JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Bioengineering

Analyse af Cell Migration inden for en tre-dimensionel kollagenmatrix

Published: October 05, 2014
doi:
10.3791/51963
, , , ,
1Institute of Immunology & Experimental Oncology, Center for Biomedical Education and Research (ZBAF),Witten/Herdecke University

Summary

Cell migration er et biologisk fænomen, der er involveret i en overflod af fysiologiske, såsom sårheling og immunresponser, og patofysiologiske processer, som kræft. 3D-collagenmatrix migration assay er et alsidigt værktøj til at analysere den migrerende egenskaber af forskellige celletyper inden i en 3D fysiologisk-lignende miljø.

Abstract

Evnen til at migrere er kendetegnende for forskellige celletyper og spiller en afgørende rolle i flere fysiologiske processer, herunder embryonisk udvikling, sårheling og immunresponser. Men celle migration er også en vigtig mekanisme i kræft give disse kræftceller til at løsne sig fra den primære tumor for at starte metastatisk spredning. Inden for de seneste år er der udviklet forskellige celle migration assays til at analysere vandringsadfærd forskellige celletyper. Fordi bevægelsesadfærd af celler adskiller sig markant mellem en todimensional (2D) og tre-dimensionelle (3D) miljø kan det antages, at analysen af ​​migrationen af ​​celler, der er indlejret i et 3D-miljø ville give mere markant cellemigration data. Fordelen ved den beskrevne 3D collagenmatrix migration assay er, at cellerne er indlejret inden for en fysiologisk 3D netværk af collagenfibre, der repræsenterer den største komponent af den ekstracellulære matrix. På grund aftime-lapse video mikroskopi virkelige celle migration målt tillader bestemmelse af flere migration parametre samt deres ændringer som reaktion på pro-migrerende faktorer eller inhibitorer. Forskellige celletyper kan analyseres ved hjælp af denne teknik, herunder lymfocytter / leukocytter, stamceller, og tumorceller. Ligeledes kunne også celle klynger eller sphæroider være indlejret i kollagenmatrixen samtidig med analyse af emigration af enkelte celler fra cellen klynge / klumpformet i kollagengitter. Vi konkluderer, at 3D-collagenmatrix migration assay er en alsidig metode til at analysere migration af celler i en fysiologisk-lignende 3D-miljø.

Introduction

Ligesom cellefusion (for en oversigt se 1,2) celle migration er en anden biologisk fænomen, der er involveret i et utal af fysiologiske processer, herunder fosterudvikling, sårheling og immunreaktioner (til gennemgang se 3). Evnen til at migrere er også en forudsætning for tumorceller metastaserer (for en gennemgang se 3,4).

Cellemigrering er et komplekst, endnu ikke fuldt forstået proces, der er styret af samspillet af flere signaltransduktionsveje initieres af forskellige ligand (fx cytokiner, kemokiner, vækstfaktorer, hormoner, extracellulære matrixkomponenter) receptor (f.eks receptortyrosinkinaser, kemokinreceptorer, integriner) interaktioner 5 i sidste ende forårsager reorganisering af actincytoskelettet samtidig med de- og samling af fokale vedhæftning komplekser og integrin-medieret signalering 6.

<p class = "jove_content"> At analysere cellemigrering flere in vitro og in vivo celle migration assays er blevet udviklet i de seneste årtier, herunder Boydenkammer / transwell assay 7, scratch assay / sårheling assay 8-10, tre-dimensionelle ( 3D) collagenmatrix migration assay 11 samt intravital billedbehandling / mikroskopi (for en gennemgang se 12). Hver af disse celle migration assays har fordele og ulemper, f.eks vedrørende omkostninger og behov for udstyr, håndtering eller pålideligheden af opnåede data.

Både Boydenkammer / transwell analysen og scratch-analysen / sårheling assay er nemme, billige og veludviklede assays til at måle celle migration in vitro 7-10. I Boydenkammer / transwell assay celler podes på toppen af en indsats, der indeholder porer (ca. 8 um i diameter) – den såkaldte øvre kammer 7. Valgfrit, kan indsatsen være coatet med ekstracellulære mATRIX komponenter, fx fibronectin, kollagen, etc., for at efterligne en mere fysiologisk miljø. Ligeledes kunne endotelceller dyrkes på toppen af indsatsen, og dermed efterligne en endotelcelle barriere 13. De celler, der har passeret gennem porerne i løbet af et bestemt tidsinterval i det nedre rum huser medier og kosttilskud, såsom vækstfaktorer og chemokiner, der bruges som en udlæsning at kvantificere celle migration (eller ekstravasation).

I bunden assayet / sårhelings- assay celler podes i plader og dyrkes til konfluens 10. I afhængighed af de eksperimentelle indstilling plader kan præ-coatet med ekstracellulære matrixkomponenter, såsom fibronectin. Efter oprettelse af en ridse / sår ved skrabning cellemonolaget enkelte celler fra hver side af bunden / sår kan migrere ind i hullet, og derved fylde / healing det 10. Afstanden mellem de to sider af scratch / sår bestemmesi afhængighed af tid og anvendes som en udlæsning for vandrende aktivitet af cellerne 10. For at skelne mellem celleproliferation (der også kunne resultere i opfyldning / heling af bunden / sår) og cellemigration anbefales det at kombinere assayet med time-lapse video mikroskopi og enkelt celle sporing 10.

Men både Boydenkammer / transwell assay og ridser assay / sårheling assay er en ufuldstændig om en fysiologisk-lignende cellulære miljø. I Boydenkammer / transwell assay celler har til at migrere gennem en plast pore, mens der i bunden assayet / sårheling assay celler podet på en todimensional præ-coatede plastplade. Ligeledes er det velkendt, at vandringsadfærd varierer markant mellem en to-dimensionel og 3D-miljø 3. For eksempel tredimensionale matrix adhærencer fibroblaster afviger fra fokale og fibrillære adhæsioner karakteriseret på todimensionale substrater i deres indhold af α5β1 og αvβ3 integriner paxillin andre cytoskeletale komponenter, og tyrosinphosphorylering af fokal adhæsionkinase 14. Ligeledes celler indlejret i et 3D-miljø vises også en ændret vandringsadfærd 15. Således at analysere cellemigrering mere præcist en migration assay anbefales gør det muligt at måle migreringen af ​​enkelte celler i en 3D fysiologisk eller fysiologisk-lignende miljø.

Intravital billedbehandling / mikroskopi er guld-standard for måling celle migration inden en 3D-fysiologisk kontekst. Dette betyder ikke kun hører til ekstracellulære matrix-celle-interaktioner, men også til vekselvirkninger mellem forskellige celletyper, såsom tumorceller og endotelceller under ekstravasation 16 eller lymfocyttrafik i lymfeknude 17, som til dato er muligt på grund forbedrede fluorescens mikroskopi teknikker, såsom 2-fotonkonfokal laser scanning mikroskopi, anvendelse af vitale fluorescerende farvestoffer og transgene musestammer, der udtrykker fluorescerende proteiner derivater 12,16,17. Derudover kunne intravital billedbehandling / mikroskopi kombineres med manuel og automatiseret celle sporing 18. Men på grund af nødvendigheden af ​​en 2-foton konfokal laser scanning mikroskopi samt dyr (og egnede transgene dyremodeller) intravital billedbehandling / mikroskopi er en temmelig omkostningstung teknik.

For at overvinde begrænsningerne i Boyden kammer / transwell assay og bunden assayet / sårheling analyse og analysere migrationen af forskellige celletyper i et 3D-miljø 3D collagenmatrix migration assay blev udviklet 11,19. Derved er migrerende celler indlejret i en 3D-kollagen fibernet, som mere minder om en in vivo-situationen. Forening, som følge af time-lapse video mikroskopi virkelige celle migration målt tillader determination af flere migration parametre samt deres ændringer i respons på pro-migrerende faktorer eller inhibitorer. Forskellige celletyper kan analyseres ved hjælp af denne teknik, herunder lymfocytter og leukocytter 11,20, hæmatopoietiske stamceller / progenitorceller 21-24, og tumorceller 5,25-29. Ud over enkelte celler også celleklyngerne eller spheroids kunne være indlejret i kollagenmatrixen samtidig med analyse af emigration af enkelte celler fra cellen klynge / klumpformet i kollagengitter 30,31.

Denne protokol indeholder en oversigt over en enkel, men kraftfuld teknik til at analysere vandringsadfærd forskellige celletyper i et 3D-miljø – en in vitro metode, der giver i resultater, der er tæt på in vivo situationen.

Protocol

1. Fremstilling af Migration Chambers Forbered en paraffin / vaseline (1: 1) mix og varme, indtil blandingen er smeltet. Ved hjælp af en pensel og trække 2-3 lag af paraffin / vaseline (1: 1) blandes i midten af objektglasset i henhold til figurerne 1B-1D. BEMÆRK: Vi bruger almindelige objektglas (76 x 26 x 1,0-1,5 mm (B / D / H)) Påfør den smeltede paraffin / vaseline mix hurtigt på objektglasset for at undgå størkning under tegning. Sørg for paraffin / vaseline lag…

Representative Results

Den anvendte 3D-kollagenmatrix migration assay kombineret med time-lapse video mikroskopi og computer-assisteret cellesporing giver mulighed for bestemmelse af forskellige celle migration parametre, herunder både befolkning-baserede parameter (fx betyde motorisk aktivitet) og enkeltparametre cellebaserede (fx tidspunkt for aktiv bevægelse, hastighed, distance migreret). Et eksempel på de opnåede cellesporing datasæt, databehandling og datapræsentation er givet i figur 2. En celle…

Discussion

Evnen til at migrere er kendetegnende for tumorceller 4. Uden evnen til at løsne sig fra den primære tumor og til at vandre gennem de omgivende bindevæv tumorceller vil ikke være i stand til at pode sekundære læsioner, som er den vigtigste dødsårsag for næsten alle cancerpatienter. På grund af dette forhold mange undersøgelser fokuserer på kræft celle migration. Formålet med disse undersøgelser er identifikationen af ​​nye målmolekyler og målrette veje, der effektivt blokerer tumorcellemi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Fritz-Bender-Foundation, Munich, Germany

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Leica DM IL inverted microscope Leica, Wetzlar, Germany
Microscope stage heater Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany
JVC C1431 video camera JVC, Bad Vilbel, Germany
Axis 241Q video server Axis communication GmbH, Ismaning, Germany
Mac G5 Computer Apple Macintosh
iMac Apple Macintosh
FileMaker Pro FileMaker GmbH, Unterschleißheim, Germany
Multi-camera video surveillance software(Security Spy) Bensoftware, London, UK
Runtime Revolution Media 2.9.0 RunRev Ltd., Edinburgh, UK
Paraffin Applichem GmbH, Darmstadt, Germany A4264
Petrolatum jelly local drug store
Purecol (liquid collagen) Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands contains 2.9-3.3 mg/ml bovine collagen (95% collagen type I, 5% collagen type IV)
10x MEM Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany M0275
7.5% Sodium Bicarbonate solution Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany S8761
EGF Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany E9644
U73122 Merck Millipore, Darmstadt, Germany 662035 dissolve first in CHCL3; reconstitute in DMSO just prior to use
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dittmar, T., Zänker, K. S. . Cell Fusion in Health and Disease. 1, (2011).
  2. Dittmar, T., Zänker, K. S. . Cell Fusion in Health and Disease. 2, (2011).
  3. Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
  4. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  5. Heyder, C., et al. Role of the beta1-integrin subunit in the adhesion, extravasation and migration of T24 human bladder carcinoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 22, 99-106 (2005).
  6. Mitra, S. K., Hanson, D. A., Schlaepfer, D. D. Focal adhesion kinase: in command and control of cell motility. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 56-68 (2005).
  7. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
  8. Haudenschild, C. C., Schwartz, S. M. Endothelial regeneration. II. Restitution of endothelial continuity. Lab. Invest. 41, 407-418 (1979).
  9. Todaro, G. J., Lazar, G. K., Green, H. The initiation of cell division in a contact-inhibited mammalian cell line. J. Cell. Physiol. 66, 325-333 (1965).
  10. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2, 329-333 (2007).
  11. Friedl, P., Noble, P. B., Zänker, K. S. Lymphocyte locomotion in three-dimensional collagen gels. Comparison of three quantitative methods for analysing cell trajectories. J. Immunol. Methods. 165, 157-165 (1993).
  12. Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
  13. Akedo, H., Shinkai, K., Mukai, M., Komatsu, K. Establishment of an experimental model for tumor cell invasion and potentiation and inhibition of the invasive capacity. Gan To Kagaku Ryoho. 14, 2048-2055 (1987).
  14. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
  15. Friedl, P., Brocker, E. B. The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matrix. Cell. Mol. Life Sci. 57, 41-64 (2000).
  16. Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nat. Med. 16, 116-122 (2010).
  17. Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 2604-2609 (2003).
  18. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
  19. Shields, E. D., Noble, P. B. Methodology for detection of heterogeneity of cell locomotory phenotypes in three-dimensional gels. Exp. Cell Biol. 55, 250-256 (1987).
  20. Entschladen, F., Gunzer, M., Scheuffele, C. M., Niggemann, B., Zanker, K. S. T lymphocytes and neutrophil granulocytes differ in regulatory signaling and migratory dynamics with regard to spontaneous locomotion and chemotaxis. Cell. Immunol. 199, 104-114 (2000).
  21. Kasenda, B., et al. The stromal cell-derived factor-1alpha dependent migration of human cord blood CD34 haematopoietic stem and progenitor cells switches from protein kinase C (PKC)-alpha dependence to PKC-alpha independence upon prolonged culture in the presence of Flt3-ligand and interleukin-6. Br. J. Haematol. 142, 831-845 (2008).
  22. Kassmer, S. H., et al. Cytokine combinations differentially influence the SDF-1alpha-dependent migratory activity of cultivated murine hematopoietic stem and progenitor cells. Biol. Chem. 389, 863-872 (2008).
  23. Seidel, J., et al. The neurotransmitter gamma-aminobutyric-acid (GABA) is a potent inhibitor of the stromal cell-derived factor-1. Stem Cells Dev. 16, 827-836 (2007).
  24. Weidt, C., Niggemann, B., Hatzmann, W., Zanker, K. S., Dittmar, T. Differential effects of culture conditions on the migration pattern of stromal cell-derived factor-stimulated hematopoietic stem cells. Stem Cells. 22, 890-896 (2004).
  25. Balz, L. M., et al. The interplay of HER2/HER3/PI3K and EGFR/HER2/PLC-gamma1 signalling in breast cancer cell migration and dissemination. J. Pathol. 227, 234-244 (2012).
  26. Berndt, B., et al. Fusion of CCL21 non-migratory active breast epithelial and breast cancer cells give rise to CCL21 migratory active tumor hybrid cell lines. PLoS ONE. 8, e63711 (2013).
  27. Dittmar, T., et al. Induction of cancer cell migration by epidermal growth factor is initiated by specific phosphorylation of tyrosine 1248 of c-erbB-2 receptor via EGFR. FASEB J. 16, 1823-1825 (2002).
  28. Ozel, C., et al. Hybrid cells derived from breast epithelial cell/breast cancer cell fusion events show a differential RAF-AKT crosstalk. Cell Commun Signal. 10, (2012).
  29. Katterle, Y., et al. Antitumour effects of PLC-gamma1-(SH2)2-TAT fusion proteins on EGFR/c-erbB-2-positive breast cancer cells. Br. J. Cancer. 90, 230-235 (2004).
  30. Friedl, P., et al. Migration of Coordinated Cell Clusters in Mesenchymal and Epithelial Cancer Explants in Vitro. Cancer Res. 55, 4557-4560 (1995).
  31. Keeve, P. L., et al. Characterization and analysis of migration patterns of dentospheres derived from periodontal tissue and the palate. J. Periodontal Res. 48, 276-285 (2013).
  32. Kreger, S. T., et al. Polymerization and matrix physical properties as important design considerations for soluble collagen formulations. Biopolymers. 93, 690-707 (2010).
  33. Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1, 2753-2758 (2006).
  34. Friedl, P., et al. Migration of Highly Aggressive MV3 Melanoma Cells in 3-Dimensional Collagen Lattices Results in Local matrix Reorganization and Shedding of alpha2 and alpha1 Integrins and CD44. Cancer Res. 57, 2061-2070 (1997).
  35. Falasca, M., et al. Activation of phospholipase C gamma by PI 3-kinase-induced PH domain-mediated membrane targeting. EMBO J. 17, 414-422 (1998).
  36. Palm, D., et al. The norepinephrine-driven metastasis development of PC-3 human prostate cancer cells in BALB/c nude mice is inhibited by beta-blockers. Int. J. Cancer. 118, 2744-2749 (2006).
  37. Melhem-Bertrandt, A., et al. Beta-blocker use is associated with improved relapse-free survival in patients with triple-negative breast cancer. J. Clin. Oncol. 29, 2645-2652 (2011).
  38. Dittmar, T., Heyder, C., Gloria-Maercker, E., Hatzmann, W., Zanker, K. S. Adhesion molecules and chemokines: the navigation system for circulating tumor (stem) cells to metastasize in an organ-specific manner. Clin. Exp. Metastasis. 25, 11-32 (2008).
  39. Berndt, B., Zanker, K. S., Dittmar, T. Cell Fusion is a Potent Inducer of Aneuploidy and Drug Resistance in Tumor Cell/ Normal Cell Hybrids. Crit. Rev. Oncog. 18, 97-113 (2013).
  40. Dittmar, T., Nagler, C., Niggemann, B., Zänker, K. S. The dark side of stem cells: triggering cancer progression by cell fusion. Curr.Mol. Med. 13, 735-750 (2013).
  41. Polacheck, W. J., Charest, J. L., Kamm, R. D. Interstitial flow influences direction of tumor cell migration through competing mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 11115-11120 (2011).
  42. Haessler, U., Teo, J. C., Foretay, D., Renaud, P., Swartz, M. A. Migration dynamics of breast cancer cells in a tunable 3D interstitial flow chamber. Integr. Biol. 4, 401-409 (2012).
  43. Zervantonakis, I. K., et al. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 13515-13520 (2012).
  44. Alberts, B., et al. . The extracellular matrix of animals. , (2002).
  45. Humphries, J. D., Byron, A., Humphries, M. J. Integrin ligands at a glance. J. Cell Sci. 119, 3901-3903 (2006).
  46. Reyes-Reyes, M., Mora, N., Gonzalez, G., Rosales, C. beta1 and beta2 integrins activate different signalling pathways in monocytes. Biochem. J. 363, 273-280 (2002).
  47. Di Lullo, G. A., Sweeney, S. M., Korkko, J., Ala-Kokko, L., San Antonio, J. D. Mapping the ligand-binding sites and disease-associated mutations on the most abundant protein in the human, type I collagen. J. Biol. Chem. 277, 4223-4231 (2002).
  48. Mempel, T. R., et al. Regulatory T cells reversibly suppress cytotoxic T cell function independent of effector differentiation. Immunity. 25, 129-141 (2006).
  49. Reiner, T., Earley, S., Turetsky, A., Weissleder, R. Bioorthogonal small-molecule ligands for PARP1 imaging in living cells. Chembiochem. 11, 2374-2377 (2010).

Tags

Cell Migration3D Collagen MatrixExtracellular MatrixCell LocomotionTime-lapse Video MicroscopyCell TypesCell ClustersSpheroidsMetastasisWound HealingImmune ResponseEmbryonic Development

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zänker, K. S., Dittmar, T. Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix. J. Vis. Exp. (92), e51963, doi:10.3791/51963 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image