Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Gebruik te maken van op maat ontworpen galvanotaxis Chambers naar Study Directional Migratie van Prostaat Cellen

doi: 10.3791/51973 Published: December 7, 2014

Abstract

De fysiologische elektrisch veld wordt voor specifieke biologische functies, zoals het leiding celmigratie in embryonale ontwikkeling, neuronale uitgroei en epitheliale wondgenezing. Het toepassen van een gelijkstroom elektrisch veld gekweekte cellen in vitro induceert directionele celmigratie of galvanotaxis. De 2-dimensionale galvanotaxis methode die wij hier demonstreren gemodificeerd met op maat gemaakte poly (vinylchloride) (PVC) Chambers, glas, platina elektroden en het gebruik van een gemotoriseerde podium waarop de cellen worden afgebeeld. De PVC-kamers en platina elektroden vertonen een lage cytotoxiciteit en zijn betaalbaar en herbruikbaar. Het glasoppervlak en het gemotoriseerde microscooptafel verbeteren beeldkwaliteit en laat mogelijke wijzigingen op het glasoppervlak en behandelingen aan de cellen. We filmden de galvanotaxis van twee niet-tumorigene, SV40 vereeuwigd prostaat cellijnen, PRN-1-1 en PNT2. Deze twee cellijnen vertonen gelijkaardige migratie snelheden en beide migreren naarde kathode, maar ze vertonen een verschillende mate van gerichtheid in galvanotaxis. De verkregen via dit protocol resultaten suggereren dat de PRN-1-1 en de PNT2 cellijnen verschillende intrinsieke eigenschappen die hun directionele trekkende reacties regeren kan hebben.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Endogene elektrische velden worden gedetecteerd in verschillende weefsels, zoals huid 1, 32, 33 en hersenen 2. De fysiologische elektrisch veld wordt voor specifieke biologische functies, waaronder aansturen embryo ontwikkeling 3, 4, geleiden de uitgroei van neuronale uitlopers 5, 6 en bevorderen epitheel en corneale wonden 1, 7. In vitro toepassing van een gelijkstroom elektrisch veld gekweekte cellen bootst de fysiologische elektrisch veld en induceert celmigratie directionele of galvanotaxis. Galvanotaxis is onderzocht in fibroblasten 8, vissen keratinocyten 9, menselijk epitheel en hoornvlies keratinocyten 10-12, lymfocyten 13 neuroblasts 2 en neuronale progenitorcellen 14. Bij blootstelling aan het aangelegde veld, de meeste onderzochte cellen migreren directioneel naar de kathodische (-) pool. Maar verschillende kankercellen, waaronder zeer metastatischehumane borstkankercellen en de humane prostaatkanker cellijn PC-3M, naar de anodische (+) pool 15, 16. verschillende mechanismen voorgesteld galvanotaxis bemiddelen of het vermogen van de cellen om het elektrisch veld detecteren, inclusief activatie verklaren van EGF receptoren 12, de epitheliale natriumkanaal 17 PI3K en PTEN 18 en vrijgave van calciumionen 15, 19. Het mechanisme is nog niet volledig begrepen en het is mogelijk dat meerdere signaalroutes betrokken bij galvanotaxis.

De 2-dimensionale galvanotaxis methode die wij hier demonstreren nuttig is de gerichte migratie van hechtende, beweeglijke cellen te karakteriseren, op individuele celmigratie 10, 12, 17 of migratie van een vel van confluente cellen 18, 20. Deze techniek is aangepast van toezicht Peng en Jaffe 21, en ​​Nishimura et al. 10 met op maat gemaakte, heldere PVC kamers, met afneembare coverslips zorgen voor gemakkelijke cel ophalen na galvanotaxis voor secundaire analyse, zoals immuno-fluorescentie beeldvorming. Het glasoppervlak van de galvanotaxis kamers is optisch-compatibel, die het filmen bij een hoge vergrotingsfactor en met fluorescent-gelabelde cellen mogelijk maakt. Ook kan proefopzet met modificatie van het glasoppervlak, zoals het veranderen van de oppervlaktelaag of kosten. Afstandhouders van No. 1 dekglaasje worden in de kamers om de stroom over de cellen te minimaliseren; daarom jouleverwarming, dat evenredig is met het kwadraat van de stroom, zou de cellen oververhitten tijdens het experiment. De verbindende agar bruggen voorkomen direct contact van de elektroden met de cellen en verandering van het medium pH of de ionenconcentratie in galvanotaxis voorkomen.

