Abstract
生理电场供应特定的生物功能，如指导细胞迁移在胚胎发育，神经元向外生长和上皮伤口愈合。 体外施加直流电场到培养的细胞诱导定向细胞迁移，或趋电。我们在这里展示的2维趋电方法经修改以定做的聚（氯乙烯）（PVC）的腔室，玻璃表面，铂电极和使用在其上的细胞成像的机动阶段。在PVC室和铂电极具有低毒性，且价格合理和可重复使用的。在玻璃表面和电动显微镜阶段改善图象的质量，并允许可能的修改，以在玻璃表面，并处理该细胞。我们拍摄的两个非致瘤性，SV40永生化前列腺细胞系，PRNS-1-1和PNT2的趋电。这两种细胞系表现出类似的迁移速度和迁移均朝阴极，但它们确实显示出不同程度的方向性的趋电。通过此协议中得到的结果表明，PRNS-1-1和PNT2细胞株可具有管其定向洄游响应不同的内在特征。
Introduction
内源性电场在各种组织，如皮肤1，32，33和脑2检测到。生理电场供应特定的生物功能，包括引导胚胎发育3，第4，指导神经元突起5,6的向外生长，促进上皮细胞和角膜伤口闭合1,7。 在体外 ，施加直流电场来培养细胞模仿生理电场和诱导定向细胞迁移，或趋电。趋电已经研究中的成纤维细胞8，鱼角化9，人上皮和角膜角化10-12，淋巴细胞13，神经母细胞2和神经元祖细胞14。当暴露于施加的场，大部分研究细胞的定向迁移朝向阴极（ - ）极。然而，一些癌症的细胞，包括高转移人乳腺癌细胞和人前列腺癌细胞系PC-3M，移动到anodal（+）极15,16。提出调解趋电或解释的细胞，以感测电场的能力，包括活化几种机制的表皮生长因子受体12，上皮钠通道17，PI3K和PTEN的18，和钙离子释放15，19，其机制还没有完全理解，这是可能的，多种信号传导途径中涉及趋电。
表征粘附，游动细胞的定向迁移，既可以监视单个细胞迁移10，12，17或迁移融合细胞的片材18，20，该技术是由改性后，我们在这里展示的2维趋电的方法是有用鹏贾菲21，和西村等 10与定制，透明PVC室，可移动coverslIPS允许趋电性进行二次分析，如免疫荧光成像后容易细胞检索。的趋电室中的玻璃表面的光兼容，这使得拍摄在高放大倍率和与荧光标记的细胞。它也允许在实验设计与玻璃表面的改性，如改变表面涂层或收费。制成的第1号盖玻片隔件被用于在腔室，以最小化电流的流动过的细胞;因此焦耳热，这是成比例的电流的平方，将不会在实验过程中过热的细胞。连接琼脂桥防止与细胞中的电极的直接接触，并防止在趋电介质的pH值或离子浓度的改变。
两个非致瘤性的人类前列腺细胞系检查在这项研究中的趋电响应。该PRNS-1-1 22和PNT223顷既SV40永生化，生长因子依赖性细胞系的表达上皮标志物细胞角蛋白5，8，18和19与前列腺特异性抗原（PSA）的低或无表达。两种细胞系维持正常上皮细胞的多边形形态，但染色体异常中观察到核型22，24，虽然PRNS-1-1和PNT2在大多数实验中有着相似的行为，但它们确实显示出在腺泡结构的形成，并在不同趋电性。在3-D矩阵，基底膜，将PRNS-1-1细胞形成空心腺泡结构，类似于流明的正常前列腺腺体组织25。然而，PNT2细胞形成固体球体无管腔或极化上皮26。所述PRNS-1-1细胞也表现出比在目前的研究中PNT2更高趋电响应。形成腺泡结构和趋电之间的相关性PRNS-1-1表明趋电信号可在组织PR发挥作用ostate腺组织的运动响应于内源性电场，并提供了进一步的特征，这些2细胞系之间进行区分。
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Protocol
1.培养前列腺细胞
- 培养PRNS-1-1和PNT2前列腺细胞上100毫米培养皿在RPMI 1640培养基补充有10％FBS和抗生素-抗真菌剂，在37℃，5％的CO 2。每天刷新培养基，直到细胞达到80％汇合的趋电实验。
2.装配趋电钱伯斯
- 组装底部室
- 擦拭塑料趋电室用2-丙醇。适用的海洋级硅密封剂周围的圆形开口与注射器的腔室的底侧，并附加一个大玻璃罩（ 图1）。采用棉花施用器的背面侧，以向下推动玻璃罩和擦去多余胶用棉签。所述圆形开口允许介质和电流流过位于这两个内层介质储层之间的细胞。
- 切一小玻璃罩，使的6毫米x 25毫米垫片用钻石点标记。
- 翻转室。应用2条纹的硅胶，用注射器和/或金属刮刀以创建为2圆形开口，底部玻璃之间细胞附着以10mm×25mm的通道表面。胶2片玻璃间隔2个圆孔之间。使用棉涂敷器的背面侧，以向下推隔板和擦去多余胶用棉签和/或牙签。
- 干燥室24小时，直至在硅胶固化。浸泡室在蒸馏水过夜以从胶除去乙酸残基。干燥室供立即使用，或在腔室，供以后使用存储在一个干净的容器中。
图1：底部趋电室的组装。 A）大玻璃罩附着到清洁室中。B的底部）TWO玻璃衬垫片的2圆形开口之间胶合以创建为10mm×25mm的通道供细胞附着。
- 在趋电室种子细胞
- 准备实验所需趋电室的要求数量。每个细胞系或治疗需要一个单一的趋电室中。擦拭趋电室与2-丙醇。用无菌PBS 3次洗室并检查室2个圆孔之间的液体流动。
- 括在无菌细胞培养皿的腔室，并允许他们平衡在37℃下进行15分钟。分离从用5毫升0.25％胰蛋白酶-EDTA的培养皿的前列腺细胞在37℃下5分钟。中和胰蛋白酶-EDTA用PBS5毫升10％FBS中。
- 转移细胞到15ml管，并在200×g离心，37℃离心细胞5分钟。吸出上清液并重新悬浮细胞于1ml培养基中。
- 就拿20μ升的细胞溶液加载到一个计数室并计算细胞数。调节细胞浓度至8×10 4个细胞/毫升培养基。
- 就拿趋电室出37℃的孵化器。种子350微升细胞悬浮液在每个室中。
- 在培养皿用湿的Kimwipe或在湿度室中在培养箱中在37℃，5％CO 2孵育过夜，在室中的细胞。
图2：接种细胞到所述腔室的底部室中干燥并清洁A）的前列腺细胞胰蛋白酶处理，计数并传送到所述腔室并孵育过夜B）中的顶玻璃罩附着拍摄前，以密封腔室。
- 一ssembling顶部室
- 组装前拍摄前室。显微镜只能容纳成像单个趋电室在同一时间。预热10毫升培养基在37℃下为每个趋电室中。转让从孵化器趋电室，以37℃加热板。
- 冲洗细胞培养基以除去未附着的细胞。离开400微升培养基中的腔室中。用注射器施加高真空润滑脂在两个玻璃间隔件的顶部。
- 添加一个小玻璃罩密封室。轻轻向下压用棉涂敷器的背面侧的玻璃罩。擦去多余的介质棉签。
- 干燥的玻璃表面，并应用在高真空油脂来密封玻璃罩和腔室之间的间隙。使用金属铲传播的油脂。加入4毫升培养基中于内水库和检查储层之间的液体流动。
- 使琼脂桥梁
- 切一对2英寸长的PVC管（一十六分之五百零三ID X 5/16外径x 1/16墙），翻转并将其插入到100毫升的烧杯中。
- 测量200毫克细菌用琼脂，并将其加入，在50毫升烧瓶中，用10ml培养基，使2％的琼脂凝胶。微波30秒。加载琼脂凝胶的塑料管具有一个移液管。离开琼脂桥在室温下10分钟以固化该琼脂。
- 加2ml培养基的趋电室的外储层。插入琼脂桥的内部和外部介质油藏进行的电流。
图3：拍摄上腔室中的细胞的图示来演示趋电室的最后的组装。该腔室是完全密封的高真空润滑脂。介质被加入叔Ó填补水库，和两个琼脂桥被插入到腔室中。然后将趋电室传送到显微镜阶段和电极连接到施加电场。侧视组装趋电室的被示出为证明该电流通过琼脂桥和盖玻璃之间的空间流过的细胞。
3.时间推移成像
- 在环境室切换到37℃，用5％的CO 2中的空气循环2小时之前成像。
- 打开显微镜和启动图像采集软件。校准显微镜阶段，并选择10X物镜。
- 转移趋电室的显微镜阶段，确保室用胶带和专注于细胞。插入趋电电极到外储层阴极右侧。固定电线用胶带的电极。
- 开关电源博x到电场施加到腔室中。测量的输出电压与整个室中的电压表，达到2.5伏为25mm长的腔室（100毫伏/毫米）。通过调节输出电流保持在实验过程中的场强。
- 选择跨室10分的软件，电影，产生10定时短片。设置获取条件以10分钟的间隔为2小时。
- 开始拍摄，并根据需要调整输出电流。
- 在实验结束时，取出从舞台的腔和固定细胞用95％的酒精。破开了腔用刀片清理和重新使用它。
4.量化趋电性的
- 旋转时间推移电影和重新定位阴极到的图像的顶部。导出电影的单元格跟踪软件。
- 手动跟踪（X，Y）10-20细胞在每个时间点从每部电影（ 图4 A，B）的位置。相对于南北方向上的迁移距离和角度，电场的方向相同，将计算在小区的跟踪软件（ 图4C）。
注：平均迁移速度被从总迁移距离和总拍摄时间换算。方向性是从垂直于余弦值进行转换。如果细胞随机方向性迁移，净余弦平均将接近零。如果细胞直接迁移向阴极，余弦值将是1。如果细胞直接迁移向阳极，余弦值将是-1。
图4：细胞跟踪测量方向性跟踪线细胞图像A）覆盖。细胞的（X，Y）位置是manuaLLY跟踪在时间推移的电影。如果细胞迁移随机，平均余弦接近于零B）但是，如果细胞向阴极或阳极迁移的平均余弦的值是接近+（阴极）或- （阳极）1.0C 的 ）的方向性，提出通过余弦值，这是从迁移的角度（θ）进行转换。余弦（θ）等于距离a（迁移距离），以距离B（投影于电场的方向上的距离）的比率。
- 保存测量结果。导入数据到数据库应用程序来计算组合的结果。
- 平均迁移速度和平均余弦值组合的数据导出到电子表格绘制棒图（ 图5）。
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Representative Results
两行前列腺细胞（PRNS-1-1和PNT2）进行了调查用这种方法。在这两个细胞系在超过2小时（ 图5A）的过程类似的速度为1.0 +/- 0.3微米/分钟迁移。然而，方向性的电场是0.7 +/- 0.3的PRNS-1-1线，和0.2±0.8对PNT2线（ 图5B）。结果显示在这两个细胞系的趋电一显著差异（p <0.01，100个细胞被跟踪），这表明它们具有导致不同的定向响应位置线索不同细胞信号传导机制。
趋电前列腺细胞：图5。 A）中 PRNS-1-1和PNT2线的迁移速度是相似当细胞暴露于电场。乙 ）然而，PRNS-1-1线显示出高方向性朝向阴极（余弦= 0.7），而PNT2线呈低方向性（余弦= 0.2）中的电场。
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Discussion
一个细胞的趋电性反应的分析，一直是许多细胞迁徙或增长的重要功能指标处理27，28。在这里，我们使用一个特制室玻璃表面拍摄2前列腺细胞系。这些细胞系表现出不同程度的趋电的，和我们推测，细胞内定位或趋电介导蛋白的激活可能产生不死的细胞系，从而导致在趋电响应的观察到的差异的过程中受到干扰。
相比在培养皿27，28作出其它趋电室的设计中，有几个好处，以目前的设计。首先，将玻璃表面适于成像，并与细胞中的玻璃罩可以趋电对于免疫染色后进行检索。在这项研究中，我们使用的10X物镜低倍率来监视一组细胞。然而，随着THESË改进玻璃光学，所以能够拍摄单个细胞以较高的放大倍率用60X油浸物镜，用于跟踪快速扩展lamellipodial的和缩回的单元17的前缘，或跟踪标记的细胞的荧光蛋白质。第二，在玻璃表面可以被改性基质蛋白涂层10,12或图案化的微通道。化学处理，也可以预先拍摄29日前处理细胞。不需要在这里所用的前列腺细胞系基质涂层，基质涂层是细胞类型依赖性的。例如，I型胶原涂层所需的人角质形成细胞30的趋电，但层粘 连蛋白涂层所需的人神经干细胞31的趋电。我们在胶原I，胶原蛋白IV，纤连蛋白，层粘连蛋白和测试人角质细胞趋电。不同的基质蛋白改变细胞的迁移速度，但并没有改变阴极migrati在趋电29。第三，改性铂电极是惰性的电场。相比，与其他趋电方法27中使用的银电极，它们不分解或释放出金属离子的介质，从而降低了细胞毒性趋电。第四，我们可能会改变帧捕捉，这有助于我们监测快速或慢速细胞迁移的时间间隔。该电动显微镜也提供了机会，获得来自不同领域的多个电影在一个腔。的对照实验没有施加电场是用于确定是否所述电场改变了细胞的迁移速度非常重要的。
然而，目前的趋电室被限制为拍摄的细胞迁移对于长达4小时，由于在储层小体积培养基。用的腔室设计的放大版本，这将是可能的薄膜电池的时间较长。
ve_content“>在该方法的一些潜在的问题包括：1）的细胞可能在腔室组装期间死如果它们变得干涸由于在所述腔室（400微升）非常小的体积的介质中，它避免捕集空气是很重要的气泡在腔室，并保持一些液体在细胞漂洗步骤覆盖细胞。2）的腔室可以在成像期间泄漏，这将降低电流通过腔室的液体流在腔室应仔细检查它之前转移到显微镜载物台和更高真空润滑脂施加如果需要的话。3）出现模糊的高真空润滑脂可以与拍摄干扰的玻璃表面可以用95％酒精清洗以去除油污。4）阶段漂移或腔室上的任意位移一个电动显微镜阶段可能偏压定向迁移的测量结果。因此，为了确保趋电室提供足够的阶段保持器和标签的磁带是非常重要的。 ntent“>总的来说，趋电的方法是有用的，以揭示游动细胞的固有方向性在施加电场，这将有助于我们进一步了解在生物体的定向迁移。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
前列腺细胞系敬请凌钰王博士和幸吉恩孔博士在癌症中心，加州大学戴维斯分校提供的。该项目由美国国立卫生研究院资助趋电性支持4R33AI080604。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| pRNS-1-1 prostate cells | Lee, et al. (1994) | ||
| PNT2 prostate cells | Sigma-Aldrich | 95012613-1VL | Berthon, et al. (1995) |
| Medium and solutions | |||
| RPMI 1640 medium | Invitrogen | 11875-093 | warm up to 37 °C before use |
| Fetal Bovine Serum - Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | 10% in PBS, warm up to 37 °C before use |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Life Technologies | 15240 | add 5 ml to 500 ml medium |
| 2-propanol | VWR | BDH1133-5GL | |
| PBS | - | - | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4 and 1.5 mM KH2PO4 in 1,000 ml of H2O, pH to 7.4 and autoclaved, warm up to 37 °C before use |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | warm up to 37 °C before use, treat cells for 3-5 min at 37 °C |
| Galvanotaxis device | |||
| Galvanotaxis chambers | Precision Plastics Inc, CA | Custom-designed (1/4" x 2" x 3.5"), non-toxic, clear PVC chambers. Please contact the authors for the design specs. | |
| Galvanotaxis electrodes | UCD electric shop | platinum coiled electrodes with flexable cords | |
| Galvanotaxis power box | Substrate Engineering, CA | custom-designed DC power output with voltmeter | |
| Microscope Cover Glass, Large, 45 x 50 mm, No. 1.5 | Fisher | 12-544-F | |
| Microscope Cover Glass, small, 25 x 25 mm, No. 1 | ThermoScientific | 3307 | |
| Diamond point marker | ThermoScientific | 750 | |
| Marine grade silicon sealer, clear | 3M | 051135-08019 | |
| High vacuum grease | Dow Corning | 2021846-0807 | |
| 6 ml syringe | Fisher Scientific | 05-561-64 | |
| Nichiryo Syringe, 1.5 ml | Nichiryo | SG-M | |
| Cotton applicators | Purtian Medical Products | 806-WC | |
| Qtips | Johnson & Johnson | 729389 | |
| Nalgene 180 PVC tubing | Nalgene | 8000-9030 | 503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall |
| Bacto-Agar | Difco | 0140-01 | make 2% agar solution |
| Razor Blade | Personna | 74-0001 | |
| Equipments and Software | |||
| Benchtop Centrifuge | Eppendorf | 5810R | operated with an A-4-62 rotor |
| Cellometer Auto T4 | Nexcelom | Auto T4 | |
| Cellometer counting chambers | Nexcelom | CHT4-SD100-002 | load 20 μl cell solutions to count |
| Culture Temp Warming plate | Bel-Art Scienceware | 370150000 | to keep the galvanotaxis chambers at 37 °C |
| Eclipse TE-2000 microscope with motorized stage and environmental chamber | Nikon | ||
| Plan Fluor 10X/0.30 objective len | Nikon | ||
| Retiga EX CCD camera | Qimaging | Cooled CCD camara, mono-color, 12-bit | |
| Compressed air with 5% CO2 | Airgas | special order | |
| Volocity 6.3 | PerkinElmer | Image acquiring software | |
| Improvision OpenLab 5.5.2 | PerkinElmer | Cell tracking software and customized to measure migration angles | |
| FileMaker Pro Advanced, 8.0 | FileMaker | ||
| Microsoft Excel 2008 for Mac | Microsoft | ||
References
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