Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Стратегии для слежения Воскресения, выживание феномен клеточной который меняет апоптоз

Published: February 16, 2015 doi: 10.3791/51964
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1, 2
1W. Harry Feinstone Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health, 2School of Life Sciences, Chinese University of Hong Kong, 3Center for Cell Dynamics, Department of Biological Chemistry, Johns Hopkins University School of Medicine

Abstract

Воскресение Христово (греч для "растет к жизни") относится к восстановлению умирающих клеток. Прежде, чем эти клетки восстановить, они прошли через важные контрольно-пропускных пунктов апоптоза, в том числе митохондриальных фрагментации, освобождения митохондриального цитохрома С в цитозоль, активацией каспаз, конденсацию хроматина, повреждение ДНК, ядерной фрагментации, плазменные мембраны блеббинга, мобильный усадки, воздействия на клеточной поверхности фосфатидилсерина, и формирование апоптотических тел. Воскресение может произойти, если апоптические стимулы удаляются до смерти, позволяя тем самым умирающие клетки обратной апоптоз и потенциально другие механизмы смерти. Таким образом, Воскресение-видимому, включает физиологические процессы заживления, которые также могут поддержания поврежденные клетки не по назначению. Функции и механизмы Воскресения до сих пор неясны, препятствует частично ограниченных инструментов для обнаружения прошлые события, произошедшие после восстановления здоровых клеток. Стратегии для обнаружения AnastaSIS позволит исследования физиологических механизмов, опасности нежити клеток в патологии болезни и потенциальные терапевтические модулировать Воскресения. Здесь мы опишем эффективные стратегии с использованием живых микроскопии клеток и млекопитающих каспазы биосенсора для выявления и отслеживания Воскресения в клетках млекопитающих.

Introduction

Апоптоз (по-гречески "падения до смерти"), как правило, предполагается, что односторонний процесс заканчивается в самоубийство клеток 1-7. Генетический сбой про-смерти генов приводит к выживанию дополнительных клеток, которые могли бы умереть в целых животных, в том числе клеток, которые уже приступили к апоптоза 8,9. Кроме того, генетические манипуляции позволяют здоровые клетки млекопитающих, которые искусственно отображения "Съешь меня" сигналы или которые теряют адгезией к их внеклеточного матрикса, чтобы избежать смерти по всей фагоцитоза клеток или Энтоз, соответственно 10,11. Тем не менее, мы и другие показали, что без генетических манипуляций нормальных здоровых клетках млекопитающих и клеточные линии также может выйти из ранних стадиях апоптоза 12-15. Использование инструментов для отслеживания отдельных клеток, мы еще больше продемонстрировали восстановление от поздних стадиях апоптоза 12,13, после клетки были приняты важные контрольные точки, которые типичныLY отметить «точку невозврата» 2-6. Эти контрольно-пропускные пункты позднего апоптоза этапе, включают митохондриальную выпуск цитохрома С, активацию каспаз, фрагментация ядер, и формирование апоптотических телец. Мы приняли греческую составное слово "Воскресение", что означает "рост к жизни", чтобы описать это обращение апоптоза на грани гибели клеток 2-6.

Если весь процесс умирание-восстановление не наблюдалось изображений живых клеток, это вызов, чтобы отличить клетки, которые прошли Воскресения из клеток, которые никогда не испытывали апоптоза события. Десятилетия работы показали, что морфологические особенности клеток самоубийства путем апоптоза движет эволюционно консервативных биохимических и молекулярных событий 16-19. Эти мероприятия способствуют самоуничтожение клеток регулировать развития и homoeostatic процессы в одноклеточных и многоклеточных организмов путем устранения повреждения или dс опасными клетки 16-19. В то время как апоптотических клеток может быть легко отличить от стандартных морфологических, биохимических и молекулярных проявлений апоптоза 1,5,6,16,20, в настоящее время нет никакого известного маркера специфичные для Воскресения 12,13. Важно отметить, что клетки, которые подверглись анастасис оказаться нормальные здоровые клетки, и клетки, которые просто начать вспять апоптоз появляются как апоптические умирающих клеток 12,13. Таким образом, новые инструменты необходимы заключить с уверенностью сказать, что данный выживания клеток ранее испытывали активные апоптоза процессы.

Апоптоз, как правило, рассматривается в качестве необратимой каскада, потому что это быстрое и массовое процесса уничтожения. В то время как это может занять несколько минут до нескольких дней для некоторых клеток, чтобы начать апоптоз, как только митохондрии выпустили апоптогенных такие факторы, как цитохром С в цитозоль 21,22, каспазы может быть активирована в течение 5 минут 23,24, а затем цитоплазматических иядерная конденсация течение 10 мин 25-27, и гибель клеток вскоре после 25-27. Активированные каспазы организовать апоптоз путем расщепления и инактивации ключевых структурных и функциональных компонентов для целей клеточной сноса 2,28, такие как эндонуклеазы ингибитора DFF45 / ИАП 29,30. Каспазы активировать проапоптотического факторы, такие как член BID BCL-2 семейства, которые транслоцируется митохондрий содействовать митохондрий высвобождается цитохром С. 31-32. Активность каспазы также приводит к воздействию клеточной поверхности фосфатидилсерина, как «Съешь меня» сигнала для продвижения полном охвате смерти клеток макрофагами или соседними клетками посредством фагоцитоза 33. Кроме того, апоптические события оказывают митохондрии неблагополучных, нарушая клеточные биоэнергетику и метаболизм 34,35,36. Таким образом, выход из такого уничтожения интуитивно кажется маловероятным.

В отличие от оригинала ожидатьдимости клетки могут повернуть вспять процесс апоптоза клеточной смерти, даже на поздней стадии. Путем непрерывного мониторинга судьбу умирают клетки в культуре, мы наблюдали обратимость конце стадии апоптоза в диапазоне первичных клеток и клеточных линий 12,13. Удаление смертной стимула позволила восстановить от явных признаков апоптоза, таких как митохондриальной фрагментации, конденсации хроматина, повреждение ДНК, плазматической мембраны, блеббинга, клеточной поверхности контакта фосфатидилсерина, выпуск митохондриальной цитохром с, активации каспазы, ядерной фрагментации, мобильный усадки, и формирование апоптотических телец. Эти наблюдения поднять без ответов вопросы, касающиеся функций, последствий и механизмов Воскресения. Для решения этих вопросов, условием является, чтобы надежно идентифицировать клетки, которые прошли Воскресения. Здесь мы опишем живые методы микроскопии и каспазы биосенсора для выявления клеток, которые ранее обратную поздней стадии апоптоза и еан выжил.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка клетки для живых клеток изображений