Twee niet-tumorigene humane prostaat cellijnen onderzocht op hun galvanotaxis reactie in deze studie. De PRN-1-1 22 en PNT2 23 zijn beide SV40-geïmmortaliseerde, growth factor-afhankelijke cellijnen die de epitheliale merkers cytokeratine 5, 8, 18 en 19 met weinig of geen expressie van het prostaat-specifiek antigeen (PSA). Beide cellijnen houden de veelhoekige morfologie van normale epitheelcellen, maar chromosomale abnormaliteit werd waargenomen bij karyotypering 22, 24. Hoewel PRN-1-1 en PNT2 hebben dezelfde gedrag bij de meeste experimenten, ze vertonen verschillen in de vorming van acinaire structuur en galvanotaxis. Bij een 3-D matrix Matrigel, de PRN-1-1 cellen vormen holle acinaire structuren lumen lijken de normale prostaat weefsel 25. De PNT2 cellen vormen vaste bolletjes zonder lumen of gepolariseerde epitheel 26. De PRN-1-1 cellen ook een hogere galvanotactic respons dan de PNT2 in de huidige studie tonen. De correlatie tussen de vorming van acinar structuur en galvanotaxis in PRNS-1-1 suggereert dat de galvanotactic signalen een rol kunnen spelen bij het organiseren van de prostate klier bewegingen weefsel in reactie op endogene elektrische velden, en verschaft verder kenmerken onderscheid tussen deze 2 cellijnen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Het kweken Prostaat Cellen

  1. Cultuur de PRN-1-1 en PNT2 prostaatcellen op 100 mm kweekschalen in RPMI 1640 medium aangevuld met 10% FBS en antibiotica Antimycoticum bij 37 ° C met 5% CO2. Vernieuw de kweekmedium elke dag tot de cellen te bereiken 80% samenvloeiing van de galvanotaxis experimenten.

2. Montage galvanotaxis Chambers

  1. Assembleren bodem Chambers
    1. Veeg een plastic galvanotaxis kamer met 2-propanol. Breng de zeewaardig siliconen afdichting rond de cirkelvormige openingen aan de onderzijde van een kamer met een injectiespuit en bevestig een groot dekglaasje (figuur 1). Gebruik de achterkant van een katoenen applicator naar beneden te duwen het dekglaasje en veeg de overtollige lijm met wattenstaafjes. De cirkelvormige openingen maken het medium en elektrische stroom over de cellen tussen de twee binnenste medium reservoirs.
    2. Snijd een kleine dekglaasje tot 6 mm x 2 maken5 mm spacers met een diamanten punt marker.
    3. Flip de kamer. Breng 2 lijnen van silicium lijm met een spuit en / of een metalen spatel tot een 10 mm x 25 mm kanaals oppervlakte celhechting tussen 2 cirkelvormige openingen aan de onderzijde glas creëren. Lijm 2 stukjes glas afstandhouder tussen de 2 ronde openingen. Gebruik de achterkant van de katoen applicators naar beneden te duwen de afstandhouders en veeg de overtollige lijm met wattenstaafjes en / of tandenstokers.
    4. Droog de kamer gedurende 24 uur totdat het silicium lijm is uitgehard. Week de kamer in gedestilleerd water 's nachts aan het azijnzuur residu van de lijm te verwijderen. Droog de kamer voor onmiddellijk gebruik, of bewaar de kamer voor later gebruik in een schone container.
      Figuur 1
      Figuur 1: Vergadering van de bodem galvanotaxis kamer. A) Een groot dekglaasje wordt naar de bodem van een schone kamer. B bijgevoegd) Two stukjes glas afstandhouders gelijmd tussen de 2 cirkelvormige openingen 10 mm x 25 mm kanaal cellen hechten creëren.
  2. Zaaien cellen op de galvanotaxis kamers
    1. Bereid de eisen aantal galvanotaxis kamers nodig zijn voor het experiment. Elke cellijn of behandeling vereist een enkele galvanotaxis kamer. Veeg de galvanotaxis kamers met 2-propanol. Was de kamers met steriele PBS 3 keer en controleer de vloeistofstroom tussen de 2 ronde openingen in de kamers.
    2. Sluit de kamers in steriele celcultuurschalen en laten equilibreren bij 37 ° C gedurende 15 min. Maak de prostaatcellen uit hun kweekschaal met 5 ml 0,25% trypsine-EDTA bij 37 ° C gedurende 5 min. Neutraliseer de trypsine-EDTA met 5 ml 10% FBS in PBS.
    3. Breng de cellen tot 15 ml en centrifugeer de cellen gedurende 5 min bij 200 xg, 37 ° C. Zuig het supernatant en resuspendeer de cellen in 1 ml kweekmedium.
    4. Neem 20 μl celoplossing te laden op een telkamer en bereken het aantal cellen. Pas de cel concentratie tot 8 x 10 4 cellen / ml kweekmedium.
    5. Neem de galvanotaxis kamers uit de 37 ° C incubator. Zaad 350 pi van de celsuspensie op elke kamer.
    6. Incubeer de cellen in de kamers overnacht in de kweekschaal met natte Kimwipe of in een vochtige kamer in de incubator bij 37 ° C met 5% CO2.

Figuur 2
Figuur 2:. Zaaien cellen de kamer De onderste kamer wordt gedroogd en gereinigd A) prostaat cellen getrypsiniseerd, geteld en overgebracht naar de kamer en overnacht geïncubeerd B) Een top dekglaasje wordt bevestigd aan de kamer verzegelen voor filmen...

  1. Eenssembling de top kamers
    1. Monteer de bovenste kamer voorafgaand aan het filmen. De microscoop is alleen geschikt voor de beeldvorming van een enkele galvanotaxis kamer in een keer. Warming-up 10 ml kweekmedium bij 37 ° C voor elke galvanotaxis kamer. Transfer een galvanotaxis kamer van de incubators tot een temperatuur van 37 ° C opwarming plaat.
    2. Spoel de cellen met kweekmedium om de losse cellen te verwijderen. Verlaat 400 ul van medium in de kamer. Gebruik een spuit te hoog vacuüm vet aan op de top van beide glazen spacers.
    3. Voeg een kleine dekglaasje aan de kamer af te dichten. Druk licht het dekglaasje met de achterkant van een katoenen applicator. Veeg het overtollige medium met wattenstaafjes.
    4. Droog het glasoppervlak en de toepassing van hoge vacuüm vet om de kloof tussen het dekglaasje en de kamer af te dichten. Gebruik een metalen spatel om het vet te verspreiden. Voeg 4 ml van het kweekmedium aan de binnenste reservoirs en controleer de vloeistofstroom tussen de reservoirs.
  2. Maak agarbruggen
    1. Snijd een paar van 2 cm lang PVC-buis (503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall), spiegelen en plaats ze in een bekerglas van 100 ml.
    2. Meet 200 mg Bacto-Agar en voeg deze in een kolf van 50 ml met 10 ml kweekmedium tot 2% agar gel maken. Magnetron gedurende 30 sec. Laad de agar-gel om de plastic buis met een transfer pipet. Laat de agar bruggen bij kamertemperatuur gedurende 10 min aan de agar stollen.
    3. Voeg 2 ml kweekmedium naar de buitenste reservoirs van de galvanotaxis kamer. Plaats de agar bruggen naar de binnenste en buitenste medium reservoirs die het stroom.

Figuur 3
Figuur 3:. Het filmen van de cellen op de kamer Een diagram met de eindassemblage van de galvanotaxis kamer te tonen. De kamer is volledig afgesloten met een hoog vacuüm vet. Medium wordt toegevoegd to vul de reservoirs, en twee agar bruggen worden in de kamer geplaatst. Dan galvanotaxis kamer wordt overgedragen aan de microscoop podium en de elektroden zijn bevestigd aan het elektrisch veld. Zijaanzicht van de samengestelde galvanotaxis kamer wordt getoond tonen dat de elektrische stroom over de cellen door de agar bruggen en de ruimte tussen het afdekglas.

3. Time-lapse Imaging

  1. Schakel de klimaatkamer bij 37 ° C met 5% CO2 in de circulerende lucht 2 uur voorafgaand aan beeldvorming.
  2. Schakel de microscoop en de inleiding van de beeld-verwerven van software. Kalibreren van de microscoop podium en selecteer de 10X objectief.
  3. Breng de galvanotaxis kamers om de microscoop podium, zet de kamer met tape en focus op de cellen. Plaats de galvanotaxis elektroden met de buitenste reservoirs met kathode aan de rechterkant. Bevestig de draad en de elektroden met tape.
  4. Schakel de stroom box een elektrisch veld naar de kamer. Meet de uitgangsspanning met de voltmeter over de kamer tot 2,5 volt voor de 25 mm lange kamer (100 mV / mm) te bereiken. Handhaaf de veldsterkte tijdens het experiment door aanpassing van de uitgangsstroom.
  5. Selecteer 10 punten in de hele kamer te filmen in de software om tien time-lapse filmpjes te genereren. Het opzetten van de overname omstandigheden op 10-min intervallen gedurende 2 uur.
  6. Beginnen filmen en pas de uitgangsstroom als dat nodig is.
  7. Aan het einde van het experiment, verwijdert de ruimte van het toneel en zet de cellen met 95% alcohol. Open te breken de kamer met een scheermesje te reinigen en opnieuw te gebruiken.

4. Kwantificering van galvanotaxis

  1. Draai de time-lapse filmpjes en heroriënteren van de kathode naar de top van de beelden. De films te exporteren naar de cel tracking software.
  2. Handmatig volgen de (x, y) positie van 10-20 cellen bij elk tijdpunt van elke film (Figuur 4 A, B).De migratie afstanden en de hoeken ten opzichte van de noord-zuid richting, dezelfde oriëntatie van het elektrisch veld, zal worden berekend in de cel tracking software (Figuur 4C).
    OPMERKING: De gemiddelde migratie snelheid wordt omgezet van de totale migratie afstand en de totale filmen tijd. De richtingsgevoeligheid wordt omgezet van de hoeken tot de cosinus waarde. Als migreren met willekeurige directionaliteit, zal de gemiddelde netto cosinus nagenoeg nul. Als de cellen migreren recht naar de kathode, de cosinus waarde +1. Als de cellen migreren recht naar de anode, zal de cosinuswaarde -1 zijn.

Figuur 4
Figuur 4: Cell volgen om gerichtheid meten A) Overlay van de tracking lijnen met mobiele beelden.. De (x, y) posities van de cellen manually bijgehouden in de time-lapse filmpjes. . Wanneer de cellen migreren willekeurig, de gemiddelde cosinus dichtbij nul B) Indien de cellen migreren naar de kathode of de anode, de waarde van de gemiddelde cosinus vlakbij + (kathode) of -. (Anode) 1,0 C ) De gerichtheid wordt door de cosinus waarde, die wordt omgezet van de migratie hoeken (θ). De cosinus (θ) gelijk aan de verhouding van de afstand a (de migratieafstand) om afstand b (de afstand verwachting de richting van het elektrisch veld).

  1. Sla de metingen. De gegevens te importeren naar een database-applicatie om de gecombineerde resultaten te berekenen.
  2. De gecombineerde gegevens van de gemiddelde migratie snelheid en gemiddelde cosinuswaarde exporteren naar een spreadsheet voor de grafieken (Figuur 5) plotten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Twee lijnen van prostaatcellen (PRN-1-1 en PNT2) werden onderzocht met deze methode. Cellen in beide lijnen migreren vergelijkbare snelheden van 1,0 +/- 0,3 micron / min in de loop van 2 uur (Figuur 5A). Echter, de gerichtheid op het elektrische veld is 0,7 +/- 0,3 voor de PRN-1-1 lijn, en 0,2 +/- 0,8 voor de PNT2 lijn (Figuur 5B). De resultaten tonen een significant verschil in de galvanotaxis van deze twee cellijnen (p <0,01, 100 cellen werden gevolgd), wat suggereert dat ze verschillende cellulaire signaaltransductie mechanismen die leiden tot verschillende directionele reacties op positionele signalen.

Figuur 5
Figuur 5: galvanotaxis van de prostaat cellen. A) De migratie snelheden van PRN-1-1 en PNT2 lijnen overeenstemmen wanneer de cellen worden blootgesteld aan het elektrische veld.B) Echter, de PRN-1-1 lijn vertoonden een hoge gerichtheid richting kathode (cosinus = 0,7), terwijl de PNT2 lijn bleek een lage gerichtheid (cosinus = 0,2) in het elektrische veld.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De analyse van galvanotaxis reactie van een cel is een belangrijke functionele indicator voor vele cellulaire trekkende of groeiprocessen 27, 28. Hier gebruiken we een op maat gemaakte kamer met glazen oppervlak tot twee prostaat cellijnen te filmen. Deze cellijnen toonden verschillende graden van galvanotaxis en we speculeren dat de intracellulaire lokalisatie of de activering van de galvanotaxis bemiddelende eiwitten gedurende het proces van het genereren van de onsterfelijke cellijnen, waardoor het waargenomen verschil in het galvanotaxis respons zou worden verstoord.

Vergeleken met andere galvanotaxis kamer designs in kweekschalen 27, 28, zijn er verschillende voordelen aan het huidige ontwerp. Ten eerste, het glazen oppervlak geschikt is voor beeldvorming en het dekglaasje met cellen worden teruggehaald na galvanotaxis voor immunokleuring. In deze studie hebben we een lage vergroting van 10X objectief een groep cellen controleren. Echter, met these verbeterde glasoptiek, is het mogelijk om een enkele cel filmen bij een grotere vergroting van een 60x olie doelstelling voor het volgen van de snelle en uitschuiven van lamellipodia aan de voorrand van de cel 17 of volgen cellen gelabeld met fluorescente proteïnen. Ten tweede kan het glazen oppervlak gemodificeerd met matrix eiwit deklagen 10, 12 of een patroon van microkanalen. Chemische behandelingen zijn ook mogelijk duren behandeling van de cellen voordat het filmen 29. Matrix coating is niet vereist voor de prostaat cellijnen hier gebruikt en de matrix coating typeafhankelijk cel. Zo wordt collageen I coating vereist voor galvanotaxis van humane keratinocyten 30, maar laminine coating is vereist voor de galvanotaxis van humane neurale stamcellen 31. We testten menselijke keratinocyt galvanotaxis op collageen I, collageen IV, fibronectine en laminine. Verschillende matrix eiwitten veranderd cel migratie snelheid, maar niet de kathodische migrati veranderen de in galvanotaxis 29. Ten derde, de gemodificeerde platina elektroden inert in het elektrisch veld. Vergeleken met de zilver elektroden gebruikt in andere werkwijzen galvanotaxis 27, ze niet breken of los metaalionen aan het medium, waarin de cytotoxiciteit in galvanotaxis vermindert. Ten vierde, kunnen we de intervallen van het frame vastleggen, die ons helpt om snel of langzaam cel migratie monitoren veranderen. De gemotoriseerde microscoop biedt ook de mogelijkheid om meerdere films uit verschillende gebieden te verwerven in één kamer. Een controleproef zonder het aangelegde elektrische veld van belang om te bepalen of het elektrische veld verandert de migratie snelheid van de cellen.

Echter, de huidige galvanotaxis kamers beperkt tot filmen celmigratie tot 4 uur, vanwege de kleine hoeveelheid medium in de reservoirs. Met een vergrote versie van het kamerontwerp, zou het mogelijk zijn om cellen film gedurende een langere tijd.

ve_content "> Sommige potentiële problemen in de werkwijze omvatten:. 1) de cellen overlijdt tijdens de kamer samenstel als ze gedroogde Aangezien er een zeer klein volume medium in de kamer (400 pl), is het belangrijk om geen luchtinsluitingen bellen in de kamer en wat vloeistof die de cellen tijdens de cel spoelstap houden. 2) De ruimte zou kunnen lekken tijdens beeldvorming, waarbij de stroom door de kamer zou afnemen. De vloeistofstroom in de kamer moet zorgvuldig worden gecontroleerd voordat overgedragen aan de microscoop podium en meer high vacuüm vet toegepast indien nodig. 3) Vlekkerige hoog vacuüm vet kunnen interfereren met filmen. De glazen oppervlak kan worden schoongemaakt met 95% alcohol om vet te verwijderen. 4) Stage drift of een verplaatsing van de kamers op een gemotoriseerde microscoop podium kan vertekening van de metingen van de gerichte migratie. Daarom is het belangrijk om de galvanotaxis kamers beveiligen voldoende stadium houder en etikettering tape.

ntent "> algemeen de galvanotaxis methode nuttig voor de intrinsieke gerichtheid beweeglijke cellen in een aangelegd elektrisch veld, dat helpt ons met als doel de directionele migratie in organismen onthullen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

De prostaat cellijnen worden vriendelijk door Dr. Ling-Yu Wang en Dr. Hsing-Jien Kung op Cancer Center, UC Davis. Dit project wordt ondersteund door NIH galvanotaxis subsidie ​​4R33AI080604.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells
pRNS-1-1 prostate cells Lee, et al. (1994)
PNT2 prostate cells Sigma-Aldrich 95012613-1VL Berthon, et al. (1995)
Medium and solutions
RPMI 1640 medium  Invitrogen 11875-093 warm up to 37 °C before use
Fetal Bovine Serum - Premium Atlanta Biologicals S11150 10% in PBS, warm up to 37 °C before use
Antibiotic-Antimycotic (100x) Life Technologies 15240 add 5 ml to 500 ml medium
2-propanol VWR BDH1133-5GL
PBS - - 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4 and 1.5 mM KH2PO4 in 1,000 ml of H2O, pH to 7.4 and autoclaved, warm up to 37 °C before use
0.25% Trypsin-EDTA  Invitrogen 25200-056 warm up to 37 °C before use, treat cells for 3-5 min at 37 °C
Galvanotaxis device
Galvanotaxis chambers Precision Plastics Inc, CA Custom-designed (1/4" x 2" x 3.5"), non-toxic, clear PVC chambers. Please contact the authors for the design specs.
Galvanotaxis electrodes UCD electric shop platinum coiled electrodes with flexable cords
Galvanotaxis power box Substrate Engineering, CA custom-designed DC power output with voltmeter
Microscope Cover Glass, Large, 45 x 50 mm, No. 1.5 Fisher 12-544-F
Microscope Cover Glass, small, 25 x 25 mm, No. 1 ThermoScientific 3307
Diamond point marker ThermoScientific 750
Marine grade silicon sealer, clear 3M 051135-08019
High vacuum grease Dow Corning 2021846-0807
6 ml syringe Fisher Scientific 05-561-64
Nichiryo Syringe, 1.5 ml Nichiryo SG-M
Cotton applicators Purtian Medical Products 806-WC
Qtips Johnson & Johnson 729389
Nalgene 180 PVC tubing  Nalgene 8000-9030 503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall
Bacto-Agar Difco 0140-01 make 2% agar solution
Razor Blade Personna 74-0001
Equipments and Software
Benchtop Centrifuge Eppendorf 5810R operated with an A-4-62 rotor
Cellometer Auto T4 Nexcelom Auto T4
Cellometer counting chambers Nexcelom CHT4-SD100-002 load 20 μl cell solutions to count
Culture Temp Warming plate Bel-Art Scienceware 370150000 to keep the galvanotaxis chambers at 37 °C 
Eclipse TE-2000 microscope with motorized stage and environmental chamber Nikon
Plan Fluor 10X/0.30 objective len Nikon
Retiga EX CCD camera  Qimaging Cooled CCD camara, mono-color, 12-bit
Compressed air with 5% CO2 Airgas special order
Volocity 6.3 PerkinElmer Image acquiring software
Improvision OpenLab 5.5.2 PerkinElmer Cell tracking software and customized to measure migration angles
FileMaker Pro Advanced, 8.0 FileMaker
Microsoft Excel 2008 for Mac Microsoft

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe. Nat Protoc. 2, (3), 661-669 (2007).
  2. Cao, L., et al. Endogenous electric currents might guide rostral migration of neuroblasts. EMBO Rep. 14, (2), 184-190 (2013).
  3. Hotary, K. B., Robinson, K. R. Endogenous electrical currents and voltage gradients in Xenopus embryos and the consequences of their disruption. Dev Biol. 166, (2), 789-800 (1994).
  4. Hotary, K. B., Robinson, K. R. Evidence of a role for endogenous electrical fields in chick embryo development. Development. 114, (4), 985-996 (1992).
  5. Yamashita, M. Electric axon guidance in embryonic retina: galvanotropism revisited. Biochem Biophys Res Commun. 431, (2), 280-283 (2013).
  6. Wood, M. D., Willits, R. K. Applied electric field enhances DRG neurite growth: influence of stimulation media, surface coating and growth supplements. J Neural Eng. 6, (4), 046003 (2009).
  7. Kucerova, R., et al. The role of electrical signals in murine corneal wound re-epithelialization. J Cell Physiol. 226, (6), 1544-1553 (2011).
  8. Sillman, A. L., Quang, D. M., Farboud, B., Fang, K. S., Nuccitelli, R., Isseroff, R. R. Human Dermal fibroblasts do not exhibit directional migration on collagen I in direct-current electric fields of physiological strength. Exp Dermatol. 12, (4), 396-402 (2003).
  9. Allen, G. M., Mogilner, A., Theriot, J. A. Electrophoresis of cellular membrane components creates the directional cue guiding keratocyte galvanotaxis. Curr Biol. 23, (7), 560-568 (2013).
  10. Nishimura, K. Y., Isseroff, R. R., Nuccitelli, R. Human keratinocytes migrate to the negative pole in direct current electric fields comparable to those measured in mammalian wounds. J Cell Sci. 109, (1), 199-207 (1996).
  11. Farboud, B., Nuccitelli, R., Schwab, I. R., Isseroff, R. R. DC electric fields induce rapid directional migration in cultured human corneal epithelial cells. Exp Eye Res. 70, (5), 667-673 (2000).
  12. Fang, K. S., Ionides, E., Oster, G., Nuccitelli, R., Isseroff, R. R. Epidermal growth factor receptor relocalization and kinase activity are necessary for directional migration of keratinocytes in DC electric fields. J Cell Sci. 112, (12), 1967-1978 (1999).
  13. Li, J., et al. Activated T lymphocytes migrate toward the cathode of DC electric fields in microfluidic devices. Lab Chip. 11, (7), 1298-1304 (2011).
  14. Meng, X., Arocena, M., Penninger, J., Gage, F. H., Zhao, M., Song, B. PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors. Exp Neurol. 227, (1), 210-217 (2011).
  15. Wu, D., Ma, X., Lin, F. DC Electric Fields Direct Breast Cancer Cell Migration, Induce EGFR Polarization, and Increase the Intracellular Level of Calcium Ions. Cell Biochem Biophys. 67, (3), 1115-1125 (2013).
  16. Martin-Granados, C., et al. A role for PP1/NIPP1 in steering migration of human cancer cells. PLoS One. 7, (7), 40769 (2012).
  17. Yang, H. Y., Charles, R. P., Hummler, E., Baines, D. L., Isseroff, R. R. The epithelial sodium channel mediates the directionality of galvanotaxis in human keratinocytes. J Cell Sci. 126, (9), 1942-1951 (2013).
  18. Zhao, M., et al. Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH kinase-gamma and PTEN. Nature. 442, (7101), 457-460 (2006).
  19. Shanley, L. J., Walczysko, P., Bain, M., MacEwan, D. J., Zhao, M. Influx of extracellular Ca2+ is necessary for electrotaxis in Dictyostelium. J Cell Sci. 119, (22), 4741-4748 (2006).
  20. Zhao, M., Agius-Fernandez, A., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Directed migration of corneal epithelial sheets in physiological electric fields. Invest Ophthalmol Vis Sci. 37, (13), 2548-2558 (1996).
  21. Peng, H. B., Jaffe, L. F. Polarization of fucoid eggs by steady electrical fields. Dev Biol. 53, (2), 277-284 (1976).
  22. Lee, M., et al. Characterization of adult human prostatic epithelial-cells immortalized by polybrene-induced DNA transfection with a plasmid containing an origin-defective sv40-genome. Int J Oncol. 4, (4), 821-830 (1994).
  23. Berthon, P., Cussenot, O., Hopwood, L., Leduc, A., Maitland, N. Functional expression of sv40 in normal human prostatic epithelial and fibroblastic cells - differentiation pattern of non-tumorigenic cell-lines. Int J Oncol. 6, (2), 333-343 (1995).
  24. Aurich-Costa, J., Vannier, A., Grégoire, E., Nowak, F., Cherif, D. IPM-FISH, a new M-FISH approach using IRS-PCR painting probes: application to the analysis of seven human prostate cell lines. Genes Chromosomes Cancer. 30, (2), 143-160 (2001).
  25. Tyson, D. R., Inokuchi, J., Tsunoda, T., Lau, A., Ornstein, D. K. Culture requirements of prostatic epithelial cell lines for acinar morphogenesis and lumen formation in vitro: role of extracellular calcium. Prostate. 67, (15), 1601-1613 (2007).
  26. Lang, S. H., Sharrard, R. M., Stark, M., Villette, J. M., Maitland, N. J. Prostate epithelial cell lines form spheroids with evidence of glandular differentiation in three-dimensional Matrigel cultures. Br J Cancer. 85, (4), 590-599 (2001).
  27. Babona-Pilipos, R., Popovic, M. R., Morshead, C. M. A galvanotaxis assay for analysis of neural precursor cell migration kinetics in an externally applied direct current electric field. J Vis Exp. (68), (2012).
  28. Meng, X., et al. Electric field-controlled directed migration of neural progenitor cells in 2D and 3D environments. J Vis Exp. (60), (2012).
  29. Pullar, C. E., Isseroff, R. R. Cyclic AMP mediates keratinocyte directional migration in an electric field. J Cell Sci. 118, (9), 2023-2034 (2005).
  30. Sheridan, D. M., Isseroff, R. R., Nuccitelli, R. Imposition of a physiologic DC electric field alters the migratory response of human keratinocytes on extracellular matrix molecules. J Invest Dermatol. 106, (4), 642-646 (1996).
  31. Feng, J. F., et al. Guided migration of neural stem cells derived from human embryonic stem cells by an electric field. Stem Cells. 30, (2), 349-355 (2012).
  32. Mukerjee, E. V., Isseroff, R. R., Nuccitelli, R., Collins, S. D., Smith, R. L. Microneedle array for measuring wound generated electric fields. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 1, 4326-4328 (2006).
  33. Nuccitelli, R., Nuccitelli, P., Li, C., Narsing, S., Pariser, D. M., Lui, K. The electric field near human skin wounds declines with age and provides a noninvasive indicator of wound healing. Wound Rep. and Reg. 19, 645-655 (2011).
Gebruik te maken van op maat ontworpen galvanotaxis Chambers naar Study Directional Migratie van Prostaat Cellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, H. y., Dinh La, T., Isseroff, R. R. Utilizing Custom-designed Galvanotaxis Chambers to Study Directional Migration of Prostate Cells. J. Vis. Exp. (94), e51973, doi:10.3791/51973 (2014).More

Yang, H. y., Dinh La, T., Isseroff, R. R. Utilizing Custom-designed Galvanotaxis Chambers to Study Directional Migration of Prostate Cells. J. Vis. Exp. (94), e51973, doi:10.3791/51973 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter