mukai, M., Komatsu, K. Establishment of an experimental model for tumor cell invasion and potentiation and inhibition of the invasive capacity. Gan To Kagaku Ryoho. 14, 2048-2055 (1987).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Friedl, P., Brocker, E. B. The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matrix. Cell. Mol. Life Sci. 57, 41-64 (2000).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nat. Med. 16, 116-122 (2010).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 2604-2609 (2003).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
- Shields, E. D., Noble, P. B. Methodology for detection of heterogeneity of cell locomotory phenotypes in three-dimensional gels. Exp. Cell Biol. 55, 250-256 (1987).
- Entschladen, F., Gunzer, M., Scheuffele, C. M., Niggemann, B., Zanker, K. S. T lymphocytes and neutrophil granulocytes differ in regulatory signaling and migratory dynamics with regard to spontaneous locomotion and chemotaxis. Cell. Immunol. 199, 104-114 (2000).
- Kasenda, B., et al. The stromal cell-derived factor-1alpha dependent migration of human cord blood CD34 haematopoietic stem and progenitor cells switches from protein kinase C (PKC)-alpha dependence to PKC-alpha independence upon prolonged culture in the presence of Flt3-ligand and interleukin-6. Br. J. Haematol. 142, 831-845 (2008).
- Kassmer, S. H., et al. Cytokine combinations differentially influence the SDF-1alpha-dependent migratory activity of cultivated murine hematopoietic stem and progenitor cells. Biol. Chem. 389, 863-872 (2008).
- Seidel, J., et al. The neurotransmitter gamma-aminobutyric-acid (GABA) is a potent inhibitor of the stromal cell-derived factor-1. Stem Cells Dev. 16, 827-836 (2007).
- Weidt, C., Niggemann, B., Hatzmann, W., Zanker, K. S., Dittmar, T. Differential effects of culture conditions on the migration pattern of stromal cell-derived factor-stimulated hematopoietic stem cells. Stem Cells. 22, 890-896 (2004).
- Balz, L. M., et al. The interplay of HER2/HER3/PI3K and EGFR/HER2/PLC-gamma1 signalling in breast cancer cell migration and dissemination. J. Pathol. 227, 234-244 (2012).
- Berndt, B., et al. Fusion of CCL21 non-migratory active breast epithelial and breast cancer cells give rise to CCL21 migratory active tumor hybrid cell lines. PLoS ONE. 8, e63711 (2013).
- Dittmar, T., et al. Induction of cancer cell migration by epidermal growth factor is initiated by specific phosphorylation of tyrosine 1248 of c-erbB-2 receptor via EGFR. FASEB J. 16, 1823-1825 (2002).
- Ozel, C., et al. Hybrid cells derived from breast epithelial cell/breast cancer cell fusion events show a differential RAF-AKT crosstalk. Cell Commun Signal. 10, (2012).
- Katterle, Y., et al. Antitumour effects of PLC-gamma1-(SH2)2-TAT fusion proteins on EGFR/c-erbB-2-positive breast cancer cells. Br. J. Cancer. 90, 230-235 (2004).
- Friedl, P., et al. Migration of Coordinated Cell Clusters in Mesenchymal and Epithelial Cancer Explants in Vitro. Cancer Res. 55, 4557-4560 (1995).
- Keeve, P. L., et al. Characterization and analysis of migration patterns of dentospheres derived from periodontal tissue and the palate. J. Periodontal Res. 48, 276-285 (2013).
- Kreger, S. T., et al. Polymerization and matrix physical properties as important design considerations for soluble collagen formulations. Biopolymers. 93, 690-707 (2010).
- Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1, 2753-2758 (2006).
- Friedl, P., et al. Migration of Highly Aggressive MV3 Melanoma Cells in 3-Dimensional Collagen Lattices Results in Local matrix Reorganization and Shedding of alpha2 and alpha1 Integrins and CD44. Cancer Res. 57, 2061-2070 (1997).
- Falasca, M., et al. Activation of phospholipase C gamma by PI 3-kinase-induced PH domain-mediated membrane targeting. EMBO J. 17, 414-422 (1998).
- Palm, D., et al. The norepinephrine-driven metastasis development of PC-3 human prostate cancer cells in BALB/c nude mice is inhibited by beta-blockers. Int. J. Cancer. 118, 2744-2749 (2006).
- Melhem-Bertrandt, A., et al. Beta-blocker use is associated with improved relapse-free survival in patients with triple-negative breast cancer. J. Clin. Oncol. 29, 2645-2652 (2011).
- Dittmar, T., Heyder, C., Gloria-Maercker, E., Hatzmann, W., Zanker, K. S. Adhesion molecules and chemokines: the navigation system for circulating tumor (stem) cells to metastasize in an organ-specific manner. Clin. Exp. Metastasis. 25, 11-32 (2008).
- Berndt, B., Zanker, K. S., Dittmar, T. Cell Fusion is a Potent Inducer of Aneuploidy and Drug Resistance in Tumor Cell/ Normal Cell Hybrids. Crit. Rev. Oncog. 18, 97-113 (2013).
- Dittmar, T., Nagler, C., Niggemann, B., Zänker, K. S. The dark side of stem cells: triggering cancer progression by cell fusion. Curr.Mol. Med. 13, 735-750 (2013).
- Polacheck, W. J., Charest, J. L., Kamm, R. D. Interstitial flow influences direction of tumor cell migration through competing mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 11115-11120 (2011).
- Haessler, U., Teo, J. C., Foretay, D., Renaud, P., Swartz, M. A. Migration dynamics of breast cancer cells in a tunable 3D interstitial flow chamber. Integr. Biol. 4, 401-409 (2012).
- Zervantonakis, I. K., et al. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 13515-13520 (2012).
- Alberts, B., et al. . The extracellular matrix of animals. , (2002).
- Humphries, J. D., Byron, A., Humphries, M. J. Integrin ligands at a glance. J. Cell Sci. 119, 3901-3903 (2006).
- Reyes-Reyes, M., Mora, N., Gonzalez, G., Rosales, C. beta1 and beta2 integrins activate different signalling pathways in monocytes. Biochem. J. 363, 273-280 (2002).
- Di Lullo, G. A., Sweeney, S. M., Korkko, J., Ala-Kokko, L., San Antonio, J. D. Mapping the ligand-binding sites and disease-associated mutations on the most abundant protein in the human, type I collagen. J. Biol. Chem. 277, 4223-4231 (2002).
- Mempel, T. R., et al. Regulatory T cells reversibly suppress cytotoxic T cell function independent of effector differentiation. Immunity. 25, 129-141 (2006).
- Reiner, T., Earley, S., Turetsky, A., Weissleder, R. Bioorthogonal small-molecule ligands for PARP1 imaging in living cells. Chembiochem. 11, 2374-2377 (2010).