  1. Для облегчения обнаружения морфологических изменений, выберите прилипшие клетки, такие как клетки HeLa (рак шейки матки человек) клеток, которые являются плоскими на подложке, чтобы лучше визуализировать изменение плазматической мембраной и внутриклеточных органелл.
    Примечание: Восстановление апоптоза наблюдается в различных клетках млекопитающих, в том числе 12,13 первичной клетки печени мышей, первичных макрофагов мыши, крысы первичных кардиомиоцитов, а также клеточные линии, такие как почки эмбриона человека НЕК-293Т, африканской зеленой мартышки почечных эпителиальных COS -7 клетки, мыши сердечной мышцы HL-1 клетки, мыши NIH 3T3 фибробласты, хорек (Mustela putoris фуро) головного мозга CRL1656 клетки, клетки рака кожи А375 клетки, рак яичка CRL1973 клетки человека, человека мелкоклеточный рак легких H446 клетки, клетки рака печени HepG2 клетки, рака молочной железы человека MCF7 клетки, клетки рака простаты PC3 клетки, и нейробластомы SH-SY5Y клетки человека.
  2. Предварительная стирка покровные стекла стеклянных дно культуре клеток блюд с абсолютным этанолом для очистки и стерилизации.
    Примечание 1: Использование стеклянным дном посуды рекомендуется для высокого качества дифференциального интерференционного контраста (DIC) микроскопии и большом увеличении конфокальной или эпи-флуоресцентной микроскопии (см обсуждения).
    Примечание 2: Для больших увеличениях (40х, 60 / 63x или 100x целей и высокой числовой апертуры 1,3 или 1,4), использование чашки для культивирования клеток с более тонким стеклянным дном (толщина 0.085-0.16 мм) обеспечивает более рабочих расстояний для визуализации (См Протокол 3 ).
  3. В зависимости от типа клеток, со стеклянным дном культуры блюда могут потребовать покрытие с поли-D-лизином (0,1 мг / мл), коллаген (0,01% -ного раствора в 0,01 М уксусной кислоты) и / или фибронектина (5 мкг / мл) перед посевом клетки.
    Примечание: Оптимизация типа и концентрации покрывающего агента требуется для различных клеточных линий. HeLa-клетки могут придерживаться прямо на стекле без покрытия. Тем не менее, некоторые клетки, суч, как мыши сердечной мышцы HL-1 клеток, не может придерживаться прямо на стеклянных поверхностях, но требуют определенной культуры и покрытие протоколы 37.
  4. Семя ~ 2-3 х 10 5 клеток на 35 мм стеклянные предварительно покрыть дно электролизера блюд культуры и инкубировать при 37 градусах Цельсия (° C) с 5% CO 2 в течение дня, чтобы достичь 80% слияния.
    Примечание 1: Оптимальные условия плотности клеток, времени инкубации, и условия культивирования может варьироваться в зависимости от типа клеток. Сотовый конфлюентности может влиять на реакцию апоптоза клеток (см протокол 2). При высокой слияния, клетки могут быть менее чувствительны к тех же концентрациях апоптоза раздражителей.
    Примечание 2: Избегайте чрезмерного сливной клетки, а высокая плотность клеток может скрыть морфологические изменения отдельных клеток и их органелл.

2. Применение и удаление апоптотических клеток стимулов

  1. Незадолго до использования, предварительно смешать апоптоз-индуцирующего агента с 37 ° C среде для культивирования клеток. Этанол (3,6-4,5% Об / об) служил индуктор апоптоза по настоящему демонстрации.
    Примечание 1: Представленные и неопубликованные данные показывают, что клетки могут также обратное апоптоз, который срабатывает другой апоптоза раздражителей 12,13, такие как диметилсульфоксид (ДМСО, 8% об / об в течение 24 ч), стауроспорина (STS, 0,5 мкМ для 1 час), и таксол (1 мкМ в течение 12 ч). Оптимизация дозировки для запуска апоптоза требуется для различных видов клеток, чтобы достичь минимального дозы, которые могут вызвать большинство клеток в популяции к апоптозу.
    Примечание 2: предварительного смешивани, индуцирующего апоптоз агенты с клеточной культуральной среды важно, чтобы избежать неравномерного экспозицией клеток с апоптотических стимулов.
  2. Изображение группа клеток здравоохранения в культуре клеток блюдо перед нанесением апоптозиндуцирующей агента установления базовых морфологии.
  3. Удалить исходный носитель из клеточной культуральной чашке, а затем применить 2 мл предварительно смешанного апоптоз-индуцирующего агента на блюдовызвать клетки к апоптозу. Инкубируйте клетки при 37 ° С с 5% СО 2 (или другие обычные условия культивирования).
  4. После инкубации клетки соблюдать светом, эпи-флуоресценции или конфокальной микроскопии для мониторинга прогрессирования апоптотических признаков.
    Примечание 1: клеток, подвергающихся апоптозу покажет морфологические, биохимические и молекулярные признаки апоптоза, что может быть обнаружено с помощью микроскопии и флуоресценции основе биосенсоров (см Протоколы 3 и 4).
    Примечание 2: Время инкубации клеток с различными индукторами апоптоза будет варьироваться в зависимости от типа клеток, клеточных условий (таких, как слияния и питательной статуса), а также дозы смерти стимул прикладной. Тщательное титрование может потребоваться.
  5. Когда клетки отображения признаки апоптоза, удалить апоптоз-индуцирующего агента путем промывки клетки один раз с теплым (37 ° С, или другой температуре нормальной культуральной) свежего клеточной культуральной среды.
    Примечание 1: В апоптоза клетки более свободно прикрепленакультура пластины, важно, чтобы применить и удалить среду аккуратно так, чтобы клетки не будут смыты.
    Примечание 2: Живая суспендируют клетки могут быть выделены из супернатанта, осторожно центрифугирования (160 мкг в течение 1 мин) и добавляли обратно в чашку для культивирования.
  6. Инкубируйте клетки при 37 ° С с 2 мл / 35 мм чашку свежего клеточной культуральной среды в 5% СО 2. Кроме того, использование кондиционированной средой (клеточная бесплатно культуральной среды собирали из здоровых клеток) в целях дальнейшего повышения выживаемости апоптотических клеток.
    Примечание: Промывка и инкубации клеток свежей средой позволяют большинство клеток в обратном этанол-индуцированного апоптоза после воздействия этанола 12,13. Тем не менее, повторяя эту стадию промывки может потребоваться, когда клетки подвергаются воздействию других апоптотических стимулов (обсуждение см).

3. Живая сотовый микроскопия

  1. Мы рекомендуем использовать перевернутую конфокальной или эпи-флуоресцентный микроскоп с экологического контроля (37 ° C,5% CO 2) в течение живые клетки микроскопии.
    Примечание: Можно также, чтобы изображение клетки с помощью вертикально микроскопы с водой для окунания цели. Dip цели непосредственно в культуральной среде с изображением клеток. Тем не менее, клетки могут быть раздавлены погружения цели во время фокусировки.
  2. Предварительно прогреть микроскопа (например, камеры контроля окружающей среды, Стадия инкубатор, и объективной нагревателя) по меньшей мере 2 ч перед визуализации.
    Примечание: Это позволяет компонентам микроскопом, чтобы достичь термо-равновесие, так что он может избежать дрейф фокуса и сдвига плоскости ху из-за теплового расширения и сжатия компонентов.
  3. Поставьте 35 мм со стеклянным дном блюдо культуре клеток (см протокол 1) на стадии инвертированного микроскопа и захватить изображений клеток с использованием 40X или 63X план-Apochromat цели с числовой апертурой (NA) 1.3 или 1.4 для работы с изображениями клетки от Дно блюда через покровные стекла.
    Примечание: Избегайте применения более 2 мл среды35 мм со стеклянным дном тарелки, а вес среды может привести к кривизне стеклянным дном, что затрудняет изображения поле клеток, в то же фокальной плоскости.
  4. Поддержание клеток при 37 ° С или соответствующей нормальной температуре в течение всего процесса формирования изображения.
    Примечание: процесс апоптоза, и, вероятно, изменение апоптоза, зависит от температурно-чувствительных ферментативной активности. Таким образом, поддержание клеток при 37 ° С (например, с столике микроскопа сверху инкубатор) имеет важное значение в течение всего эксперимента. Снижение температуры может замедлить апоптотический ответ и ответ для восстановления после удаления апоптоза стимул.
  5. Используйте устройство влажности или заложить прозрачную пленку (см материалы) по культуре блюдо, чтобы уменьшить потери воды за счет испарения из среды.
    Примечание: фольга может нарушить полярность света для ДВС микроскопии. Восстановление полярность, регулируя поляризатор на пути прохождения света.
  6. Поддержание рН вклеточная культуральная среда (рН 6,8 -7,3) путем инкубации в 5% CO 2 с окружающей камеры управления на микроскопе.
    Примечание: Обслуживание рН в культуральной среде могут быть также достигнуты путем добавления HEPES буфера, или с помощью коммерческого СО 2 Независимые среды (см Материалы). Оптимальные условия могут варьироваться в зависимости от типа клеток.
  7. Свернуть флуоресценции / лазера (интенсивность возбуждающего света) воздействия клеток в процессе визуализации, чтобы избежать фототоксичность путем уменьшения интенсивности флюоресценции низкая, необходимые для получения высококачественных изображений клеток / субклеточных структур или выраженных биосенсоров (подробности в протоколе 4).

4. Стратегии обнаружения и отслеживания Воскресения во время и после АПОПТОТИЧЕСКУЮ События

  1. Плазменные мембраны блеббинга, цитоплазматическая конденсации, сотовый усадки и образования апоптическая тела (см 1А - C, E).
    1. Выполните покадровой сиситемах живой клеткеrential интерференционный контраст (DIC) или фазовый контраст микроскопии для отслеживания группу ячеек здоровья и наблюдать за их морфологии клеток (см протокол 3 для живых клеток микроскопии и обсуждение см).
      Примечание 1: уменьшить интенсивность источника света для визуализации контракта ДВС / фазы, чтобы избежать фототоксичности к клеткам.
      Примечание 2: Если DIC и фазовый контраст микроскопии не доступны, используйте CellTracker чтобы посрамить цитозоль наметить морфологии живых клеток для конфокальной или эпи-флуоресцентной микроскопии и контролировать морфологию клеток.
    2. Применить клеточной смерти стимул, чтобы вызвать клетки к апоптозу (См Протокол 2 для применения и удаления апоптотических стимулов).
    3. Заметим, обработанных клеток для морфологических признаков апоптоза, таких как мембраны плазмы блеббинга, цитоплазматического конденсации, мобильный усадки и апоптоза формирования тела (1А, 1В, 1С, 1Е).
    4. Смыть смерти стимулы, и клетки повторно поставок свежей средой, когда клетки ДИСПЛЕЙу морфологическими признаками апоптоза.
      Примечание 1: Применение клеточной гибели стимул или изменение клеточную культуральную среду на столике микроскопа при покадровой изображений живых клеток может быть достигнуто с помощью камеры перфузии клеточной культуре или могут быть выполнены непосредственно на клетки культуральной чашке, тщательно пипетки, не касаясь блюдо, в промежутках между изображениями.
      Примечание 2: Использование фокус системы компенсации дрейфа, чтобы избежать в фокусе клеток из-за потери термо-равновесия системы микроскопа после изменения клеточную культуральную среду (обсуждение см).
    5. Непрерывная покадровой обработки изображений, чтобы отслеживать судьбу клеток, которые отображают признаки апоптоза. Клетки, которые меняют апоптоз может восстановить повреждения и восстановить нормальную плоским морфологии (1А, 1B, 1C, 1E).
  2. Митохондриальная фрагментация ДНК / конденсации хроматина и фрагментация ядер (рисунки 1D, 1F, 1G).
    1. Для визуализации mitochondРИА, пятен клетки с 50 нМ Mitotracker красный / темно-красного / зеленого флуоресцентного красителя, и одновременно окрашивает ядро с 10 мкг / мл Hoechst 33342 голубой ядерного красителя в культуральной среде в течение 20 мин при 37 ° С с 5% СО 2.
      Примечание 1: снижение концентрации красителей и длительности инкубации, чтобы избежать цитотоксичности и уменьшить фоновой флуоресценции при необходимости. Оптимизация условий окрашивания, чтобы получить хороший сигнал к шуму с минимальным количеством времени красителя и инкубационного окрашивания.
      Примечание 2: Используйте флуоресцентные пятна митохондрий, таких как Mitotracker Красной CMXRos, Mitotracker Deep Red FM, или Mitotracker Green FM, что не просачивается из митохондрий в процессе апоптоза. Это позволяет визуализировать митохондриальную морфологию во время апоптоза и Воскресения. См материалы и таблицы оборудование для подробной информации об этих пятен.
    2. Держите окрашенных клеток в темноте, чтобы избежать фотообесцвечивания.
    3. Удалите излишки пятно промыванием клеток3 раза с 37 ° C фосфат-буферном солевом растворе (PBS) раствора или свежей среде для культивирования клеток, с 1 мин инкубации в свежей среде между каждой промывки, а затем дополнительно инкубируют в свежей среде в течение 20 мин перед окончательной промывки, чтобы избыточное пятна, чтобы выйти из клетки, чтобы уменьшить неспецифический фон сигнала для визуализации.
      Примечание: Сократить время инкубации с клеточной среды после окрашивания может привести к высоким фоном для работы с изображениями.
    4. Выполните реального времени на конфокальной клеток или эпи-флуоресцентной микроскопии для изображения здоровых клеток до апоптическая индукция применяется (см протокол 3 для живых клеток микроскопии).
      Примечание: Здоровые клетки отображения трубчатые митохондрии и круглые ядра в большинстве типов клеток (рис 1D, 1F, 1G).
    5. Триггер клеток к апоптозу (см протокол 2 для применения и удаления апоптотических стимулов к клеткам).
    6. Продолжить времени покадровой живая клетка микроскопии наблюдать изменения в митохондриальной и ядерной morphologх годов сразу же после смерти стимул к клеткам. Заметим, клетки, чтобы показать признаки апоптоза, таких как митохондриальной фрагментации и отек, конденсации хроматина и фрагментации ядерной, в отличие от здоровых клеток, воспроизводящих трубчатые митохондрии и круглые ядра.
    7. Когда клетки отображать признаки апоптоза, вымыть и поставить клетки со свежей среде, и продолжают покадровой обработки изображений, чтобы отслеживать судьбу клеток. Клетки, которые меняют апоптоз восстановить нормальную митохондриальной и ядерной морфологии (рис 1D, 1F, 1G).
      Примечание: Выполнение DIC микроскопии параллельно, когда это возможно, чтобы получить дополнительную информацию для доступа к стадии апоптоза при соблюдении изменения морфологии клеток в одной и той же группы клеток (см протокол 4,1 для DIC микроскопии).
  3. Обнаружение митохондриальной выпуска цитохрома С с использованием клеток, стабильно выражая цитохрома с -GFP слияние прotein (рисунок 2).
    1. Пятно клетки, стабильно экспрессирующие цитохром С -GFP 23,24 с Mitotracker красный для обозначения поляризованные митохондрии клеток (см шаги с 4.2.1 и 4.2.3 для живого окрашивания клеток митохондрии).
    2. Выполните в режиме реального времени живой клетки конфокальной или эпи-флуоресцентной микроскопии для отслеживания здоровых клеток (детали в Протоколе 3 для получения изображений живых клеток).
      Примечание: -GFP сигнал цитохром с, прежде всего, локализуется в митохондриях здоровых клеток (рис 2А я, 2В).
    3. Триггер клеток к апоптозу (см протокол 2 для применения и удаления апоптотических стимулов к клеткам). Продолжить покадровой микроскопии наблюдать перемещение цитохром с -GFP из митохондрий в цитозоль (рис 2aii-III, 2Б).
      Примечание: митохондриальной высвобождение цитохрома с в цитозоль является маркером митохондриальной наружной мембраны проницаемости (МОМР)4, важным шагом в митохондриях зависит от апоптоза 21,22
    4. Когда клетки отобразить цитохрома с -GFP сигнал в цитоплазме, удалите клеточной гибели стимул, и на поставку ячеек свежей средой (см протокол 2). Продолжить покадровой обработки изображений, чтобы отслеживать судьбу клеток с цитозольным GFP.
      Примечание: клетки, которые вспять апоптоз восстановить нормальную морфологию клеток и снижают их цитозольную цитохрома с -GFP сигнал, предположительно из-за деградации или транслокации обратно в митохондриях (рис 2Aiv-VII, 2Б).
    5. Захват DIC изображения параллельно для получения дополнительной информации для доступа к стадиях апоптоза, наблюдая изменения в морфологии клеток в одиночных камерах или группы клеток (см протокол 4.1 для ДВС микроскопии).
  4. Обнаружение активности каспазы с помощью каспазы биосенсора (рисунок 3)
    1. Трансфекции клеток с каспазы биосенсора РЭШ-DEVD-YFP-NLS дляОт 16 до 24 ч до подвергая их апоптоза стимул 13.
    2. Пятно трансфектированных культур с Hoechst 33342, чтобы маркировать клеточные ядра (см шаги с 4.2.1 и 4.2.3 для живого ядерного окрашивания клеток).
    3. Выполните в режиме реального времени живой клетки конфокальной или эпи-флуоресцентной микроскопии для отслеживания здоровых клеток (детали в Протоколе 3 для получения изображений живых клеток).
      Примечание: биосенсора сигнал NES-DEVD-YFP-NLS, прежде всего, локализуется в цитозоле здоровых клеток из-за его ядерной экспорта сигнала (РЭШ) (3А, 3Bi и 3С, обсуждение см).
    4. Триггер клеток к апоптозу (см протокол 2 для применения и удаления апоптотических стимулов к клеткам). Продолжить покадровой микроскопии наблюдать ядерную транслокацию YFP.
      Примечание: Активация каспаз расщепляет DEVD мотив в каспазы биосенсора РЭШ-DEVD-YFP-NLS, в результате чего YFP-NLS транслокации из цитозоля в ядро (рис 3А, 3Bii-IV, см обсуждения).
      5. Примечание: Клетки, которые апоптоза обратного вернуть нормальную морфологию клеток, но при этом сохранить ядерный сигнал YFP (цифры 3BV-X, клетки 1 и 2, и 3D).
    5. Продолжить покадровой обработки изображений, чтобы отслеживать судьбу клеток, которые отображают ядерной YFP.
      Примечание: сигнал ядерной YFP деградирует через несколько часов после клетки вспять апоптоза (рис 3B, Vi-х, Сотовые 1, см Результаты и их обсуждение), предположительно с помощью обычных механизмов очистки клеток, таких как деградация протеасомного.
    6. Захват изображения DIC параллельно, чтобы получить дополнительную информацию для доступа к стадии апоптоза, наблюдая изменения в морфологии клеток в отдельные клетки или группы клеток. (См протокол 4.1 для ДВС микроскопии).
  5. На поверхности клетки воздействие фосфатидилсерина (Рисунок 4)
    1. Семенной клетки на GLосел покровные для достижения 80% слияния клеток (см протокол 1).
    2. Co-окрашивания клеток с красно-флуоресцентного Mitotracker и голубой Hoechst 33342 пятно для митохондрий и ядер соответственно (см шаги с 4.2.1 и 4.2.3 для живого митохондриальной клеток и ядерной окрашивания).
    3. Trigger клетки к апоптозу с помощью апоптоза (см протокол 2).
    4. Применение флуоресцентного меченого аннексина-V (см Материалы) на пятно апоптотических клеток в течение 10 мин при 37 ° С перед удалением апоптоза обнаружения воздействия фосфатидилсерина на поверхности апоптотических клеток.
      Примечание 1: здоровые клетки не окрашиваются аннексином V, потому что фосфатидилсерин, как правило, изолированы на внутренней-листке плазматической мембраны 38. Апоптотических клеток окрашивали аннексина V, который связывается с фосфатидилсерина на клеточной поверхности (фиг.4А и 4В).
      Примечание 2: Флуоресцентный-меченого аннексина V может также применяться для окрашивания апоптотических клеток иммигрантамediately после удаления апоптоза, с 10-минутной инкубации.
    5. Удалить гибели клеток стимул, мыть окрашенных клеток с теплой PBS или свежей средой один раз, а затем поставить клетки со свежей среде в течение 2 ч при 37 ° С с 5% СО 2 (см протокол 2).
      Примечание 1: Клетки, которые обратные апоптоз восстановить нормальную морфологию и сохранить флуоресцентно меченого аннексина V сигнал после восстановления нормальной морфологии (4а, и 4B).
      Примечание 2: аннексин V сигнала уменьшается со временем на выделенных клеток (см обсуждения).
    6. Исправить клеток в выбранных временных точках 4% параформальдегидом, содержащим 8% сахарозы в 1x PBS в течение 20 мин в темноте при комнатной температуре, и мыть фиксированные клетки с PBS 3 раза, чтобы удалить перед установкой параформальдегида клеток на предметных стеклах с покровные antifade mountant (См материалы) для конфокальной или эпи-флуоресцентной микроскопии и наблюдать аннексин V на клетки после удаления апоптоза.
      Примечание 1: Сахароза в фиксатор сохраняет структуру клеточной мембраны во время фиксации.
      Примечание 2: Хранить -ном растворе параформальдегида в темноте при 4 ° С для предотвращения деградации.
      Примечание 3: Разминка параформальдегида раствора до комнатной температуры перед его применением к клеткам для фиксации, чтобы избежать холодового шока в клетки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Для изучения разворот апоптоза, культуры тканей клетки сначала подвергаются смертной стимул, чтобы вызвать апоптоз. Когда клетки отображения признаки апоптоза, свежую культуральную среду затем применяется, чтобы смыть стимул, а затем инкубируют умирающие клетки, чтобы позволить восстановления (фиг.1А). Здесь ключевой вопрос решается, как далеко отдельные умирающие культивируемые клетки может двигаться в направлении апоптоза и до сих пор подвергаются Воскресения. Этот вопрос может быть окончательно ответить непрерывного мониторинга с биомаркеров для отслеживания сотовых судьбы, используя методы, описанные ниже.

Прежде всего опишем наши стратегии для обнаружения реверсирование апоптоза в клетках тканевой культуры с помощью покадровой микроскопии живых клеток, который необходим для отслеживания и записи реакции отдельных клеток до, во время и после воздействия стимула апоптоза 12,13. Здоровые прилипшие клетки распространяются на их прилагается субстрата (Рисунок 1Bi) 12,13, и отображается нитевидные митохондрии и круглые ядра до лечения (рис 1CI, Ди, Эй, Fi, Gi) 12,13. После экспозиции в 3,8-4,5% этанола в среде для культивирования клеток (об / об), DIC или фазово-контрастной микроскопии показало, что клетки выставлены морфологические признаки апоптоза, в том числе цитоплазматической конденсации, плазматической мембраны блеббинга, и клетки усадки (фиг 1Bii, 1Cii- III, и 1Eii-VI) 12,13. Формирование тела апоптоза теми же клетками легко наблюдать с помощью DIC (цифры 1Eii-VI). Фрагментация Mitotracker-меченых митохондрий (рис 1Dii-III, 1Fii-VI) 12,13, а также конденсации Hoechst-окрашенных ядерной ДНК (Рисунки 1Dii-III, Fii-III, ГИИ) 12,13 и фрагментации ядер (ИнжирОЭС 1Evi и FVI, белые стрелки) были обнаружены одновременно с помощью конфокальной или эпи-флуоресцентной микроскопии. Клетки, которые успешно вспять апоптоз были впоследствии наблюдается восстановление нормальной морфологией, по-видимому ремонт их повреждения (рис 1Biii, C и Див-VI, E и фактора VII-XII, и GIII) 12,13. Клетки в этих условиях также было показано, чтобы восстановить органелл подвижности, миграции клеток и функциональную эндоцитоза на основе поглощения флуоресценции излучения квантовых точек и деление клеток 13. Интересно, что некоторые клетки, которые почитали апоптоз, отображаемые неправильную морфологии ядра (рис 1Fxii), а также аномальные деления клеток и образование микроядер (рис 1Giv-VII) 13, который биомаркеров повреждения ДНК, разрывов хромосом и всей потери хромосом в делящихся клетках 39, 40. Перемещенные Cхромосомного набора или фрагменты хромосом вне не включаются в дочь клеточных ядер окружены ядерной мембраны 39, 40. Таким образом, следствием Воскресения может быть укрывательство геномов, которые были повреждены во время прерванного апоптоза, что приводит к туморогенезу и прогрессирования рака. Наличие микроядер является обычным явлением в раковых клетках 40,41.

Выпуск митохондриальной цитохром с является важным шагом в качестве посредника или усиливать каспазы-зависимый апоптоз 20-22. Использование HeLa клетки, которые стабильно экспрессируют GFP с метками цитохром с, мы следили за субклеточную переселение цитохрома С в течение апоптоза и Воскресения на конфокальной микроскопии. Как сообщили 23,24, цитохром с -GFP локализуется в митохондриях до лечения (рис 2Ai и B), но потом был выпущен в цитозоль после смерти стимул был применен (Рисунки 2aii,2Aiii и B). Другие характерные морфологии, такие как митохондриальной фрагментации и плазматической мембраны блеббинга также наблюдали в клетках, которые выпустили цитохрома с -GFP (рис 2Aiii). Эти клетки, как сообщалось, подвергаются клеточной гибели вскоре после освобождения цитохрома с 23-27. Тем не менее, после удаления смертной стимула, мы обнаружили, что цитозольный цитохрома уровни с -GFP отказался, митохондрии восстановил нитевидные структуры, а плазматическая мембрана восстановить нормальный внешний вид (рис 2Aiv-VII, и В). Таким образом, апоптотических клеток может пройти анастасис после митохондриальной выпуска цитохрома с.

Усиление вниз по течению DEVD расщепляющие каспаз, как правило, предполагается, что "точка невозврата" в апоптоз 2,5. Таким образом, мы использовали каспазы биосенсора NES-DEVD-YFP-NLS выражessed из плазмиды 13, что делает возможным обнаружение выживших клеток, которые ранее испытывали активность каспазы (3А). Это каспазы биосенсор представляет собой полипептид с N-концевой ядерного исключения сигнала (NES), линкер с каспазы-3/7-сайт расщепления консенсус (DEVD) 26,42,43, а затем желтого флуоресцентного белка (YFP) и С-концевой сигнал ядерной локализации (NLS). У здоровых клеток, это биосенсора преимущественно локализуется в цитозоле в виде функции от NES (рис 3Bi, C-IV, и г) 13. Во время апоптоза, активированные каспазы расщепляют DEVD мотив, выпустив YFP-NLS, которая эффективно транслоцируется из цитозоля в ядро в клетках, которые одновременно или впоследствии, отображающих другие особенности апоптоза, таких как ДНК / конденсации хроматина и сотовый усадки (фиг.3В II -iv и D) 13. Таким образом,SE клетки сохраняют функцию ядерного импорта После активации каспазы. После удаления апоптоза, клетки, которые подвергаются Анастасис отображения морфологическое восстановление даже после активации каспазы произошло (рис 3BV-X, и D) 13, по-видимому вспять поздно апоптоз стадии. Во время восстановления нормальной морфологии, сигнал ядерного YFP уменьшается по интенсивности в некоторых клетках, когда они начинают обратный апоптоз после удаления смерти стимула (фиг 3BV-х, Cell 1) 13, предполагая, что клетки ухудшить каспазы-расщепляется биосенсора, возможно, Тот же механизм используется для удаления других каспазы-расщепляется продуктов во время и после Воскресения.

Анастасис также может быть обнаружена без живой клетки микроскопии. Это может быть достигнуто с помощью флуоресцентно меченого аннексина V 38,44, которая связывает и знаки вовне фосфатидилсерина (PS) на ранней стадии апоптоза ( (фиг.4В) 13, как фосфатидилсерин ограничивается внутренней листке плазматической мембраны здоровых клеток 38. В отличие от этого, этанол-индуцированного апоптоза умирающие клетки подвергать фосфатидилсерин на клеточной поверхности (фиг.4В) 13, и, следовательно, могут быть помечены флуоресцентной аннексина V 38,44. Заметно, клетки аннексина V-меченых может восстановить нормальную морфологию после удаления смерти стимулов, предполагая, что первичные кардиомиоциты вспять апоптоз (рис 4б) 13. Другие ранее применяли подобную стратегию, чтобы предположить, что восстановление от апоптоза может произойти в естественных условиях. В модели в естественных условиях транзиторной ишемической травмы, каспазы-зависимых аннексин V маркировка кардиомиоцитов у кроликов и мышей, по-видимому повторноповлекло за интернализации аннексином V в живых клеток после временной ишемии 45, предполагая, что анастасис может произойти в живых животных. Кроме того, два других исследованиях использовали сортировки клеток, чтобы определить фракцию аннексина V, меченного мышиного BCL 1 .3B3 В-клетки лимфомы (воздействию анти-иммуноглобулина антител, которые индуцируют апоптоз в BCL 1 .3B3) и карциномы молочной железы мыши MOD клеток, экспрессирующих температуру чувствительными к p53 (что вызывает апоптоз После инкубирования ниже разрешающей температуре) по-прежнему распространяться после того как они были возвращены в нормальных условиях культивирования 14,15. В совокупности, эти исследования показывают, что аннексин V используется для определения судьбы клетки, которые удалось обратить вспять тенденцию апоптоз без визуализации живых клеток микроскопии. Тем не менее, есть ряд предостережений этой стратегии, как аннексин V флуоресценции не является постоянным (4В) 13, оставаясь обнаруживаться в течение всего лишь нескольких часов после удаления смертной стимул, так чтоэти методы не могут обеспечить долгосрочное отслеживание клеток, обращенных апоптоз.

Рисунок 1
Рисунок 1: Отслеживание разворот апоптоза изображений живых клеток. (Печатается с разрешения Тан и др, MBoC 23, 2240-2252 13, к рисункам 1А. - D, и G). (А) подход к индукции апоптоза, а затем культивируемые клетки позволяют восстановиться после смыв апоптоза. (В) замедленной фазы живых клеток контрастной микроскопии здоровых первичных клеток печени мышей (необработанной), та же группа клеток, которые были обработаны с 4,5% этанола в культуральной среде (об / об) в течение 5 ч (обработанной), а затем промывают и инкубируют дополнительно в свежей культуральной среде в течение 24 ч (промытого). Масштаб бар, 100 мкм. (C) Время непрерывной покадровой живая клетка эпи-флуоресцентной микроскопии из той же первичной ячейки мышиной печени до этанольннол обработка (I), в указанные моменты времени после обработки 4,5% -ным этанолом в среде клеточной культуры в течение 2,5 ч (II и III), и после промывки и инкубировани со свежей средой, чтобы обеспечить восстановление в течение 1 ч (IV - VI). Объединенные изображения Mitotracker окрашенных митохондрий (красный) и Hoechst-окрашенных ядер (синий) визуализировали с помощью эпи-флуоресцентной микроскопии и морфологии клеток с помощью ДВС микроскопии. Масштабная линейка, 10 мкм. (D) Объединенные всего (без ДВС) изображения флуоресценции от панели C выявить органелл морфологии. (E) Время непрерывной покадровой живая клетка конфокальной микроскопии человека мелкоклеточный рак легких H446 клеток до лечения этанола (I) , после обработки 3,8% -ным этанолом в среде клеточной культуры в течение 2 ч 28 мин (II-VI), и после промывки и инкубировани со свежей средой, чтобы обеспечить восстановление (VII-XII). Объединенные изображения Mitotracker окрашенных митохондрий (красный) и Hoechst-окрашенных ядер (синий) были визуализированы с помощью конфокальной микроскопии, и с ELL морфология по ОПК микроскопии. Белые стрелки указывают на фрагментированный ядро ​​в апоптотических телец (VI). Масштабная линейка, 10 мкм. (F) Слияние флуоресцентные изображения только (без ДВС) с панели E выявить органелл морфологии. (G) Непрерывная покадровой живая клетка эпи-флуоресцентной микроскопии для монохромных Hoechst-окрашенных ядерной томографии одного HeLa клеток, которые претерпевает разделение неточное клеток. Перед обработкой этанолом (I), лечение с 4,3% -ным этанолом в клеточной культуральной среде в течение 5 ч (II) и после удаления этанола (промывают, III-VI). Панели IV показывает аномальные деления клеток. Красные стрелки указывают основные ядра в разделенных клеток (IV-VI). Масштабная линейка, 30 мкм. Времена обозначается как HR: мин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

цифра 2 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 51964 / 51964fig2highres.jpg "/>
Рисунок 2: Определение обратимости апоптоза после выпуска митохондриальной цитохром С (А) непрерывного покадровой живых клеток конфокальной микроскопии HeLa клеток, стабильно экспрессирующих цитохрома с -GFP (Цито С -GFP) до (I), в течение (II-III) и после (III-VII) воздействия 3,9% этанола в среде для культивирования клеток. Объединенные конфокальной изображения CytoC-GFP (зеленый), Mitotracker-окрашенные митохондрии (красный), и Hoechst-окрашенных ядер (синий) в сочетании с ОПК изображений (левая панель). Неслиянных версии показаны отдельно для CytoC-GFP, представлены в виде теплового карты интенсивности сигнала (левый средняя панель), монохромного изображения CytoC-GFP (средняя панель), и монохромное изображение митохондрий (справа средняя панель). Объединенные изображения CytoC-GFP и митохондрий (правая панель). (B) изменение интенсивности сигнала C-GFP цитозольного цитохрома клеток, CelL 1 и Сота 2, как указано в монохромном CytoC-GFP изображения на панели Ai. Времена обозначается как HR: мин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3
Рисунок 3: Обнаружение разворот апоптоза после активации каспазы (перепечатано с разрешения Тан и др, MBoC 23, 2240-2252 13 для фигур 3А - D.). (А) Схема каспазы биосенсора слитого белка, состоящего из ядерного экспорта сигнала (NES), сайт расщепления каспазы DEVD, желтый флуоресцентный белок (YFP), и сигнала ядерной локализации (NLS). (Б) непрерывной покадровой живой клетки конфокальной микроскопии HeLa клетки, экспрессирующие каспаз биосенсора NES-DEVD-YFP-NLS до (I), в течение (II -IV) и после (Vx) воздействия 4,3% этанола в среде для культивирования клеток. Объединенные конфокальной образы каспазы биосенсора (зеленый), Hoechst-окрашенных ядер (синий) и DIC изображений (левая панель), а монохромных изображений сигнала YFP (средняя панель), а карту тепло, обозначающее интенсивность сигнала YFP (правая панель) . (C) необработанных контрольных проанализированные в панели B. (D) количественное интенсивности флуоресценции для активированного ядерной каспазы биосенсора в отдельных клетках (с номерами 1 и 2 в панели BI) до, во время и после воздействия этанола, и в необработанных контрольных (под номером 3 и 4 в панели CI) рассчитывали как процент YFP присутствует в ядре (интенсивность клеток сигнал YFP ядерного / общее х 100%). Времена указывается как часы: мин. Масштабная линейка, 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Айс "> Рисунок 4
Рисунок 4: Определение разворот апоптоза флуоресцентно меченого аннексина V (Печатается с разрешения Тан и др, MBoC 23, 2240-2252 13 для фиг.4А - B.). (А) Схема аннексина V-FITC анастасис анализа, используемого в панели B. (B) у новорожденных крыс первичные желудочковые миоциты сердца подвергали воздействию 4,5% -ного этанола в клеточной культуральной среде в течение 5 ч, а затем инкубировали с аннексина V-FITC на 10 мин до удаления этанола среды. Клетки для стационарного немедленно (лечение), или фиксированная после повторной подачи свежей средой для дополнительного восстановления 2 ч (мытый). Необработанные клетки, которые были подвержены аннексин V-FITC служить в качестве контроля (необработанный). Mitotracker окрашенных митохондрии (красный), Hoechst-окрашенных ядер (синий) и аннексина V-FITC (зеленый) были визуализированы с помощью конфокальной микроскопии, и морфология клеток визуализировали DIC микроскопии. Южная Каролинаэль-бар, 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Воскресение Христово относится к явлению, когда клетки, у которых активирована гибель клеток пути впоследствии обратить вспять процесс смерти и выжить. Здесь мы показали, что визуализация живых клеток могут быть использованы для подтверждения того, что одни и те же индивидуальные клетки на самом деле может изменить процесс апоптоза клеточной смерти на поздней стадии, а затем продолжить выживать и воспроизводиться. Наши протоколы описывают несколько типоспецифические условия обработки оптимизированы клетки к апоптозу и позволяют значительную часть клеток пройти разворот апоптоза контролируется с несколькими биомаркеров для проверки. Что касается технических вопросов, со стеклянным дном блюда были использованы для культивирования клеток для визуализации 12,13, из-за высокой прозрачной тонкой стекла между клетками и объектива микроскопа, что позволяет длинные рабочие расстояния для высококачественного конфокальной или эпи-флуоресцентной микроскопии в большом увеличении, облегчает наблюдение классического апоптоза в том числе митохондриальных фрагментации, Выпуск цитохрома с и ядерной конденсации и фрагментации. Стекло также не искажает полярность света, чтобы высокое качество DIC микроскопии для контроля мембранной блеббинга, мобильный усадки клеток и формирования апоптоза тела во время апоптоза. DIC микроскопии имеет преимущества перед фазово-контрастной микроскопии соблюдать эти морфологические признаки апоптоза, как DIC повышает контрастность образцов неокрашенных и прозрачных клеток, улучшая обнаружение клеток морфологии. Если ДВС и фазово-контрастной микроскопии отсутствуют, CellTracker могут быть использованы для окрашивания в цитозоль наметить морфологии живых клеток для конфокальной или эпи-флюоресцентной микроскопии и контролировать морфологию клеток.

Применение соответствующих дозах смерти стимулов и стратегии удаления стимулов являются важнейшими шагами для обнаружения Воскресения. Мы решили использовать низкие концентрации этанола в качестве смертного стимулом для DESCR экспериментовibed здесь, потому что большой процент обработанных клеток может равномерно подвергаются апоптозу и может оправиться от этого, потенциально мягче, смерть стимул. Тем не менее, эти подходы могут быть успешно применены с другими стимулами смерти, как мы уже сообщали, 12,13. Тем не менее, некоторые смертные стимулы по природе своей более сложной, чем другие, такие как стауроспорином (STS), широко применяемого в индуцирующего апоптоз агента. Возможно потому, что он связывается свои субстраты с высоким сродством 46-48, повторные промывки необходимы, но до сих пор не может эффективно удалить STS из клеток. В этом случае, используя более низкие концентрации наркотиков и более короткое время препарат инкубационный, что еще можно активировать процесс апоптоза умирающего может быть полезным, чтобы больше клеток отменить апоптоз. Повторное подачи клетки с кондиционированной клеточной культуральной среды, также может повысить реверсирование апоптоза лучше, чем свежий клеточной культуральной среды. Апоптотических клеток, как правило, слабо прикреплены к поверхности культуральной чашке в частности, на стеклянной Surлица, поэтому важно, чтобы смыть апоптоз индукторы осторожно, чтобы избежать отсоединения клеток. Покрытие стеклянной посуды с поли-D-лизин, коллаген и / или фибронектина может увеличить клеточную присоединения для предоставления определенных типов клеток, таких как кардиомиоциты 37, чтобы должным образом прикрепить на стеклянной поверхности чашки для культивирования клеток, особенно после воздействия на клетки смерть стимул.

Процесс апоптоза, и, вероятно, изменение апоптоза, зависит от ферментативной активности, что может быть зависит от температуры. Таким образом, поддержание клеток при 37 ° С, или в их нормальном состоянии культуры важно в течение всего процесса формирования изображения живого чтобы обеспечить воспроизводимость результатов эксперимента. Pre-теплый микроскоп перед началом изображений живых клеток также важным шагом, который позволяет компоненты микроскоп, чтобы достичь термо-равновесия. Это позволит избежать дрейф фокуса и сдвига плоскости ху из-за теплового расширения и сжатиякомпоненты во время съемки живых клеток. Подключение или отключение смертной стимул путем изменения среды культуральной чашке или с помощью пипетки или путем перфузии в предварительно нагретой системы микроскопии при покадровой обработки изображений все еще может привести к дрейф фокуса из-за изменений температуры или объема среды. Приобретение Z-стека может помочь изображения клеток в правильном фокальной плоскости, но увеличит риск фототоксичности за счет дополнительного воздействия на клетки флуоресцентными лазерами. Кроме того, использование устройств компенсации фокусировки сноса, например, инфракрасным лазером на основе системы автоматического коррекции фокусировки, может сохранить клетки, в то же фокальной плоскости при покадровой изображений живых клеток, поддерживая расстояние между ячейками / стекла и цели без дополнительного воздействие клеток к короткой длиной волны, фототоксичного флуоресценции.

Митохондриальной выпуск апоптогенных белков, таких как цитохром с и активации эффекторных каспаз, такие как выходной / эффектаили каспазы-3 и каспазы-7, были как правило, считается "точкой невозврата" в процесс апоптоза гибель клеток 2,5,6. Вестерн-блоты были использованы для выявления расщепление (активации) каспазы-3 и его подложки, такие как поли (АДФ) -ribose полимеразной-1 (PARP) и DFF45 / ICAD во всей популяции клеток при индукции апоптоза, а также после удаления апоптоза раздражители, и показали, что расщепляется каспазы-3, ИАП и ППА появился в клетках при воздействии смерти раздражители, но исчез после того, как эти клетки повторно корма свежей культуральной средой 13. Тем не менее, эти методы показывают общее состояние в клеточной популяции, но не различать отдельные клетки, которые, в конечном счете умирают от тех, что будут восстановлены апоптоз, а затем выжить. Биохимические фракционирования для анализа высвобождения митохондриального цитохрома С, имеет аналогичные предостережения. Поэтому, чтобы отслеживать судьбу отдельных клеток после цитохром с-релизе и каспазы-ACактивационная, два из самых узнаваемых признаков апоптоза 2,5,6, GFP-тегами цитохром с (Cyto C -GFP) и каспазы биосенсора, например, той, которая используется здесь NES-DEVD-YFP-NLS, в сочетании с живой клетке микроскопии обойти эти проблемы путем непосредственного наблюдения морфологическое восстановление и транслокацию биосенсора Цито С -GFP в одних и тех же клетках. Эти результаты указывают на обратимость апоптоза после митохондриальной цитохром с-релизе и активации каспазы.

Актуальной задачей для изучения Воскресения является отсутствие методов маркировки для обнаружения клеток, которые прошли Воскресения в любой точке всей их жизни, в естественных условиях или в пробирке. Стабильная экспрессия каспазы биосенсора РЭШ-DEVD-YFP-NLS позволяет также выявлять активности каспазы если каспазы снова активируются в будущем, но не постоянно записывать активность каспазы как активированный биосенсор будет ухудшаться без sustaматизируются активность каспазы 13. Другие ранее сообщалось каспазы биосенсоры, такие как лада на основе Скат биосенсоров (например, ECFP- [DEVD] -Venus) 26,49, а также люминесцентные журналистам Apoliner (CD8-RFP- [DQVD] -GFP) 50 и CPV (например, CD8 - [DEVD] -Venus) 51,52, может быть использован для обнаружения активность каспазы в целых животных и в культуре клеток, но имеют те же ограничения. Аналогичным образом, Цито С -GFP не может быть использована для отслеживания клетки, которые вспять апоптоз в перспективе, как он будет выпущен из митохондрий в цитозоль во время апоптоза и затем разрушается. Аннексина V маркировки была использована для отслеживания клетки, которые вспять апоптоз, но интенсивность сигнала также снижается с течением времени, так что не является полезным для долгосрочного отслеживания Anastasis 13,45. Непрерывный долгосрочный естественных изображений может быть использована для отслеживания участи тех же клеток после воздействия на смерти раздражителей. Тем не менее, долгосрочный естественных изображений по-прежнему сложной тО выполнить в большинстве живых животных. Поэтому дополнительные подходы для расширения анастасис исследования целых исследований на животных, и для скрининга лекарств, которые могли бы способствовать или ингибировать анастасис использованием культуры тканей

В будущем, новые протоколы и методы, которые позволяют отслеживать судьбу долгосрочного клеток, необходимых для разработки и тестирования физиологические, патологические и терапевтические последствия Воскресения. Мы предложили, что Анастасис может быть общим механизмом выживаемость клеток, чтобы спасти поврежденные клетки, которые трудно заменить, например, зрелые нейроны и клетки сердечной 13. Тем не менее, Воскресение апоптоза раковых клеток после химиотерапевтических процедур может привести к восстановлению опасных клеток, что приводит к рецидиву устойчивых опухолей 12,13. Воскресение Христово также может быть важным механизмом онкогенеза, так как некоторые клетки отображения онкогенного преобразования после они полностью апоптоз 13. Таким образом, повышение анастасис может быть новый Тераpeutic стратегия для ингибирования нейродегенерации и сердечной недостаточности, при одновременном подавлении анастасис как новый способ для профилактики или лечения рака. Разработка биосенсоров для отслеживания разворота апоптоза в модельных системах заболевания будет продвигать понимание механизмов выживания клеток Воскресения, и потенциальных терапевтических неустранимых болезней путем модуляции Воскресения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Мы благодарим преподобный д-р Ральф Больмана и преподобный д-р Джеймс Voelz за предложение слово "Воскресение", чтобы описать разворот апоптоза; Дуглас Р. Зеленый для HeLa клеток, стабильно экспрессирующих цитохром с -GFP; Чарльз М. Рудин и Эрик Э. Гарднер для H446 клеток; Хизер агнец для помощи в мультяшном рисунок в видео; Йи Хуэй Йео за ценные обсуждения этой рукописи. Эта работа была поддержана сэра Эдварда Youde Мемориальной стипендии (ГВУ), стипендии доктор Уолтер Szeto Мемориал (ГВУ), грант Фулбрайта 007-2009 (ГВУ), науки о жизни Research Foundation общения (ГВУ), NIH предоставляет NS037402 (JMH) и NS083373 (JMH) и Комитет университет грантов Гонконга AoE / B-07/99 (MCF). Хо Лам Тан Shurl и Кей Курки Фонд сотрудник Научно-исследовательского Фонда наук о жизни.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LSM780 confocal microscopy Carl Zeiss
Glass bottom culture dish MatTek Corporation P35G-0-14-C
Transparent CultFoi Carl Zeiss 000000-1116-084
CO2 independent medium Life Technologies 18045-088
CellTracker Life Technologies C34552
Mitotracker Red CMXRos Life Technologies M-7512
Hoechst 33342 Life Technologies H1399
Fluorescently labeled annexin V Biovision K201

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British Journal of Cancer. 26, 239-257 (1972).
  2. Riedl, S. J., Shi, Y. Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 897-907 (2004).
  3. Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
  4. Chipuk, J. E., Bouchier-Hayes, L., Green, D. R. Mitochondrial outer membrane permeabilization during apoptosis: the innocent bystander scenario. Cell Death and Differentiation. 13, 1396-1402 (2006).
  5. Kroemer, G., et al. Classification of cell death recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2009. Cell Death and Differentiation. 16, 3-11 (2009).
  6. Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death and Differentiation. 19, 107-120 (2012).
  7. Holland, A. J., Cleveland, D. W. Chromoanagenesis and cancer: mechanisms and consequences of localized, complex chromosomal rearrangements. Nature Medicine. 18, 1630-1638 (2012).
  8. Reddien, P. W., Cameron, S., Horvitz, H. R. Phagocytosis promotes programmed cell death in C. elegans. Nature. 412, (2001).
  9. Hoeppner, D. J., Hengartner, M. O., Schnabel, R. Engulfment genes cooperate with ced-3 to promote cell death in Caenorhabditis elegans. Nature. 412, 202-206 (2001).
  10. Segawa, K., et al. Caspase-mediated cleavage of phospholipid flippase for apoptotic phosphatidylserine exposure. Science. 344, 1164-1168 (2014).
  11. Overholtzer, M., et al. A nonapoptotic cell death process, entosis, that occurs by cell-in-cell invasion. Cell. 131, 966-979 (2007).
  12. Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. Reversibility of apoptosis in cancer cells. British Journal of Cancer. 100, (2009).
  13. Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Molecular Biology of the Cell. 23, 2240-2252 (2012).
  14. Hammill, A. K., Uhr, J. W., Scheuermann, R. H. Annexin V staining due to loss of membrane asymmetry can be reversible and precede commitment to apoptotic death. Experimental Cell Research. 251, (1999).
  15. Geske, F. J., Lieberman, R., Strange, R., Gerschenson, L. E. Early stages of p53-induced apoptosis are reversible. Cell Death and Differentiation. 8, 182-191 (2001).
  16. Jacobson, M. D., Weil, M., Raff, M. C. Programmed cell death in animal development. Cell. 88, 347-354 (1997).
  17. Hardwick, J. M., Cheng, W. C. Mitochondrial programmed cell death pathways in yeast. Developmental Cell. 7, 630-632 (2004).
  18. Frohlich, K. U., Fussi, H., Ruckenstuhl, C. Yeast apoptosis-from genes to pathways. Seminars in Cancer Biology. 17, 112-121 (2007).
  19. Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147, 742-758 (2011).
  20. Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 231-241 (2008).
  21. Wang, X. The expanding role of mitochondria in apoptosis. Genes & Development. 15, 2922-2933 (2001).
  22. Galluzzi, L., Kepp, O., Kroemer, G. Mitochondria: master regulators of danger signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biolog. 13, 780-788 (2012).
  23. Goldstein, J. C., Waterhouse, N. J., Juin, P., Evan, G. I., Green, D. R. The coordinate release of cytochrome c during apoptosis is rapid, complete and kinetically invariant. Nature Cell Biology. 2, 156-162 (2000).
  24. Goldstein, J. C., et al. Cytochrome c is released in a single step during apoptosis. Cell Death and Differentiation. 12, 453-462 (2005).
  25. Tyas, L., Brophy, V. A., Pope, A., Rivett, A. J., Tavare, J. M. Rapid caspase-3 activation during apoptosis revealed using fluorescence-resonance energy transfer. EMBO Reports. 1, 266-270 (2000).
  26. Takemoto, K., Nagai, T., Miyawaki, A., Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. The Journal of Cell Biology. 160, 235-243 (2003).
  27. Albeck, J. G., et al. Quantitative analysis of pathways controlling extrinsic apoptosis in single cells. Molecular Cell. 30, 11-25 (2008).
  28. Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death and Differentiation. 14, 641-650 (2007).
  29. Liu, X., Zou, H., Slaughter, C., Wang, X. DFF, a heterodimeric protein that functions downstream of caspase-3 to trigger DNA fragmentation during apoptosis. Cell. 89, 175-184 (1997).
  30. Enari, M., et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature. 391, 43-50 (1998).
  31. Li, H., Zhu, H., Xu, C. J., Yuan, J. Cleavage of BID by caspase 8 mediates the mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis. Cell. 94, 491-501 (1998).
  32. Slee, E. A., Keogh, S. A., Martin, S. J. Cleavage of BID during cytotoxic drug and UV radiation-induced apoptosis occurs downstream of the point of Bcl-2 action and is catalysed by caspase-3: a potential feedback loop for amplification of apoptosis-associated mitochondrial cytochrome c release. Cell Death and Differentiation. 7, 556-565 (2000).
  33. Suzuki, J., Denning, D. P., Imanishi, E., Horvitz, H. R., Nagata, S. Xk-related protein 8 and CED-8 promote phosphatidylserine exposure in apoptotic cells. Science. 341, 403-406 (2013).
  34. Kroemer, G., Martin, S. J. Caspase-independent cell death. Nature Medicine. 11, 725-730 (2005).
  35. Chipuk, J. E., Green, D. R. Do inducers of apoptosis trigger caspase-independent cell death. Nature Reviews Molecular Cell Biolog. 6, 268-275 (2005).
  36. Tait, S. W., Green, D. R. Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 621-632 (2010).
  37. Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 2979-2984 (1998).
  38. Zhang, G., Gurtu, V., Kain, S. R., Yan, G. Early detection of apoptosis using a fluorescent conjugate of annexin V. BioTechniques. 23, 525-531 (1997).
  39. Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2, 1084-1104 (2007).
  40. Fenech, M., et al. Molecular mechanisms of micronucleus, nucleoplasmic bridge and nuclear bud formation in mammalian and human cells. Mutagenesis. 26, 125-132 (2011).
  41. Gordon, D. J., Resio, B., Pellman, D. Causes and consequences of aneuploidy in cancer. Nature Reviews Genetics. 13, (2012).
  42. Poreba, M., Strozyk, A., Salvesen, G. S., Drag, M. Caspase substrates and inhibitors. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a008680 (2013).
  43. Talanian, R. V., et al. Substrate specificities of caspase family proteases. The Journal of Biological Chemistry. 272, 9677-9682 (1997).
  44. Logue, S. E., Elgendy, M., Martin, S. J. Expression, purification and use of recombinant annexin V for the detection of apoptotic cells. Nature Protocols. 4, 1383-1395 (2009).
  45. Kenis, H., et al. Annexin A5 uptake in ischemic myocardium: demonstration of reversible phosphatidylserine externalization and feasibility of radionuclide imaging. Journal of Nuclear Medicine. 51, 259-267 (2010).
  46. Ruegg, U. T., Staurosporine Burgess, G. M. K-252 and UCN-01: potent but nonspecific inhibitors of protein kinases. Trends in Pharmacological Sciences. 10, 218-220 (1989).
  47. Bertrand, R., Solary, E., O'Connor, P., Kohn, K. W., Pommier, Y. Induction of a common pathway of apoptosis by staurosporine. Experimental Cell Research. 211, 314-321 (1994).
  48. Chae, H. J., et al. Molecular mechanism of staurosporine-induced apoptosis in osteoblasts. Pharmacological Research. 42, 373-381 (2000).
  49. Takemoto, K., et al. Local initiation of caspase activation in Drosophila salivary gland programmed cell death in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13367-13372 (2007).
  50. Bardet, P. L., et al. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13901-13905 (2008).
  51. Florentin, A., Arama, E. Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell. The Journal of Cell Biology. 196, 513-527 (2012).
  52. Chihara, T., et al. Caspase inhibition in select olfactory neurons restores innate attraction behavior in aged Drosophila. PLoS Genetics. 10, e1004437 (2014).

Tags

Клеточная биология выпуск 96 Воскресение Христово апоптоз апоптотических телец каспазы гибели клеток клеток усадки самоубийство клеток цитохром С повреждение ДНК генетические изменения митохондриальная наружной мембраны проницаемости (MOMP) программируемой клеточной смерти разворота апоптоза
Стратегии для слежения Воскресения, выживание феномен клеточной который меняет апоптоз
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick,… More

Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis. J. Vis. Exp. (96), e51964, doi:10.3791/51964 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter