Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Estrategias para Anastasis Seguimiento, una célula de supervivencia Fenómeno que Invierte Apoptosis

Published: February 16, 2015 doi: 10.3791/51964
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1, 2
1W. Harry Feinstone Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health, 2School of Life Sciences, Chinese University of Hong Kong, 3Center for Cell Dynamics, Department of Biological Chemistry, Johns Hopkins University School of Medicine

Abstract

Anastasis (del griego, "el aumento de la vida") se refiere a la recuperación de las células que mueren. Antes de que estas células se recuperan, que han pasado a través de los puntos de control importantes de la apoptosis, incluyendo la fragmentación mitocondrial, la liberación de citocromo c mitocondrial en el citosol, la activación de las caspasas, condensación de la cromatina, el daño del ADN, fragmentación nuclear, formación de ampollas en la membrana plasmática, el encogimiento celular, la exposición de la superficie celular de fosfatidilserina, y la formación de cuerpos apoptóticos. Anastasis puede ocurrir cuando los estímulos apoptóticos se eliminan antes de la muerte, permitiendo así que las células que mueren para revertir la apoptosis y potencialmente otros mecanismos de muerte. Por lo tanto, anastasis parece implicar procesos de curación fisiológicos que también podrían sostener las células dañadas de manera inapropiada. Las funciones y mecanismos de anastasis aún no están claros, obstaculizada en parte por las limitadas herramientas para la detección de eventos pasados ​​después de la recuperación de las células aparentemente sanas. Estrategias para detectar anastasis permitirá a los estudios de los mecanismos fisiológicos, los peligros de las células no-muertos en patología de la enfermedad y posibles terapias para modular anastasis. A continuación, describimos las estrategias eficaces usando microscopia de células vivas y un biosensor caspasa mamífero para identificar y rastrear anastasis en células de mamíferos.

Introduction

La apoptosis (del griego, "caer a la muerte") en general se supone que ser un proceso unidireccional que termina en suicidio celular 1-7. Alteración genética de genes pro-muerte como resultado la supervivencia de las células adicionales que de otro modo morirían en animales enteros, incluyendo las células que ya han iniciado el 8,9 vía de la apoptosis. Del mismo modo, las manipulaciones genéticas permiten que las células de mamíferos sanos que artificialmente Display "Cómeme" señales o que pierden la adherencia a su matriz extracelular para escapar de la muerte por la fagocitosis de células enteras o entosis, respectivamente 10,11. Sin embargo, nosotros y otros han demostrado que sin manipulación genética de células de mamíferos sanos normales y líneas celulares también pueden recuperarse de las primeras etapas de la apoptosis 12-15. El uso de herramientas para rastrear células individuales, hemos demostrado aún más la recuperación de las últimas etapas de la apoptosis 12,13, después de las células han pasado los puntos de control importantes que típicoly marcar el "punto de no retorno" 2-6. Estos puntos de control de la apoptosis etapa tardía incluyen liberación mitocondrial de citocromo c, la activación de caspasas, la fragmentación nuclear, y formación de cuerpos apoptóticos. Adoptamos una palabra compuesta griega "Anastasis", que significa "resurrección a la vida", para describir esta inversión de la apoptosis en el borde de la muerte celular 2-6.

A menos que todo el proceso de recuperación de morir es observado por imágenes de células vivas, es difícil distinguir las células que han sido objeto anastasis a partir de células que nunca experimentaron eventos apoptóticos. Décadas de trabajo han puesto de manifiesto que las características morfológicas de suicidio celular por apoptosis son impulsados ​​por eventos bioquímicos y moleculares conservadas evolutivamente 16-19. Estos eventos promueven la auto-destrucción de las células para regular los procesos de desarrollo y homeostáticos en organismos unicelulares y pluricelulares mediante la eliminación de daños o dcélulas angerous 16-19. Mientras que las células apoptóticas pueden distinguirse fácilmente por manifestaciones morfológicas, bioquímicas y moleculares estandarizados de apoptosis 1,5,6,16,20, actualmente no se conoce ningún marcador específico para anastasis 12,13. Es importante destacar que las células que han sido objeto anastasis parecen ser las células sanas normales y células que sólo empiezan revertir apoptosis aparecer células que mueren como apoptosis 12,13. Por lo tanto, se necesitan nuevas herramientas para concluir con certeza que una célula sobrevive dado había experimentado previamente procesos apoptóticos activos.

La apoptosis se asume generalmente como una cascada irreversible porque es un proceso de destrucción rápida y masiva. Si bien se podría tardar minutos en días de algunas células para iniciar la apoptosis, una vez que las mitocondrias han lanzado factores apoptogénicos como citocromo c al citosol 21,22, caspasas pueden ser activados en 5 minutos 23,24, seguidos por citoplasmática ycondensación nuclear dentro de 10 min 25-27, y la muerte celular poco después 25-27. Las caspasas activadas orquestan la apoptosis mediante la escisión e inactivación de componentes estructurales y funcionales clave para el propósito de demolición celular 2,28, tales como el inhibidor de la endonucleasa de DFF45 / ICAD 29,30. Las caspasas también activan factores pro-apoptóticos, tales como BID miembro de familia Bcl-2, que se transloca a la mitocondria para promover la liberación de citocromo C 31,32. Actividad caspasa también da lugar a la exposición de la superficie celular de fosfatidilserina como "comerme" señal para la promoción de inmersión de las células que mueren por los macrófagos o células vecinas a través de la fagocitosis 33. Además, eventos apoptóticos hacen mitocondrias disfuncionales, lo que altera la bioenergética celular y el metabolismo 34,35,36. Por lo tanto, la recuperación de dicha destrucción parece intuitivamente improbable.

Contrariamente a la original esperarciones, las células pueden revertir el proceso de muerte celular apoptótica incluso en una etapa tardía. Al monitorear continuamente el destino de morir las células en cultivo, se observó la reversibilidad de la apoptosis etapa tardía en una gama de células primarias y líneas celulares 12,13. La eliminación del estímulo muerte permitió la recuperación de las características evidentes de la apoptosis, tales como la fragmentación mitocondrial, condensación de la cromatina, el daño del ADN, formación de ampollas en la membrana plasmática, la exposición de la superficie celular de la fosfatidilserina, la liberación de citocromo c mitocondrial, la activación de caspasas, la fragmentación nuclear, contracción celular, y formación de cuerpos apoptóticos. Estas observaciones plantean preguntas sin respuesta sobre las funciones, las consecuencias y los mecanismos de anastasis. Para abordar estas cuestiones, es un requisito previo para identificar de forma fiable las células que han sido objeto anastasis. A continuación, describimos los métodos de microscopía en vivo y un biosensor para la detección de caspasa células que han invertido previamente apoptosis etapa tardía y XXen sobrevivió.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Preparación de células de imágenes de células vivas

  1. Para facilitar la detección de cambios morfológicos, elija células adherentes tales como las células que son planas sobre el sustrato para visualizar mejor la alteración de la membrana plasmática y orgánulos intracelulares HeLa (carcinoma cervical humano).
    Nota: Inversión de la apoptosis se ha observado en diversas células de mamíferos 12,13, incluyendo las células de hígado de ratón primario, macrófagos primarios de ratón, cardiomiocitos primarios de rata, y también líneas celulares tales como células HEK-293T de riñón humano embrionario, de mono verde africano COS epiteliales renales -7 células, las células del músculo cardiaco ratón HL-1, fibroblastos de ratón NIH 3T3, hurón (Mustela furo) putoris células CRL1656 cerebro, las células A375 de cáncer de piel, células del cáncer testicular CRL1973 humanos, pequeñas células H446 de carcinoma de pulmón de células humanas, el cáncer de hígado humano células HepG2, células MCF7 cáncer de mama humano, células PC3 de cáncer de próstata humanos, y células SH-SY5Y de neuroblastoma humano.
  2. Pre-lavado cubreobjetos de vidrio de cristal placas de cultivo celular de fondo con etanol absoluto para la limpieza y esterilización.
    Nota 1: El uso de platos con fondo de cristal se recomienda para el contraste de interferencia diferencial de alta calidad (DIC) de microscopía y alta magnificación confocal o microscopía de epifluorescencia (ver Discusión).
    Nota 2: Para los grandes aumentos (40X, 60 / 63X o 100X objetivos y altas aperturas numéricas 1.3 o 1.4), el uso de placas de cultivo celular con fondo de cristal más delgado (grosor de 0,085 a 0,16 mm) ofrece grandes distancias para obtener imágenes de Trabajo (véase el Protocolo nº 3 ).
  3. Dependiendo del tipo de células, placas de cultivo de vidrio de fondo pueden requerir recubrimiento con poli-D-lisina (0,1 mg / ml), colágeno (solución 0,01% en ácido acético 0,01 M) y / o fibronectina (5 g / ml) antes de la siembra las células.
    Nota: Se requiere Optimización del tipo y concentración de agente de revestimiento para diferentes líneas celulares. Células HeLa pueden adherirse directamente sobre el vidrio sin recubrimiento. Sin embargo, algunas células, SUch como células de ratón del músculo cardiaco HL-1, no puede adherirse directamente a las superficies de vidrio, pero requieren protocolos de cultivo y revestimiento específicos 37.
  4. Seed ~ 2-3 x 10 5 células en 35 mm de vidrio pre-recubierto celda inferior placas de cultivo y se incuba a 37 grados Celsius (° C) con 5% de CO 2 durante un día para alcanzar 80% de confluencia.
    Nota 1: Las condiciones óptimas de la densidad celular, tiempo de incubación, y condiciones de cultivo pueden variar, dependiendo del tipo de célula. Confluencia de la célula puede afectar la respuesta de apoptosis de las células (Ver Protocolo 2). A alta confluencia, las células podrían ser menos sensibles a las mismas concentraciones de los estímulos apoptóticos.
    Nota 2: Evitar el exceso de células confluentes, como una alta densidad celular puede oscurecer los cambios morfológicos de las células individuales y sus orgánulos.

2. Aplicación y eliminación de la célula apoptótica Estímulos

  1. Poco antes de su uso, pre-mezclar el agente inductor de apoptosis con 37 ° C medio de cultivo celular. El etanol (03/06 a 04/05% Vol / vol) sirvió como inductor de la apoptosis en el presente manifestación.
    Nota 1: Nuestros datos publicados y no publicados demuestran que las células también pueden revertir la apoptosis que se desencadena por otro apoptóticos estímulos 12,13, tal como dimetilsulfóxido (DMSO, 8% vol / vol durante 24 horas), estaurosporina (STS, 0,5 M durante 1 hr), y taxol (1 mM durante 12 horas). Se requiere Optimización de la dosis de la apoptosis de disparo para diferentes tipos de células para lograr la dosis mínima que puede desencadenar la mayoría de las células en la población a someterse a apoptosis.
    Nota 2: Pre-mezcla de agentes inductores de la apoptosis con medio de cultivo celular es importante para evitar la exposición desigual de las células a los estímulos de apoptosis.
  2. Image un grupo de células de salud en la placa de cultivo celular antes de aplicar el agente inductor de apoptosis para establecer morfologías de línea de base.
  3. Retire el medio original de la placa de cultivo celular, y luego aplicar 2 ml de agente inductor de apoptosis premezclada al plato aactivar las células para sufrir apoptosis. Se incuban las células a 37 ° C con 5% de CO 2 (u otras condiciones de cultivo normales).
  4. Después de la incubación, observar las células por la luz, epi-fluorescencia o microscopía confocal para monitorizar la progresión de características apoptóticas.
    Nota 1: Las células que sufren apoptosis se mostrarán características morfológicas, bioquímicas y moleculares de la apoptosis que puede ser detectado por microscopía y biosensores basados ​​en fluorescencia (véase Protocolos 3 y 4).
    Nota 2: El tiempo de incubación de las células con diferentes inductores de apoptosis variará, dependiendo del tipo de célula, las condiciones celulares (tales como la confluencia y el estado de nutrientes), y la dosis de estímulo aplicado la muerte. Titulación cuidadosa puede ser requerida.
  5. Cuando las células exhiben características de apoptosis, eliminar el agente inductor de apoptosis por lavado de las células una vez con agua caliente (37 ° C, o de otro temperatura de cultivo normal) medio de cultivo celular fresco.
    Nota 1: Como las células apoptóticas están más vagamente unidos enla placa de cultivo, es importante aplicar y quitar medio con cuidado para que las células no serán arrastrados.
    Nota 2: suspendido en vivo las células se pueden recuperar del sobrenadante por centrifugación suave (160 xg durante 1 min) y se añadieron de nuevo a la placa de cultivo.
  6. Se incuban las células a 37 ° C con 2 ml / placa de 35 mm de medio de cultivo celular fresco en 5% de CO 2. Alternativamente, el uso de medio acondicionado (medio de cultivo libre de células obtenida de las células sanas) para mejorar aún más la supervivencia de las células apoptóticas.
    Nota: Lavado y incubando las células con medio fresco permiten la mayoría de las células para revertir la apoptosis inducida por etanol después de la exposición de etanol 12,13. Sin embargo, la repetición de este paso de lavado puede ser necesaria cuando las células se exponen a otros estímulos apoptóticos (véase la discusión).

3. microscopia de células vivas

  1. Le recomendamos que utilice un confocal o epi-fluorescencia microscopio invertido con el control ambiental (37 ° C,5% de CO 2) para microscopia células vivas.
    Nota: También es posible que la imagen de las células por medio de microscopios verticales con un objetivo de inmersión en agua. Sumergir el objetivo directamente en el medio de cultivo para células de imagen. Sin embargo, las células pueden ser aplastados por el objetivo de inmersión durante el enfoque.
  2. Pre-calentar el microscopio (como cámara ambiental de control, etapa incubadora, y el calentador objetivo) al menos 2 h antes de formación de imágenes.
    Nota: Esto permite que los componentes del microscopio para llegar a la termo-equilibrio, de modo que pueda evitar la deriva del enfoque y el desplazamiento del plano xy debido a la expansión y contracción térmica de los componentes.
  3. Coloque un plato de vidrio 35 mm parte inferior de las células cultivadas (Véase el Protocolo 1) en la etapa de un microscopio invertido y capturar imágenes de células usando un objetivo 40X o 63X plan de Apocromático con una apertura numérica (NA) 1.3 o 1.4 para obtener imágenes de células de la fondo de la placa a través de cubreobjetos de vidrio.
    Nota: Evite aplicar más de 2 ml de medioa 35 mm plato de fondo de vidrio, ya que el peso del medio podría causar curvatura de la parte inferior de vidrio, lo que hace difícil una imagen de campo de las células en el mismo plano focal.
  4. Mantener las células a 37 ° C o la temperatura normal correspondiente durante todo el proceso de formación de imágenes.
    Nota: El proceso de apoptosis, y es probable que la reversión de la apoptosis, depende de la temperatura actividades enzimáticas sensibles. Por lo tanto, el mantenimiento de las células a 37 ° C (por ejemplo, con una platina del microscopio superior incubadora) es importante en todo el experimento. Disminución de la temperatura podría ralentizar la respuesta apoptótica y la respuesta de recuperación después de la eliminación del estímulo apoptótico.
  5. Utilice un dispositivo de humedad o colocar una lámina transparente (ver Materiales) en la placa de cultivo para reducir la pérdida de agua por evaporación del medio.
    Nota: el papel de aluminio podría interrumpir la polaridad de la luz para la microscopía DIC. Restaurar la polaridad ajustando el polarizador en la trayectoria de la luz.
  6. Mantenga el pH en elmedio de cultivo celular (pH 6,8 -7,3) mediante la incubación en 5% de CO 2 con una cámara de control ambiental en el microscopio.
    NOTA: El mantenimiento del pH en el medio de cultivo se puede lograr también mediante la adición de tampón HEPES, o mediante el uso de CO 2 medio -independiente comercial (ver Materiales). Las condiciones óptimas pueden variar, dependiendo del tipo de célula.
  7. Minimizar fluorescencia / láser (intensidad de la luz de excitación) la exposición a las células durante el proceso de formación de imágenes para evitar fototoxicidad mediante la reducción de la intensidad de fluorescencia a la más baja necesaria para obtener imágenes de alta calidad de las células / estructuras subcelulares o biosensores expresadas (Detalles en el Protocolo nº 4).

4. Estrategias para detectar y rastrear Anastasis durante y después apoptóticas Eventos

  1. Plasma formación de ampollas en la membrana, la condensación citoplasmática, la contracción celular y formación de cuerpos apoptóticos (Véanse las Figuras 1A - C, E).
    1. Realizar time-lapse dife células vivascontraste dife- interferencia (DIC) o microscopía de contraste de fases para el seguimiento de un grupo de células de la salud y para observar su morfología celular (Véase el Protocolo 3 para microscopia de células vivas, y ver Discusión).
      Nota 1: Reducir la intensidad de la fuente de luz para imágenes contrato DIC / fase para evitar fototoxicidad a las células.
      Nota 2: Si DIC y microscopía de contraste de fases no están disponibles, CellTracker utilizar para teñir el citosol para delinear la morfología de células vivas para la microscopía confocal o epi-fluorescencia y controlar la morfología de las células.
    2. Aplicar estímulo muerte celular para activar las células para experimentar apoptosis (Véase el Protocolo 2 para la aplicación y retirada de los estímulos apoptóticos).
    3. Observe células tratadas durante características morfológicas de la apoptosis, tales como formación de ampollas en la membrana plasmática, la condensación citoplasmática, la contracción celular y formación de cuerpos apoptóticos (Figuras 1A, 1B, 1C, 1E).
    4. Lavar los estímulos de muerte, y las células de reabastecimiento con medio fresco cuando las células displacaracterísticas morfológicas Y de apoptosis.
      Nota 1: Aplicar estímulo muerte celular o cambiando el medio de cultivo celular en la platina del microscopio durante el lapso de tiempo imágenes de células vivas se puede lograr mediante el uso de una cámara de cultivo celular de perfusión, o se puede realizar directamente en la placa de cultivo celular pipeteando cuidadosamente sin tocar el plato, durante los intervalos entre imágenes.
      Nota 2: Los sistemas de compensación de deriva Utilice el enfoque para evitar fuera de foco de las células debido a la pérdida de termo-equilibrio del sistema de microscopio después de cambiar el medio de cultivo celular (véase la discusión).
    5. Time-lapse continua para seguir el destino de las células que muestran características de la apoptosis. Las células que revierten la apoptosis pueden reparar el daño y recuperar normal de la morfología plana (Figuras 1A, 1B, 1C, 1E).
  2. Fragmentación mitocondrial, ADN / condensación de la cromatina, y la fragmentación nuclear (Ver Figuras 1D, 1F, 1G).
    1. Para visualizar mitochondria, las células de la mancha con 50 nM MitoTracker profunda colorante rojo / rojo / verde fluorescente, y simultáneamente se tiñen el núcleo con 10 mg / ml de Hoechst 33342 tinte nuclear azul en medio de cultivo durante 20 min a 37 ° C con 5% de CO 2.
      Nota 1: Reducir la concentración de colorantes y duración de la incubación para evitar la citotoxicidad y reducir la fluorescencia de fondo cuando la necesidad. Optimizar las condiciones de tinción para obtener una buena relación señal a ruido con la cantidad mínima de colorante y el tiempo de incubación para la tinción.
      Nota 2: Utilice las manchas fluorescentes para las mitocondrias como MitoTracker Red CMXRos, MitoTracker Deep Red FM, o MitoTracker Verde FM, que no se salga de la mitocondria durante la apoptosis. Esto permite la visualización de la morfología mitocondrial durante la apoptosis y anastasis. Ver los materiales y equipos de la tabla para obtener más detalles acerca de estas manchas.
    2. Mantenga las células teñidas en la oscuridad para evitar photobleaching.
    3. Retire el exceso de manchas por lavado de las células3 veces con 37 ° C de solución salina tamponada con fosfato (PBS) solución o medio de cultivo celular fresco, con 1 min de incubación en el medio fresco entre cada lavado, y luego se incuban adicionalmente en el medio fresco durante 20 min antes de que el lavado final para permitir excesiva manchas para salir de las células para reducir la señal de fondo no específico para formación de imágenes.
      Nota: Acortar los tiempos de incubación con medio de células después de la tinción puede resultar en alto fondo para la imagen.
    4. Realizar en tiempo real confocal de células vivas o microscopía de epifluorescencia a las células sanas de imagen antes de aplicar la inducción de apoptosis (Ver Protocolo 3 para microscopia de células vivas).
      Nota: Las células sanas muestran mitocondrias tubulares y núcleos redondos en la mayoría de tipos de células (Figuras 1D, 1F, 1G).
    5. Dispare células a sufrir apoptosis (Ver Protocolo 2 de aplicación y retirada de los estímulos de apoptosis en las células).
    6. Continuar time-lapse microscopía de células vivas para observar alteraciones en morpholog mitocondrial y nucleardel IES inmediatamente después del estímulo de muerte se aplica a las células. Observar las células para visualizar características de la apoptosis como la fragmentación mitocondrial y la hinchazón, condensación de la cromatina y fragmentación nuclear, en contraste con las células sanas que muestran las mitocondrias y núcleos tubulares redondos.
    7. Cuando las células muestran señas de identidad de la apoptosis, lavar y suministrar células con medio fresco, y continuar time-lapse de rastrear el destino de las células. Las células que revierten apoptosis mitocondrial normal y recuperar la morfología nuclear (Figuras 1D, 1F, 1G).
      Nota: Realice la microscopía DIC en paralelo cuando posible obtener información adicional para el acceso a las etapas de la apoptosis mediante la observación de las alteraciones de la morfología celular en el mismo grupo de células (Ver 4.1 Protocolo para la microscopía DIC).
  3. La detección de la liberación de citocromo C utilizando células que expresan establemente un GFP pr fusión citocromo cOtein (Ver Figura 2).
    1. Las células que expresan establemente Stain citocromo c-GFP 23,24 con MitoTracker Red para etiquetar las mitocondrias celulares polarizadas (Ver Pasos 4.2.1 a 4.2.3 para la tinción en vivo mitocondria de la célula).
    2. Realizar en tiempo real confocal de células vivas o epi-fluorescencia microscopía para rastrear las células sanas (Detalles en el Protocolo nº 3 de imágenes de células vivas).
      Nota: La señal de GFP citocromo c se localiza principalmente en la mitocondria de las células sanas (Figuras 2A i, 2B).
    3. Dispare células a sufrir apoptosis (Ver Protocolo 2 de aplicación y retirada de los estímulos de apoptosis en las células). Continuar microscopía de lapso de tiempo para observar la translocación de citocromo c-GFP de la mitocondria al citosol (Figuras 2AII-iii, 2B).
      Nota: liberación mitocondrial de citocromo c en el citosol es un marcador de permeabilización de la membrana mitocondrial externa (MOMP)4, un paso crítico en la mitocondria dependiente de la apoptosis 21,22
    4. Cuando las células muestran la señal GFP citocromo c en el citoplasma, eliminar el estímulo muerte celular, y las células de suministro con medio fresco (véase el Protocolo 2). Continuar time-lapse de rastrear el destino de las células con las buenas prácticas agrarias citosólica.
      Nota: las que revierten apoptosis recuperar la morfología normal de las células, y reducir su señal GFP citocromo c citosólico presumiblemente a través de la degradación o la translocación de nuevo a las mitocondrias (Figuras 2Aiv-vii, 2B).
    5. Captura de imágenes DIC en paralelo para obtener información adicional para el acceso a las etapas de la apoptosis mediante la observación de alteraciones en la morfología celular en las células individuales o grupos de células (Ver 4.1 Protocolo para la microscopía DIC).
  4. Detección de la actividad caspasa usando un biosensor caspasa (Ver Figura 3)
    1. Transfectar células con el biosensor caspasa NES-DEVD-YFP-NLS para16 a 24 horas antes de someterlas a un estímulo apoptótico 13.
    2. Teñir los cultivos transfectados con Hoechst 33342 para etiquetar los núcleos celulares (Ver Pasos 4.2.1 a 4.2.3 para la tinción nuclear de células vivas).
    3. Realizar en tiempo real confocal de células vivas o epi-fluorescencia microscopía para rastrear las células sanas (Detalles en el Protocolo nº 3 de imágenes de células vivas).
      Nota: La señal biosensor NES-DEVD-YFP-NLS localiza principalmente en el citosol de las células sanas debido a su señal de exportación nuclear (NES) (Figuras 3A, 3Bi y 3C, ver Discusión).
    4. Dispare células a sufrir apoptosis (Ver Protocolo 2 de aplicación y retirada de los estímulos de apoptosis en las células). Continuar microscopía de lapso de tiempo para observar la translocación nuclear de YFP.
      Nota: La activación de las caspasas escinde el motivo DEVD en el biosensor caspasa NES-DEVD-YFP-NLS, resultando en YFP-NLS translocación desde el citosol al núcleo (Figuras 3A, 3Bii-iv, véase la discusión).
      5. Nota: Las células que revierten apoptosis recuperar la morfología celular normal, pero retienen la señal de YFP nuclear (Figuras 3Bv-x, las células 1 y 2, y 3D).
    5. Continuar time-lapse de rastrear el destino de las células que muestran YFP nuclear.
      Nota: La señal de YFP nuclear se convertirá degradadas varias horas después de que las células han revertido la apoptosis (Figuras 3B, vi-x, la Celda 1, Ver Resultados y Discusión) presumiblemente a través de los mecanismos normales de remoción de células, como la degradación del proteasoma.
    6. Captura de imágenes DIC en paralelo para obtener información adicional para el acceso a las etapas de la apoptosis mediante la observación de alteraciones en la morfología celular en las células individuales o un grupo de células. (Ver 4.1 Protocolo para la microscopía DIC).
  5. Exposición de la superficie de la célula de fosfatidilserina (Ver Figura 4)
    1. Sembrar las células en glculo cubreobjetos para lograr una confluencia celular del 80% (Véase el Protocolo 1).
    2. Co-mancha las células con MitoTracker-rojo fluorescente y azul Hoechst 33342 tinción de las mitocondrias y núcleos, respectivamente (Ver Pasos 4.2.1 a 4.2.3 para mitocondrial de células vivas y tinción nuclear).
    3. Dispare células a la apoptosis mediante el uso de un inductor de apoptosis (Ver Protocolo 2).
    4. Aplicar marcado fluorescente anexina V (ver Materiales) para teñir las células apoptóticas 10 min a 37 ° C antes de la extracción del inductor de la apoptosis para detectar la exposición de fosfatidilserina en la superficie de las células apoptóticas.
      Nota 1: Saludable células no están teñidas con anexina V porque fosfatidilserina es normalmente secuestrado en el centro de la hoja de la membrana plasmática de la célula 38. Las células apoptóticas se tiñeron con anexina V, que se une a la fosfatidilserina en la superficie celular (Figuras 4A y 4B).
      Nota 2: marcado fluorescente anexina V también se puede aplicar para teñir las células apoptóticas immediately después de la eliminación del inductor de la apoptosis, con 10 min de incubación.
    5. Retire estímulo muerte celular, se lavan las células teñidas con PBS caliente o medio fresco una vez, y luego suministrar células con medio fresco durante 2 horas a 37 ° C con 5% de CO 2 (Ver Protocolo 2).
      Nota 1: Las células que invierte apoptosis recuperar la morfología normal y conservar la señal V anexina marcada con fluorescencia después de recuperar la morfología normal (Figuras 4A y 4B).
      Nota 2: La señal de anexina V disminuye con el tiempo en las células recuperadas (véase el debate).
    6. Fijar las células en puntos de tiempo seleccionados con 4% de paraformaldehído que contiene 8% de sacarosa en PBS 1x durante 20 min en la oscuridad a temperatura ambiente, y lavar las células fijadas con PBS durante 3 veces para eliminar el paraformaldehído antes de las células de montaje sobre portaobjetos de vidrio cubreobjetos con medio de montaje antifade (ver Materiales) para microscopia confocal o epi-fluorescencia y observar la anexina V en las células después de la eliminación del inductor de la apoptosis.
      Nota 1: Sacarosa en fijador conserva estructura de la membrana celular durante la fijación.
      Nota 2: Guarde la solución de paraformaldehído en oscuridad a 4 ° C para evitar la degradación.
      Nota 3: Calentar una solución de paraformaldehído a temperatura ambiente antes de aplicar a las células para la fijación para evitar el choque en frío a las células.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Para estudiar la reversión de la apoptosis, las células de cultivo de tejidos se expusieron primero a un estímulo muerte para activar la apoptosis. Cuando las células exhiben características de apoptosis, medio de cultivo fresco se aplica entonces para lavar el estímulo y luego se incuban las células que mueren para permitir la recuperación (Figura 1A). Aquí, la cuestión clave está abordando es hasta qué punto las células cultivadas que mueren individuales pueden progresar hacia la apoptosis y todavía someterse anastasis. Esta pregunta puede ser respondida por definitivamente vigilancia continua con biomarcadores para rastrear las células destinos utilizando los métodos descritos a continuación.

Nosotros describimos primero nuestras estrategias para detectar la inversión de la apoptosis en células de cultivo de tejidos mediante el uso de lapso de tiempo microscopia de células vivas, que se requiere para el seguimiento y registrar la respuesta de las células individuales antes, durante y después de la exposición a un estímulo apoptótico 12,13. Células adherentes saludable propagación en su sustrato adjunto (Figura 1Bi) 12,13, y se muestra mitocondrias filamentosas y núcleos redondos antes del tratamiento (Figuras 1CI, Di, Ei, Fi, Gi) 12,13. Después de la exposición a etanol 03.08 a 04.05% en medio de cultivo celular (vol / vol), DIC o microscopía de contraste de fases revelaron que las células exhiben características morfológicas de la apoptosis, incluyendo condensación citoplásmica, blebbing de la membrana plasmática, y la contracción celular (Figuras 1Bii, 1Cii- iii, y 1Eii-vi) 12,13. Apoptótica formación del cuerpo por las mismas células se observó fácilmente por DIC (Figuras 1Eii-vi). La fragmentación de las mitocondrias marcados con MitoTracker (Figuras 1Dii-iii, 1Fii-vi) 12,13, así como la condensación de ADN nuclear teñido con Hoechst (Figuras 1Dii-iii, Fii-iii, GII) 12,13, y la fragmentación de los núcleos (HigoUres 1Evi y FVI, flechas blancas), se detectaron simultáneamente por microscopía confocal o epi-fluorescencia. Las células que revirtieron con éxito la apoptosis se observaron posteriormente para recuperar la morfología normal, al parecer, la reparación de los daños (Figuras 1Biii, C y Div-vi, E y FVII-xii, y Giii) 12,13. Células bajo estas condiciones también se había demostrado para recuperar la motilidad orgánulo, la migración celular, y la endocitosis funcional basado en la absorción de la fluorescencia de emisión de puntos cuánticos y la división celular 13. Curiosamente, algunas células que la apoptosis venerado representada morfología irregular nuclear (Figura 1Fxii), y también la división celular anormal y la formación de micronúcleos (Figuras 1Giv-vii) 13, que es un biomarcador de daño en el ADN, la rotura de cromosomas y la pérdida de todo el cromosoma en las células en división 39, 40. C Desplazadahromosomes o fragmentos de cromosomas fuera fallan para ser incluido en los núcleos de las células hija están encerradas por una membrana nuclear 39, 40. Por lo tanto, una consecuencia de anastasis podría ser la acogida de los genomas que fueron dañados durante la apoptosis abortado, que conduce a la tumorigénesis y la progresión del cáncer. La presencia de micronúcleos también es común en las células de cáncer 40,41.

La liberación de citocromo c mitocondrial es un paso crítico para mediar o amplificar la apoptosis dependiente de caspasa 20-22. El uso de células HeLa que expresan establemente GFP-etiquetados citocromo c, que supervisó el traslado subcelular de citocromo c durante la apoptosis y anastasis por microscopía confocal. Como se informó 23,24, citocromo c-GFP localizado en la mitocondria antes del tratamiento (Figuras 2AI y B), pero luego se libera en el citosol después de un estímulo de muerte se había aplicado (Figuras 2AII,2Aiii y B). Otras morfologías característicos tales como la fragmentación mitocondrial y formación de ampollas en la membrana plasmática, también se observaron en las células que habían liberado citocromo c-GFP (Figura 2Aiii). Estas células fueron reportados a someterse a la muerte celular poco después de la liberación del citocromo c 23-27. Sin embargo, después de la eliminación del estímulo de la muerte, se observó que los niveles de citocromo c citosólico-GFP disminuyeron, las mitocondrias recuperaron estructuras filamentosas, y la membrana de plasma recuperado una apariencia normal (Figuras 2Aiv-vii, y B). Por lo tanto, las células apoptóticas pueden sufrir anastasis después de la liberación de citocromo c.

La amplificación de las caspasas DEVD-escindir aguas abajo se asume generalmente para ser el "punto de no retorno" en la apoptosis 2,5. Por lo tanto, hemos utilizado un biosensor caspasa NES-DEVD-YFP-NLS exprEssed de un plásmido de 13, por lo que es posible la detección de células supervivientes que han experimentado previamente la actividad de caspasa (Figura 3A). Este biosensor caspasa es un polipéptido con una señal de exclusión nuclear N-terminal (NES), un enlazador con la caspasa-3/7 sitio consenso de escisión (DEVD) 26,42,43, seguido por una proteína fluorescente amarilla (YFP) y una señal de localización nuclear C-terminal (NLS). En las células sanas, este biosensor localiza predominantemente al citosol como una función de la NES (Figuras 3Bi, Ci-iv, y D) 13. Durante la apoptosis, las caspasas activadas escinden el motivo DEVD, liberando YFP-NLS, que se transloca eficientemente desde el citosol al núcleo en las células que simultáneamente, o posteriormente, muestran otras características de la apoptosis tales como ADN / condensación de la cromatina y la contracción celular (Figuras 3B ii -IV, y D) 13. Por lo tanto, lalas células en sí conservan la función de importación nuclear después de la activación de las caspasas. Después de la eliminación del inductor de la apoptosis, las células que se someten a pantalla anastasis recuperación morfológica incluso después de haberse producido la activación de caspasas (Figuras 3Bv-x, y D) 13, al parecer revertir la apoptosis etapa tardía. Durante la recuperación de la morfología normal, la señal de YFP nuclear disminuye en intensidad en algunas células cuando empiezan a revertir la apoptosis después de la eliminación del estímulo muerte (Figuras 3Bv-x, Cell 1) 13, lo que sugiere que las células degradan el biosensor caspasa-troceados, posiblemente por el mismo mecanismo utilizado para eliminar otros productos de caspasa-troceados durante y después anastasis.

Anastasis también puede detectarse sin microscopia de células vivas. Esto se puede lograr mediante el uso de anexina V marcada con fluorescencia 38,44, que se une y marcas exteriorizan fosfatidilserina (PS) en una primera etapa en la apoptosis ( (Figura 4B) 13, como la fosfatidilserina se limita a la hoja interna de la membrana plasmática de las células sanas 38. En contraste, las células que mueren apoptóticas inducidas por etanol exponen fosfatidilserina en la superficie celular (Figura 4B) 13, y por lo tanto, se pueden marcar con la anexina V fluorescente 38,44. Notablemente, las células de anexina V marcada con morfología normal pueden recuperar después de la eliminación de los estímulos de muerte, lo que sugiere que los cardiomiocitos primarios han revertido apoptosis (Figura 4B) 13. Otros han aplicado previamente una estrategia similar para sugerir que la recuperación de la apoptosis podría ocurrir in vivo. En un modelo in vivo de lesión isquémica transitoria, anexina V etiquetado dependiente de caspasa de los cardiomiocitos en conejos y ratones aparentemente redio como resultado la internalización de anexina V por células supervivientes después de la isquemia transitoria 45, lo que sugiere que anastasis podría ocurrir en animales vivos. Además, otros dos estudios utilizaron la clasificación celular para identificar una fracción de anexina V BCL ratón marcado con 1 .3B3 células de linfoma B (expuestos a anticuerpos anti-inmunoglobulina que inducen la apoptosis en BCL 1 .3B3) y el carcinoma mamario de ratón que expresan las células MOD temperatura p53 -sensible (que provoca la apoptosis después incubado debajo de la temperatura permisiva) continúa proliferando después de que fueran devueltos a las condiciones de cultivo normales 14,15. En conjunto, estos estudios sugieren que la anexina V es útil para la determinación del destino de las células que han revertido apoptosis sin formación de imágenes de microscopía de células vivas. Sin embargo, hay advertencias con esta estrategia, como la anexina V de fluorescencia no es permanente (Figura 4B) 13, permaneciendo detectable sólo para unos pocos hr después de la eliminación del estímulo de la muerte, de modo queestos métodos no pueden dar seguimiento a largo plazo de las células que revirtieron la apoptosis.

Figura 1
Figura 1: Seguimiento de reversión de la apoptosis de imágenes de células vivas. (Reproducido con permiso del Tang et al, MBOC 23, 2240-2252 13, de las figuras 1A -. D, y G). (A) Enfoque para inducir la apoptosis y, posteriormente, permiten que las células cultivadas se recuperen después de un lavado que elimina el inductor de la apoptosis. (B) Tiempo de lapso de fase de células vivas microscopía de contraste de las células de hígado de ratón primarios sanos (sin tratar), el mismo grupo de células que fueron tratados con etanol 4,5% en medio de cultivo (vol / vol) durante 5 h (tratado), y luego se lava y se incubaron adicionalmente con medio de cultivo fresco durante 24 horas (lavado). Barra de escala, 100 m. (C) Continuo time-lapse de células vivas epi-microscopía de fluorescencia de la misma célula de hígado de ratón primaria antes ethatratamiento nol (i), a los tiempos indicados después del tratamiento con etanol 4,5% en medio de cultivo de células durante 2,5 horas (ii y iii), y después del lavado y la incubación con medio fresco para permitir la recuperación durante 1 hora (IV - VI). Imágenes fusionadas de mitocondrias teñidas con MitoTracker (rojo) y el núcleo (azul) teñido con Hoechst se visualizaron por microscopía de epi-fluorescencia, y la morfología celular mediante microscopía DIC. Barra de escala, 10 micras. (D) sólo (sin DIC) imágenes de fluorescencia Combinadas de panel C revelan morfologías orgánulos. (E) Continuo time-lapse de células vivas microscopía confocal de las pequeñas células H446 de carcinoma de pulmón de células humanas antes del tratamiento etanol (i) , después del tratamiento con etanol 3,8% en medio de cultivo celular durante 2 h 28 min (ii-vi), y después del lavado y la incubación con medio fresco para permitir la recuperación (vii-xii). Imágenes fusionadas de mitocondrias teñidas con MitoTracker (rojo) y los núcleos teñidos con Hoechst (azul) se visualizaron por microscopía confocal, y c ell morfología mediante microscopía DIC. Las flechas blancas indican un núcleo fragmentado en cuerpos apoptóticos (VI). Barra de escala, 10 micras. (F) Fusionada imágenes de fluorescencia solamente (sin CID) desde el panel de E revelan morfologías orgánulos. (G) Continuo time-lapse microscopía de células vivas epi-fluorescencia para imágenes nucleares teñido con Hoechst monocromo de una sola célula HeLa que sufre la división celular impreciso. Antes del tratamiento etanol (i), el tratamiento con etanol 4,3% en medio de cultivo celular durante 5 h (ii) y después de la eliminación del etanol (lavado, iii-vi). Paneles iv revela divisiones celulares anormales. Las flechas rojas indican los principales núcleos de las células divididas (IV-VI). Barra de escala, 30 micras. Los tiempos se indican como hr: Min. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

gura 2 "src =" / files / ftp_upload / 51964 / 51964fig2highres.jpg "/>
Figura 2: Detección de inversión de la apoptosis después de la liberación mitocondrial de citocromo c (A) continua de lapso de tiempo de células microscopía confocal en vivo de las células HeLa que expresan establemente el citocromo c-GFP (cito C-GFP) antes de (i), durante (ii-iii) y después (iii-vii) la exposición a etanol 3,9% en medio de cultivo celular. Confocal de imágenes fusionadas de CytoC-GFP (verde), las mitocondrias teñidas con MitoTracker (rojo), y los núcleos teñidos con Hoechst (azul) se combinan con imágenes DIC (panel izquierdo). Versiones sin combinar se muestran por separado para CytoC-GFP, se presenta como un mapa de calor de la intensidad de la señal (el panel medio izquierdo), imagen monocroma de CytoC-GFP (panel central), y la imagen monocroma de la mitocondria (panel central derecho). Imágenes fusionadas de CytoC-GFP y las mitocondrias (panel derecho). (B) El cambio de la intensidad de la señal c-GFP citocromo citosólica de las células, Cell 1 y 2 de la célula, como se indica en la imagen CytoC-GFP monocromo en Panel de Ai. Los tiempos se indican como hr: Min. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3: La detección de la inversión de la apoptosis después de la activación de caspasas (Reproducido con permiso del Tang et al, MBOC 23, 2240-2252 13, para las figuras 3A - D.). (A) Esquema de la proteína de fusión caspasa biosensor compuesto por una señal de exportación nuclear (NES), el sitio de la caspasa DEVD escote, proteína fluorescente amarilla (YFP), y la señal de localización nuclear (NLS). (B) Continuo de lapso de tiempo en directo células microscopía confocal de células HeLa que expresan los NES-DEVD-YFP-NLS biosensores caspasa antes de (i), durante (ii -IV) y después (vx) la exposición a etanol 4,3% en medio de cultivo celular. Confocal de imágenes fusionadas del biosensor caspasa (verde), los núcleos teñidos con Hoechst (azul) y imágenes DIC (panel izquierdo), unas imágenes en blanco y negro de la señal de YFP (panel central), y un mapa de calor que indica la intensidad de la señal YFP (panel derecho) . (C) Los controles no tratados analizados como en el panel B. (D) cuantificado de las intensidades de fluorescencia para el biosensor de la caspasa nuclear activada en las células individuales (numeradas 1 y 2 en el panel de Bi) antes, durante y después de la exposición de etanol, y en los controles no tratados (numeradas 3 y 4 en el panel IC) se calcularon como el porcentaje de YFP presente en el núcleo (intensidad de señal celular YFP nuclear / totales x 100%). Los tiempos se indican como hr: min. Barra de escala, 10 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

ays "> Figura 4
Figura 4: La detección de la inversión de la apoptosis mediante marcado con fluorescencia anexina V (Reproducido con permiso del Tang et al, MBOC 23, 2240-2252 13, para las figuras 4A - B.). (A) Diagrama de la V-FITC ensayo de anexina anastasis utilizado en el panel B. (B) de rata neonatal miocitos ventriculares cardiacos primarios fueron expuestos a etanol 4,5% en medio de cultivo celular durante 5 h, y después se incubaron con anexina V-FITC para 10 min antes de la retirada del medio de etanol. Las células se fijaron de forma inmediata (tratados), o se fijan después de realimentación con un nuevo medio de una recuperación adicional de 2 horas (lavados). Las células no tratadas que fueron expuestos anexina V-FITC sirven como control (sin tratar). Mitocondrias teñidas con MitoTracker (rojas), los núcleos teñidos con Hoechst (azul) y anexina V-FITC (verde) se visualizaron por microscopía confocal, y la morfología celular se observó por microscopía DIC. Scbar de cervezas, 10 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Anastasis se refiere al fenómeno por el cual las células que han de células activadas por vía de la muerte posteriormente revertir el proceso de muerte y sobrevivir. Aquí, hemos demostrado que imágenes de células vivas se puede utilizar para confirmar que las mismas células individuales, de hecho, pueden revertir proceso de muerte celular apoptótica en una etapa tardía, y luego continuar sobrevivir y reproducirse. Nuestros protocolos describen varias condiciones de tratamiento específicas del tipo de células optimizado para inducir la apoptosis y permiten una gran proporción de las células a someterse a la reversión de la apoptosis monitoreado con varios biomarcadores para la verificación. En cuanto a las cuestiones técnicas, se usaron platos de fondo de cristal a células de cultivo para formación de imágenes 12,13, debido a la delgada de vidrio altamente transparente entre las células y el objetivo del microscopio, que permite distancias de trabajo largas para confocal de alta calidad o microscopía de epi-fluorescencia en la alta ampliación, facilita la observación de la apoptosis clásica que incluye la fragmentación mitocondrial, La liberación de citocromo c, y la condensación nuclear y la fragmentación. El vidrio también no distorsiona la polaridad de la luz, para permitir DIC microscopía de alta calidad para la supervisión de formación de ampollas en la membrana, la contracción celular de las células, y formación de cuerpos apoptóticos durante la apoptosis. Microscopía DIC tiene ventajas sobre la microscopía de contraste de fase para observar estas características morfológicas de la apoptosis, como DIC mejora el contraste de las muestras de células no teñidas y transparentes, mejorar la detección de morfologías celulares. Si DIC y microscopía de contraste de fases no están disponibles, CellTracker se puede utilizar para teñir el citosol para delinear la morfología de células vivas para la microscopía confocal o epi-fluorescencia y controlar la morfología de las células.

La aplicación de las dosis apropiadas de estímulos de muerte y las estrategias de la retirada de los estímulos son pasos críticos para la detección de anastasis. Hemos optado por utilizar bajas concentraciones de etanol como un estímulo de muerte para el descr experimentosibed aquí porque un gran porcentaje de las células tratadas pueden sufrir de manera uniforme la apoptosis y puede recuperarse de esto, potencialmente más suave, estímulo muerte. Sin embargo, estos enfoques pueden aplicarse también con éxito con otros estímulos de muerte, como hemos informado 12,13. Sin embargo, algunos estímulos de muerte son inherentemente más difíciles que otros, tales como estaurosporina (STS), un agente inductor de apoptosis de uso común. Tal vez porque se une a sus sustratos con elevada afinidad 46-48, lavados repetidos son esenciales, pero todavía no pueden eliminar eficazmente STS de las células. En este caso, el uso de concentraciones de fármaco inferiores y más corto tiempo de incubación de drogas que todavía pueden activar proceso de muerte apoptótica podría ser útil para permitir que más células para revertir la apoptosis. Re-alimentar las células con medio de cultivo celular acondicionado también puede mejorar la inversión de la apoptosis mejor que el medio de cultivo celular fresco. Las células apoptóticas son por lo general ligeramente unidos a la superficie de placa de cultivo sobre todo en vidrio surcaras, por lo tanto, es importante lavar los inductores de apoptosis suavemente para evitar separar las células. El recubrimiento de los platos de cristal con poli-D-lisina, colágeno y / o fibronectina podría aumentar la adherencia de las células para permitir ciertos tipos de células, tales como cardiomiocitos 37, para fijar correctamente en la superficie de vidrio de placas de cultivo celular, particularmente después de la exposición de las células a una estímulo muerte.

El proceso de la apoptosis, y es probable que la inversión de la apoptosis, depende de las actividades enzimáticas que pueden ser influenciados por la temperatura. Por lo tanto, el mantenimiento de las células a 37 ° C o en su condición de cultivo normal es importante en todo el proceso de formación de imágenes en vivo para asegurar la reproducibilidad de los resultados experimentales. Microscopio Pre-caliente antes de comenzar imágenes de células vivas es también un paso fundamental que permite a los componentes del microscopio para llegar a la termo-equilibrio. Esto puede evitar la deriva del enfoque y el desplazamiento del plano xy debido a la expansión y contracción térmica de lacomponentes durante imágenes de células vivas. Aplicación o eliminación del estímulo muerte cambiando el medio de una placa de cultivo, ya sea con una pipeta o por perfusión en el sistema de microscopía pre-calentado durante la exploración de lapso de tiempo todavía puede causar la deriva de enfoque debido a cambios en la temperatura o el volumen del medio. Adquisición Z-pila puede ayudar a las células de la imagen en el plano focal correcta, pero aumentará el riesgo de fototoxicidad debido a la exposición adicional de las células a los láseres fluorescentes. Alternativamente, el uso de sistemas de compensación de deriva de enfoque, tales como un sistema de corrección de enfoque automático basado en láser de infrarrojos, puede mantener las células en el mismo plano focal durante el lapso de tiempo imágenes de células vivas mediante el mantenimiento de la distancia entre la células / vidrio y el objetivo adicional sin la exposición de las células a longitud de onda corta, la fluorescencia fototóxico.

Liberación mitocondrial de proteínas apoptogenic tales como el citocromo c, y la activación de las caspasas efectoras, tales como la descarga / efectoo caspasa-3 y caspasa-7, se han considerado generalmente como el "punto de no retorno" en el 2,5,6 proceso de muerte celular por apoptosis. Western blots se han utilizado para detectar la escisión (activación) de la caspasa-3 y sus sustratos tales como poli (ADP) -ribose polimerasa-1 (PARP) y DFF45 / ICAD en toda la población de células durante la inducción de apoptosis y después de la eliminación de apoptótica estímulos, y reveló que escinde la caspasa-3, ICAD, y PARP se presentaron en las células durante la exposición a los estímulos de muerte, pero desapareció después de que se las células re-alimentación con medio de cultivo fresco 13. Sin embargo, estos métodos revelan la condición general de la población de células, pero no distinguen las células individuales que en última instancia van a morir de los que invertirá la apoptosis y luego sobrevivir. Fraccionamiento bioquímico para analizar la liberación de citocromo c mitocondrial tiene advertencias similares. Por lo tanto, para seguir el destino de las células individuales después de la liberación del citocromo c y la caspasa-activación, dos de las características más reconocidos de la apoptosis 2,5,6, GFP-etiquetados citocromo c (cito C-GFP) y un biosensor de la caspasa, tales como el utilizado aquí NES-DEVD-YFP-NLS, combinado con células vivas microscopía de evitar estos problemas mediante la observación directa de recuperación morfológica y la translocación de la biosensor cito C-GFP en las mismas células. Estos resultados indican la reversibilidad de la apoptosis después de la liberación del citocromo c mitocondrial y la activación de la caspasa.

El desafío actual para el estudio de anastasis es la falta de técnicas de etiquetado para detectar células que han sufrido anastasis en cualquier punto a lo largo de su vida útil, in vivo o in vitro. La expresión estable del biosensor caspasa NES-DEVD-YFP-NLS también permite la detección de la actividad caspasa si caspasas se activan de nuevo en el futuro, pero no registra permanentemente la actividad caspasa como el biosensor activado se degradará sin Sustaactividad caspasa ined 13. Otros biosensores de caspasa se ​​informó anteriormente, tales como los biosensores basados ​​en FRET SCAT (por ejemplo ECFP- [DEVD] -Venus) 26,49, así como reporteros fluorescentes Apoliner (CD8-RFP- [DQVD] GFP) 50 y CPV (por ejemplo, CD8 - [DEVD] -Venus) 51,52, se puede utilizar para detectar la actividad de caspasa en animales enteros y en células cultivadas, pero tienen limitaciones similares. Del mismo modo, cito C-GFP no puede ser utilizado para rastrear las células que revirtieron en apoptosis a largo plazo, ya que es liberado de las mitocondrias en el citosol durante la apoptosis y se degrada posteriormente. Etiquetado Anexina V ha sido utilizado para rastrear las células que revirtieron la apoptosis, pero la intensidad de la señal también disminuye con el tiempo, por lo que no es útil para el seguimiento a largo plazo de anastasis 13,45. Continua a largo plazo de imágenes in vivo podría ser utilizado para rastrear el destino de las mismas células después de la exposición de los estímulos de muerte. Sin embargo, a largo plazo de imágenes in vivo es aún un reto to realizar en la mayoría de los animales vivos. Por lo tanto se necesitan enfoques adicionales para ampliar la investigación anastasis a estudios en animales enteros, y para el cribado de fármacos que puedan estimular o inhibir anastasis utilizando células de cultivo de tejidos

En el futuro, se necesitan nuevos protocolos y técnicas que hacen un seguimiento del destino celular a largo plazo para desarrollar y probar las implicaciones fisiológicas, patológicas y terapéuticas de anastasis. Hemos propuesto que anastasis podría ser un mecanismo general la supervivencia celular para rescatar las células dañadas que son difíciles de reemplazar, tales como neuronas maduras y células cardiacas 13. Sin embargo, anastasis de las células cancerosas apoptóticas después de los tratamientos quimioterapéuticos podría dar lugar a la recuperación de las células peligrosas que conducen a la recurrencia de tumores resistentes 12,13. Anastasis también podría ser un importante mecanismo de la tumorigénesis, como algunas células muestran la transformación oncogénica después de que revirtieron la apoptosis 13. Por lo tanto, la mejora de anastasis podría ser un nuevo Theraestrategia tera- para inhibir la neurodegeneración y la insuficiencia cardíaca, mientras que la supresión anastasis como una nueva forma para prevenir o tratar los cánceres. El desarrollo de biosensores para realizar un seguimiento de reversión de la apoptosis en los sistemas de modelo de enfermedad hará avanzar la comprensión de los mecanismos de supervivencia celular de anastasis, y terapéuticos potenciales para enfermedades intratables mediante la modulación de anastasis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Agradecemos Rev. Dr. Ralph Bohlmann y el Rev. Dr. James Voelz por sugerir la palabra "Anastasis" para describir la reversión de la apoptosis; Douglas R. Green para las células HeLa que expresan de forma estable el citocromo c-GFP; Charles M. Rudin y Eric E. Gardner para H446 células; Heather Cordero para la asistencia en el dibujo de la historieta en el video; Yee Hui Yeo valioso para el debate de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por un Sir Edward Youde Memorial Fellowship (HLT), la Beca Dr. Walter Szeto Memorial (HLT), beca Fulbright 007-2009 (HLT), Fundación de Investigación de Ciencias de la Vida de becas (HLT), NIH subvenciones NS037402 (JMH) y NS083373 (JMH), y el Comité de Becas de la Universidad de Hong Kong AoE / B-07/99 (MCF). Ho Lam Tang es una Fundación Shurl y Kay Curci Fellow de la Fundación de Investigación de Ciencias de la Vida.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LSM780 confocal microscopy Carl Zeiss
Glass bottom culture dish MatTek Corporation P35G-0-14-C
Transparent CultFoi Carl Zeiss 000000-1116-084
CO2 independent medium Life Technologies 18045-088
CellTracker Life Technologies C34552
Mitotracker Red CMXRos Life Technologies M-7512
Hoechst 33342 Life Technologies H1399
Fluorescently labeled annexin V Biovision K201

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British Journal of Cancer. 26, 239-257 (1972).
  2. Riedl, S. J., Shi, Y. Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 897-907 (2004).
  3. Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
  4. Chipuk, J. E., Bouchier-Hayes, L., Green, D. R. Mitochondrial outer membrane permeabilization during apoptosis: the innocent bystander scenario. Cell Death and Differentiation. 13, 1396-1402 (2006).
  5. Kroemer, G., et al. Classification of cell death recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2009. Cell Death and Differentiation. 16, 3-11 (2009).
  6. Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death and Differentiation. 19, 107-120 (2012).
  7. Holland, A. J., Cleveland, D. W. Chromoanagenesis and cancer: mechanisms and consequences of localized, complex chromosomal rearrangements. Nature Medicine. 18, 1630-1638 (2012).
  8. Reddien, P. W., Cameron, S., Horvitz, H. R. Phagocytosis promotes programmed cell death in C. elegans. Nature. 412, (2001).
  9. Hoeppner, D. J., Hengartner, M. O., Schnabel, R. Engulfment genes cooperate with ced-3 to promote cell death in Caenorhabditis elegans. Nature. 412, 202-206 (2001).
  10. Segawa, K., et al. Caspase-mediated cleavage of phospholipid flippase for apoptotic phosphatidylserine exposure. Science. 344, 1164-1168 (2014).
  11. Overholtzer, M., et al. A nonapoptotic cell death process, entosis, that occurs by cell-in-cell invasion. Cell. 131, 966-979 (2007).
  12. Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. Reversibility of apoptosis in cancer cells. British Journal of Cancer. 100, (2009).
  13. Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Molecular Biology of the Cell. 23, 2240-2252 (2012).
  14. Hammill, A. K., Uhr, J. W., Scheuermann, R. H. Annexin V staining due to loss of membrane asymmetry can be reversible and precede commitment to apoptotic death. Experimental Cell Research. 251, (1999).
  15. Geske, F. J., Lieberman, R., Strange, R., Gerschenson, L. E. Early stages of p53-induced apoptosis are reversible. Cell Death and Differentiation. 8, 182-191 (2001).
  16. Jacobson, M. D., Weil, M., Raff, M. C. Programmed cell death in animal development. Cell. 88, 347-354 (1997).
  17. Hardwick, J. M., Cheng, W. C. Mitochondrial programmed cell death pathways in yeast. Developmental Cell. 7, 630-632 (2004).
  18. Frohlich, K. U., Fussi, H., Ruckenstuhl, C. Yeast apoptosis-from genes to pathways. Seminars in Cancer Biology. 17, 112-121 (2007).
  19. Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147, 742-758 (2011).
  20. Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 231-241 (2008).
  21. Wang, X. The expanding role of mitochondria in apoptosis. Genes & Development. 15, 2922-2933 (2001).
  22. Galluzzi, L., Kepp, O., Kroemer, G. Mitochondria: master regulators of danger signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biolog. 13, 780-788 (2012).
  23. Goldstein, J. C., Waterhouse, N. J., Juin, P., Evan, G. I., Green, D. R. The coordinate release of cytochrome c during apoptosis is rapid, complete and kinetically invariant. Nature Cell Biology. 2, 156-162 (2000).
  24. Goldstein, J. C., et al. Cytochrome c is released in a single step during apoptosis. Cell Death and Differentiation. 12, 453-462 (2005).
  25. Tyas, L., Brophy, V. A., Pope, A., Rivett, A. J., Tavare, J. M. Rapid caspase-3 activation during apoptosis revealed using fluorescence-resonance energy transfer. EMBO Reports. 1, 266-270 (2000).
  26. Takemoto, K., Nagai, T., Miyawaki, A., Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. The Journal of Cell Biology. 160, 235-243 (2003).
  27. Albeck, J. G., et al. Quantitative analysis of pathways controlling extrinsic apoptosis in single cells. Molecular Cell. 30, 11-25 (2008).
  28. Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death and Differentiation. 14, 641-650 (2007).
  29. Liu, X., Zou, H., Slaughter, C., Wang, X. DFF, a heterodimeric protein that functions downstream of caspase-3 to trigger DNA fragmentation during apoptosis. Cell. 89, 175-184 (1997).
  30. Enari, M., et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature. 391, 43-50 (1998).
  31. Li, H., Zhu, H., Xu, C. J., Yuan, J. Cleavage of BID by caspase 8 mediates the mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis. Cell. 94, 491-501 (1998).
  32. Slee, E. A., Keogh, S. A., Martin, S. J. Cleavage of BID during cytotoxic drug and UV radiation-induced apoptosis occurs downstream of the point of Bcl-2 action and is catalysed by caspase-3: a potential feedback loop for amplification of apoptosis-associated mitochondrial cytochrome c release. Cell Death and Differentiation. 7, 556-565 (2000).
  33. Suzuki, J., Denning, D. P., Imanishi, E., Horvitz, H. R., Nagata, S. Xk-related protein 8 and CED-8 promote phosphatidylserine exposure in apoptotic cells. Science. 341, 403-406 (2013).
  34. Kroemer, G., Martin, S. J. Caspase-independent cell death. Nature Medicine. 11, 725-730 (2005).
  35. Chipuk, J. E., Green, D. R. Do inducers of apoptosis trigger caspase-independent cell death. Nature Reviews Molecular Cell Biolog. 6, 268-275 (2005).
  36. Tait, S. W., Green, D. R. Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 621-632 (2010).
  37. Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 2979-2984 (1998).
  38. Zhang, G., Gurtu, V., Kain, S. R., Yan, G. Early detection of apoptosis using a fluorescent conjugate of annexin V. BioTechniques. 23, 525-531 (1997).
  39. Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2, 1084-1104 (2007).
  40. Fenech, M., et al. Molecular mechanisms of micronucleus, nucleoplasmic bridge and nuclear bud formation in mammalian and human cells. Mutagenesis. 26, 125-132 (2011).
  41. Gordon, D. J., Resio, B., Pellman, D. Causes and consequences of aneuploidy in cancer. Nature Reviews Genetics. 13, (2012).
  42. Poreba, M., Strozyk, A., Salvesen, G. S., Drag, M. Caspase substrates and inhibitors. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a008680 (2013).
  43. Talanian, R. V., et al. Substrate specificities of caspase family proteases. The Journal of Biological Chemistry. 272, 9677-9682 (1997).
  44. Logue, S. E., Elgendy, M., Martin, S. J. Expression, purification and use of recombinant annexin V for the detection of apoptotic cells. Nature Protocols. 4, 1383-1395 (2009).
  45. Kenis, H., et al. Annexin A5 uptake in ischemic myocardium: demonstration of reversible phosphatidylserine externalization and feasibility of radionuclide imaging. Journal of Nuclear Medicine. 51, 259-267 (2010).
  46. Ruegg, U. T., Staurosporine Burgess, G. M. K-252 and UCN-01: potent but nonspecific inhibitors of protein kinases. Trends in Pharmacological Sciences. 10, 218-220 (1989).
  47. Bertrand, R., Solary, E., O'Connor, P., Kohn, K. W., Pommier, Y. Induction of a common pathway of apoptosis by staurosporine. Experimental Cell Research. 211, 314-321 (1994).
  48. Chae, H. J., et al. Molecular mechanism of staurosporine-induced apoptosis in osteoblasts. Pharmacological Research. 42, 373-381 (2000).
  49. Takemoto, K., et al. Local initiation of caspase activation in Drosophila salivary gland programmed cell death in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13367-13372 (2007).
  50. Bardet, P. L., et al. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13901-13905 (2008).
  51. Florentin, A., Arama, E. Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell. The Journal of Cell Biology. 196, 513-527 (2012).
  52. Chihara, T., et al. Caspase inhibition in select olfactory neurons restores innate attraction behavior in aged Drosophila. PLoS Genetics. 10, e1004437 (2014).

Tags

Biología Celular Número 96 Anastasis apoptosis cuerpos apoptóticos caspasa la muerte celular contracción celular de suicidio celular citocromo c daño en el DNA alteraciones genéticas permeabilización de la membrana mitocondrial externa (MOMP) muerte celular programada Inversión de la apoptosis
Estrategias para Anastasis Seguimiento, una célula de supervivencia Fenómeno que Invierte Apoptosis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick,… More

Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis. J. Vis. Exp. (96), e51964, doi:10.3791/51964 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter