Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

الاستفادة من تصميم مخصص انجذاب غلفاني غرف لدراسة الاتجاه الهجرة من خلايا البروستاتا

doi: 10.3791/51973 Published: December 7, 2014

Abstract

يخدم الحقل الكهربائي الفسيولوجية الوظائف البيولوجية محددة، مثل توجيه الهجرة خلية في تطور الجنين، ثمرة العصبية الظهارية والتئام الجروح. تطبيق حقل كهربائي الحالي مباشرة إلى الخلايا المستزرعة في المختبر يدفع الهجرة الخلية الاتجاه، أو انجذاب غلفاني. طريقة انجذاب غلفاني 2-الأبعاد نظهر هنا يتم تعديل مع العرف بولي (كلوريد الفينيل) (PVC) الكاميرات، سطح الزجاج، وأقطاب البلاتين واستخدام مرحلة الآلية التي يتم تصوير الخلايا. غرف PVC وأقطاب البلاتين يحمل منخفضة السمية الخلوية وبأسعار معقولة وقابل لاعادة الاستخدام. سطح الزجاج والمسرح المجهر الآلية تحسين جودة الصور وتسمح التعديلات المحتملة على سطح الزجاج والعلاجات للخلايا. نحن بتصوير انجذاب غلفاني اثنين من غير مكون للأورام، خطوط خلد SV40 خلية البروستاتا، pRNS-1-1 وPNT2. هذه خطوط الخلايا اثنين تظهر بسرعة هجرة مماثلة وكلا تهاجر نحوالكاثود، لكنها تظهر درجة مختلفة من اتجاهها في انجذاب غلفاني. النتائج التي تم الحصول عليها عن طريق هذا البروتوكول تشير إلى أن pRNS-1-1 وخطوط الخلايا PNT2 قد يكون لها سمات مختلفة الجوهرية التي تحكم ردود المهاجرة الاتجاه بهم.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تم الكشف عن الحقول الكهربائية المحلية في الأنسجة المختلفة، مثل الجلد 1، 32، 33 و الدماغ 2. يخدم الحقل الكهربائي الفسيولوجية الوظائف البيولوجية محددة، بما في ذلك توجيه تطور الجنين 3، 4، توجيه ثمرة من العمليات العصبية 5 و 6 و تعزيز الظهارية والقرنية الجرح إغلاق 1 و 7. في المختبر، وتطبيق حقل كهربائي الحالي مباشرة إلى الخلايا المستزرعة يقلد الحقل الكهربائي الفسيولوجية ويستحث الهجرة الخلية الاتجاه، أو انجذاب غلفاني. وقد درست انجذاب غلفاني في الخلايا الليفية 8، 9 الكيراتينية الأسماك، الظهارية البشري والخلايا الكيراتينية القرنية 10-12، الخلايا اللمفية 13، neuroblasts والخلايا العصبية السلف 14. عندما تتعرض لمجال التطبيقية، والغالبية العظمى من الخلايا درس تهاجر إتجاهي نحو المهبطي (-) قطب. ومع ذلك، وعدة خلايا السرطان، بما في ذلك درجة عالية من النقيليخلايا سرطان الثدي البشرية والبروستاتا البشرية خط الخلايا السرطانية PC-3M، الانتقال إلى مصعدي (+) قطب 15 و 16. واقترحت عدة آليات للتوسط انجذاب غلفاني أو لتفسير قدرة الخلايا على الإحساس الحقل الكهربائي، بما في ذلك تفعيل من EGF مستقبلات 12، قناة الصوديوم الظهارية 17، PI3K وPTEN 18، وإطلاق الكالسيوم أيونات 15 و 19. هذه الآلية ليست مفهومة تماما حتى الآن وأنه من الممكن أن تشارك مسارات إشارات متعددة في انجذاب غلفاني.

طريقة انجذاب غلفاني 2-الأبعاد نظهر هنا هو مفيد لتوصيف الهجرة الاتجاه من تمسكا، وخلايا متحركة، إما لمراقبة الهجرة الفردية خلية 10، 12، 17 أو الهجرة من ورقة من خلايا متكدسة 18 و 20. يتم تعديل هذه التقنية من بنغ وجافي 21، ونيشيمورا وآخرون. 10 مع حسب الطلب، غرف PVC واضحة، مع coversl قابلة للإزالةIPS يسمح لسهولة استرجاعها الخلية بعد انجذاب غلفاني للتحليل الثانوي، مثل التصوير المناعية مضان. السطح الزجاجي للغرف انجذاب غلفاني هو بصري متوافق، مما يسمح للتصوير في تضخم عالية ومع الخلايا fluorescently المسمى. كما يسمح التصميم التجريبي مع تعديل سطح الزجاج، مثل تغيير طلاء السطح أو رسوم. وتستخدم الفواصل مصنوعة من رقم 1 ساترة في غرف للحد من تدفق التيار فوق الخلايا. وبالتالي فإن التدفئة الجول، التي تتناسب مع مربع تدفق التيار، وليس من شأنه أن ارتفاع درجة حرارة الخلايا أثناء التجربة. الجسور أجار ربط تمنع الاتصال المباشر من الأقطاب الكهربائية مع الخلايا وتمنع تغيير درجة الحموضة متوسطة أو تركيز أيون خلال انجذاب غلفاني.

تم فحص اثنين من غير مكون للأورام البروستاتا خطوط الخلايا البشرية للاستجابة انجذاب غلفاني في هذه الدراسة. وpRNS-1-1 22 و 23 PNT2 كلاهما SV40 خلد، خطوط الخلايا التي تعتمد على عامل النمو معربا عن علامات الظهارية cytokeratin 5 و 8 و 18 و 19 مع التعبير منخفضة أو معدومة في البروستاتا محددة مستضد (PSA). كل من خطوط الخلايا تحافظ على مورفولوجيا المضلع من الخلايا الظهارية العادية، ولكن لوحظ اضطراب صبغي في تنميط نووي 22 و 24. وعلى الرغم من pRNS-1-1 وPNT2 مشاركة سلوكيات مماثلة في معظم التجارب، إلا أنها تظهر الاختلافات في تشكيل هيكل عنيبية و انجذاب غلفاني. على مصفوفة 3-D، Matrigel، وpRNS-1-1 الخلايا تشكل هياكل جوفاء عنيبية مع شمعة تشبه البروستاتا العادية الغدة الأنسجة 25. ومع ذلك، فإن الخلايا PNT2 تشكل الأجسام الشبه الكروية الصلبة دون التجويف أو ظهارة الاستقطاب 26. كما تظهر الخلايا pRNS-1-1 استجابة galvanotactic أعلى من PNT2 في الدراسة الحالية. العلاقة بين تشكيل هيكل عنيبية وانجذاب غلفاني في pRNS-1-1 تشير إلى أن إشارات galvanotactic قد تلعب دورا في تنظيم العلاقات العامةostate الحركات الأنسجة الغدة ردا على الحقول الكهربائية الذاتية، ويوفر المزيد من الخصائص للتمييز بين هذه خطوط الخلايا 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. خلايا التثقيف البروستاتا

  1. ثقافة pRNS-1-1 وPNT2 البروستاتا الخلايا على 100 ​​أطباق ثقافة ملم في المتوسط ​​1640 RPMI تستكمل مع 10٪ FBS والمضادات الحيوية-مضاد فطري عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. تحديث مستنبت كل يوم حتى تصل إلى خلايا 80٪ confluency للتجارب انجذاب غلفاني.

2. تجميع انجذاب غلفاني الغرف

  1. تجميع الدوائر السفلى
    1. القضاء على انجذاب غلفاني غرفة من البلاستيك مع 2-بروبانول. تطبيق السداده الصف السيليكون البحرية حول فتحات دائرية على الجانب السفلي من الغرفة مع حقنة وإرفاق ساترة كبيرة (الشكل 1). استخدام الجانب الخلفي للقضيب من القطن لدفع أسفل ساترة وتمحو الغراء الزائد مع مسحات القطن. فتحات دائرية تسمح على المديين المتوسط ​​والتيار الكهربائي لتتدفق على الخلايا تقع بين اثنين من الخزانات المتوسطة الداخلية.
    2. قطع صغيرة ساترة لجعل 6 مم × 25 مم الفواصل مع علامة نقطة الماس.
    3. الوجه الغرفة. تطبيق 2 المشارب من الغراء السيليكون مع حقنة و / أو ملعقة معدنية لإنشاء 10 مم × 25 مم سطح القناة لمرفق الخلية بين فتحات دائرية 2 على الزجاج السفلي. الغراء 2 قطعة من الزجاج الفاصل بين فتحات دائرية 2. استخدام الجانب الخلفي من تطبيقها القطن لدفع أسفل الفواصل وتمحو الغراء الزائد مع مسحات القطن و / أو المسواك.
    4. تجف الغرفة لمدة 24 ساعة حتى يتم الشفاء الغراء السيليكون. نقع في غرفة المقطر بين عشية وضحاها بالماء لإزالة بقايا حمض الخليك من الغراء. تجفيف غرفة للاستخدام الفوري، أو تخزين غرفة لاستخدامها لاحقا في وعاء نظيف.
      الشكل (1)
      الشكل 1: جمعية الغرفة أسفل انجذاب غلفاني. A) ومرفق ساترة كبيرة إلى أسفل غرفة نظيفة. B) Tالتعليم الجامعي يتم لصقها قطعة من الزجاج الفواصل بين فتحات دائرية 2 لإنشاء 10 مم × 25 مم قناة للخلايا لإرفاق.
  2. بذر الخلايا على غرف انجذاب غلفاني
    1. إعداد تتطلب عدد من الغرف انجذاب غلفاني اللازمة للتجربة. كل سطر الخلية أو العلاج يتطلب غرفة انجذاب غلفاني واحدة. مسح غرف انجذاب غلفاني مع 2-بروبانول. غسل غرف مع العقيمة PBS 3 مرات والتحقق من تدفق السائل بين فتحات دائرية 2 في غرف.
    2. أرفق غرف في أطباق زراعة الخلايا العقيمة والسماح لهم لكي تتوازن في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. فصل الخلايا البروستاتا من طبق ثقافتهم باستخدام 5 مل 0.25٪ التربسين-EDTA عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تحييد التربسين-EDTA مع 5 مل 10٪ FBS في برنامج تلفزيوني.
    3. نقل الخلايا إلى 15 مل أنابيب وأجهزة الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في 200 x ج، 37 ° C. نضح طاف واعادة تعليق الخلايا في 1 مل من مستنبت.
    4. يستغرق 20 μلتر من حل الخلية لتحميل إلى غرفة الفرز وحساب عدد الخلايا. ضبط تركيز الخلية إلى 8 × 10 4 خلية / مل مع الثقافة المتوسطة.
    5. خذ غرف انجذاب غلفاني من C حاضنة 37 درجة. البذور 350 ميكرولتر من تعليق الخلية على كل من المجلسين.
    6. احتضان الخلايا في الدوائر بين عشية وضحاها في صحن الثقافة مع Kimwipe رطبة أو في غرفة الرطوبة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.

الشكل 2
الشكل 2: البذر الخلايا إلى غرفة تجفف غرفة السفلى وتنظيفها وtrypsinized خلايا A) البروستاتا، عد ونقل إلى غرفة وحضنت بين عشية وضحاها B) ومرفق ساترة قصوى لختم الغرفة قبل التصوير...

  1. Assembling أعلى غرف
    1. تجميع الغرفة العليا قبل التصوير. يمكن المجهر تستوعب سوى التصوير غرفة انجذاب غلفاني واحدة في وقت واحد. الاحماء 10 مل من مستنبت في 37 ° C لكل غرفة انجذاب غلفاني. نقل غرفة انجذاب غلفاني من الحاضنات إلى 37 درجة مئوية في درجات الحرارة لوحة.
    2. شطف الخلايا مع مستنبت لإزالة الخلايا غير مرتبط. ترك 400 ميكرولتر من المتوسطة في الغرفة. استخدام حقنة لتطبيق عالية الشحوم فراغ على رأس كل من الفواصل الزجاجية.
    3. إضافة ساترة صغيرة لختم الغرفة. اضغط بلطف إلى أسفل ساترة مع الجانب الخلفي للقضيب من القطن. تمحو المتوسطة الزائدة مع مسحات القطن.
    4. يجف سطح الزجاج وتطبيق عالية الشحوم فراغ لاغلاق الفجوة بين ساترة والغرفة. استخدام ملعقة معدنية لنشر الشحوم. إضافة 4 مل من مستنبت إلى الخزانات الداخلية والتحقق من تدفق السائل بين الخزانات.
  2. جعل أجارالجسور
    1. قطع زوج من 2 بوصة أنابيب PVC طويلة (503/16 ID س 5/16 1/16 OD X ستريت)، والوجه وإدراجها في 100 مل دورق.
    2. قياس 200 ملغ Bacto آجار وإضافته في قارورة 50 مل مع 10 مل مستنبت لجعل 2٪ هلام أجار. الميكروويف لمدة 30 ثانية. تحميل هلام أجار إلى أنابيب بلاستيكية مع الماصة نقل. ترك الجسور أجار في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة لترسيخ آغار.
    3. إضافة 2 مل مستنبت إلى الخزانات الخارجية للغرفة انجذاب غلفاني. أدخل الجسور أجار إلى الخزانات المتوسطة الداخلية والخارجية لإجراء الحالية.

الشكل (3)
الرقم 3: تصوير الخلايا على غرفة رسم تخطيطي للتدليل على التجميع النهائي للغرفة انجذاب غلفاني. وختم الغرفة تماما مع ارتفاع الشحوم فراغ. يضاف المتوسطة رس ملء الخزانات، ويتم إدراج اثنين من الجسور أجار في الغرفة. ثم يتم تحويل غرفة انجذاب غلفاني إلى مرحلة المجهر وتعلق الأقطاب الكهربائية لتطبيق الحقل الكهربائي. ويظهر الجانبية الرأي من الغرفة انجذاب غلفاني تجميعها لإثبات أن يتدفق التيار الكهربائي على الخلايا من خلال الجسور أجار والفضاء بين غطاء زجاجي.

التصوير 3. الوقت الفاصل

  1. التبديل على غرفة البيئية إلى 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 في ساعة تعميم الهواء 2 قبل التصوير.
  2. التبديل على المجهر والشروع في البرمجيات الحصول على الصورة. معايرة مرحلة المجهر وحدد الهدف 10X.
  3. نقل غرف انجذاب غلفاني إلى مرحلة المجهر، وتأمين الغرفة مع الشريط والتركيز على الخلايا. إدراج الأقطاب انجذاب غلفاني إلى الخزانات الخارجي مع الكاثود على الجانب الأيمن. تأمين الأسلاك والأقطاب مع الشريط.
  4. التبديل على السلطة بوس لتطبيق حقل كهربائي الى قاعة المحكمة. قياس الجهد الناتج مع الفولتميتر عبر الغرفة لتصل إلى 2.5 فولت ل25 مم غرفة طويلة (100 فولت / مم). الحفاظ على قوة الميدان خلال التجربة عن طريق ضبط الانتاج الحالي.
  5. تحديد 10 نقطة في جميع أنحاء الغرفة لتصوير فيلم في البرنامج لتوليد عشرة أفلام مرور الزمن. إعداد الشروط الاستحواذ على فترات 10 دقيقة لمدة 2 ساعة.
  6. بدء التصوير وضبط الانتاج الحالي حسب الحاجة.
  7. في نهاية التجربة، وإزالة غرفة من مرحلة وإصلاح الخلايا مع 95٪ كحول. كسر مفتوحة الغرفة بشفرة حلاقة لتنظيف وإعادة استخدامها.

4. الكمي لانجذاب غلفاني

  1. تدوير الأفلام الوقت الفاصل بين وإعادة توجيه-القطب السالب إلى الجزء العلوي من الصور. تصدير الأفلام إلى تتبع خلية البرمجيات.
  2. تتبع (س، ص) موقف 10-20 خلايا في كل نقطة في الوقت من كل فيلم (الشكل 4 A، B) يدويا.، وهو نفس اتجاه المجال الكهربائي، وسيتم احتساب المسافات الهجرة والزوايا نسبة إلى اتجاه الشمال والجنوب في تتبع الخلايا البرمجيات (الشكل 4C).
    ملاحظة: يتم تحويل متوسط ​​سرعة الهجرة من المسافة إجمالي الهجرة ومجموع وقت التصوير. يتم تحويل اتجاهها من زوايا لقيمة جيب التمام. إذا تهاجر الخلايا مع الاتجاهية عشوائي، فإن متوسط ​​صافي جيب التمام تكون قريبة من الصفر. إذا كانت الخلايا تهاجر مباشرة نحو الكاثود، فإن قيمة جيب التمام يكون +1. إذا كانت الخلايا تهاجر مباشرة نحو القطب الموجب، فإن قيمة جيب التمام يكون -1.

الشكل (4)
الشكل 4: تتبع خلية لقياس الاتجاهية A) تراكب خطوط تتبع مع ​​الصور الخلية. و(س، ص) مواقف الخلايا مانواتتبع LLY في الأفلام مرور الزمن. . إذا كانت الخلايا تهاجر بشكل عشوائي، فإن متوسط ​​جيب التمام هي قريبة من الصفر ب) ومع ذلك، إذا كانت الخلايا تهاجر نحو القطب السالب أو الموجب، فإن قيمة متوسط ​​جيب التمام هي قريبة من + (الكاثود) أو - (الأنود) 1.0 C ) وتقدم الاتجاهية التي كتبها قيمة جيب التمام، والتي يتم تحويلها من زوايا الهجرة (θ). جيب التمام (θ) يساوي نسبة المسافة من (المسافة الهجرة) إلى المسافة ب (المسافة المتوقعة لاتجاه المجال الكهربائي).

  1. حفظ القياسات. استيراد البيانات إلى تطبيق قاعدة بيانات لحساب النتائج مجتمعة.
  2. تصدير البيانات المجمعة لمتوسط ​​سرعة الهجرة ومتوسط ​​قيمة جيب التمام إلى جدول بيانات لرسم الرسوم البيانية (الشكل 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وقد تم التحقيق سطرين من خلايا البروستاتا (pRNS-1-1 وPNT2) مع هذا الأسلوب. خلايا في كل خطوط تهاجر بسرعة مماثلة من 1.0 +/- 0.3 ميكرون / دقيقة على مدار 2 ساعة (الشكل 5A). ومع ذلك، يكون الاتجاه إلى المجال الكهربائي هو 0.7 +/- 0.3 لpRNS-1-1 الخط، و 0.2 +/- 0.8 للخط PNT2 (الشكل 5B). تظهر النتائج وجود اختلاف كبير في انجذاب غلفاني هذه خطوط الخلايا اثنين (P <0.01، تم تتبع 100 خلية)، مما يوحي بأن لديهم مختلف آليات الإشارات الخلوية التي تؤدي إلى استجابات مختلفة الاتجاه إلى العظة الموضعية.

الرقم 5
الشكل 5: انجذاب غلفاني من خلايا البروستاتا. A) وبسرعة هجرة pRNS-1-1 وخطوط PNT2 متشابهة عندما تتعرض الخلايا إلى الحقل الكهربائي.ب) ومع ذلك، أظهر خط pRNS-1-1 في اتجاهها المرتفع نحو الكاثود (جيب التمام = 0.7)، في حين أظهر خط PNT2 على اتجاهها المنخفض (جيب التمام = 0.2) في مجال كهربائي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وقد تم تحليل استجابة انجذاب غلفاني الخلية مؤشرا وظيفي مهم لكثير من المهاجرة الخلوية أو نمو عمليات 27، 28، وهنا نستخدم غرفة مصنوعة خصيصا مع سطح الزجاج لتصوير اثنين من خطوط الخلايا البروستاتا. هذه خطوط الخلايا أظهرت درجات مختلفة من انجذاب غلفاني، ونحن التكهن بأن توطين داخل الخلايا أو تفعيل البروتينات التوسط انجذاب غلفاني قد تدخلت خلال عملية توليد خطوط الخلايا الخالدة، مما أسفر عن الفرق الذي لوحظ في الاستجابة انجذاب غلفاني.

مقارنة مع تصاميم أخرى غرفة انجذاب غلفاني المحرز في أطباق ثقافة 27، 28، وهناك العديد من الفوائد التي تعود على التصميم الحالي. أولا، على سطح الزجاج هو مناسب للتصوير وساترة مع الخلايا يمكن استرجاعها بعد انجذاب غلفاني للالمناعية. في هذه الدراسة استخدمنا تضخم منخفض من الهدف 10X لمراقبة مجموعة من الخلايا. ومع ذلك، مع تساالبريد البصريات تحسين الزجاج، فمن الممكن لتصوير خلية واحدة في التكبير أعلى مع الهدف النفط 60X، لتتبع تمديد سريع وتراجع من lamellipodial في طليعة من الخلايا 17، أو تتبع الخلايا المسمى مع البروتينات الفلورية. ثانيا، يمكن أن يتم تعديل سطح الزجاج مع الطلاء البروتين مصفوفة 10، 12 أو منقوشة مع قنوات الدقيقة. العلاجات الكيميائية ممكنة إلى ما قبل علاج الخلايا قبل التصوير 29 أيضا. ليس مطلوبا مصفوفة طلاء للخطوط الخلايا البروستاتا المستخدمة هنا، وطلاء المصفوفة هو من نوع يعتمد الخلية. على سبيل المثال، مطلوب الكولاجين I طلاء للانجذاب غلفاني من الخلايا الكيراتينية الإنسان 30، ولكن المطلوب laminin طلاء للانجذاب غلفاني الخلايا الجذعية العصبية البشرية 31. اختبرنا انجذاب غلفاني القرنية البشري على الكولاجين I، الكولاجين IV، فبرونيكتين، وlaminin. البروتينات مصفوفة مختلفة غيرت سرعة الهجرة الخلية، ولكن لم تتغير migrati المهبطي على في انجذاب غلفاني 29. ثالثا، الأقطاب البلاتين المعدلة هي خاملة في الحقل الكهربائي. مقارنة مع أقطاب الفضة المستخدمة في طرق أخرى انجذاب غلفاني 27، وأنها لا تتحلل أو إطلاق ايونات المعادن إلى المتوسطة، مما يقلل من سمية الخلايا في انجذاب غلفاني. الرابع، ونحن قد تغيير فترات الإطار اسر، الذي يساعدنا على مراقبة الهجرة الخلية إما سريعة أو بطيئة. يوفر المجهر بمحركات أيضا الفرصة لاكتساب الأفلام متعددة من مناطق مختلفة في غرفة واحدة. تجربة السيطرة من دون الحقل الكهربائي تطبيقها مهمة لتحديد ما إذا كان الحقل الكهربائي يغير سرعة المهاجرة من الخلايا.

ومع ذلك، فإن غرف انجذاب غلفاني الحالية تقتصر على تصوير خلية الهجرة لمدة تصل إلى 4 ساعات بسبب صغر حجم المتوسطة في الخزانات. مع نسخة مكبرة من تصميم غرفة، سيكون من الممكن لتصوير الخلايا لفترة أطول من الزمن.

ve_content "> بعض المشاكل المحتملة في طريقة ما يلي: 1) الخلايا قد يموت خلال الجمعية غرفة إذا أصبحت المجفف لأنه ليس هناك كمية صغيرة جدا من المتوسطة في الغرفة (400 ميكرولتر)، فمن المهم تجنب احتباس الهواء فقاعات في غرفة وللحفاظ على بعض السائل تغطي الخلايا خلال الخطوة شطف الخلية. 2) الغرفة يمكن أن يتسرب أثناء التصوير، والذي من شأنه أن يقلل من التيار المار من خلال غرفة، وتدفق السائل في الغرفة يجب أن يتم التحقق بعناية قبل أن نقلها إلى مرحلة المجهر وأكثر عالية الشحوم فراغ تطبيقها إذا لزم الأمر. 3) ملطخة ارتفاع الشحوم فراغ قد تتداخل مع التصوير. يمكن تنظيف سطح الزجاج مع 95٪ الكحول لإزالة الشحوم. 4) الانجراف المرحلة أو أي تهجير غرف على مرحلة المجهر الآلية يمكن أن التحيز قياسات الهجرة الاتجاه. لذلك، من المهم لتأمين غرف انجذاب غلفاني مع حامل مرحلة الكافي والشريط وضع العلامات.

ntent "> وعموما، فإن طريقة انجذاب غلفاني مفيد للكشف عن اتجاهها لا يتجزأ من خلايا متحركة في حقل كهربائي التطبيقية، والتي سوف تساعدنا على مزيد من فهم الهجرة الاتجاه في الكائنات الحية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

خطوط الخلايا البروستاتا يتم توفير يرجى من قبل الدكتور لينغ يو وانغ والدكتور شينغ Jien الكونغ في مركز السرطان، وجامعة كاليفورنيا ديفيس. ويدعم هذا المشروع من قبل المعاهد الوطنية للصحة منحة انجذاب غلفاني 4R33AI080604.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells
pRNS-1-1 prostate cells Lee, et al. (1994)
PNT2 prostate cells Sigma-Aldrich 95012613-1VL Berthon, et al. (1995)
Medium and solutions
RPMI 1640 medium  Invitrogen 11875-093 warm up to 37 °C before use
Fetal Bovine Serum - Premium Atlanta Biologicals S11150 10% in PBS, warm up to 37 °C before use
Antibiotic-Antimycotic (100x) Life Technologies 15240 add 5 ml to 500 ml medium
2-propanol VWR BDH1133-5GL
PBS - - 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4 and 1.5 mM KH2PO4 in 1,000 ml of H2O, pH to 7.4 and autoclaved, warm up to 37 °C before use
0.25% Trypsin-EDTA  Invitrogen 25200-056 warm up to 37 °C before use, treat cells for 3-5 min at 37 °C
Galvanotaxis device
Galvanotaxis chambers Precision Plastics Inc, CA Custom-designed (1/4" x 2" x 3.5"), non-toxic, clear PVC chambers. Please contact the authors for the design specs.
Galvanotaxis electrodes UCD electric shop platinum coiled electrodes with flexable cords
Galvanotaxis power box Substrate Engineering, CA custom-designed DC power output with voltmeter
Microscope Cover Glass, Large, 45 x 50 mm, No. 1.5 Fisher 12-544-F
Microscope Cover Glass, small, 25 x 25 mm, No. 1 ThermoScientific 3307
Diamond point marker ThermoScientific 750
Marine grade silicon sealer, clear 3M 051135-08019
High vacuum grease Dow Corning 2021846-0807
6 ml syringe Fisher Scientific 05-561-64
Nichiryo Syringe, 1.5 ml Nichiryo SG-M
Cotton applicators Purtian Medical Products 806-WC
Qtips Johnson & Johnson 729389
Nalgene 180 PVC tubing  Nalgene 8000-9030 503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall
Bacto-Agar Difco 0140-01 make 2% agar solution
Razor Blade Personna 74-0001
Equipments and Software
Benchtop Centrifuge Eppendorf 5810R operated with an A-4-62 rotor
Cellometer Auto T4 Nexcelom Auto T4
Cellometer counting chambers Nexcelom CHT4-SD100-002 load 20 μl cell solutions to count
Culture Temp Warming plate Bel-Art Scienceware 370150000 to keep the galvanotaxis chambers at 37 °C 
Eclipse TE-2000 microscope with motorized stage and environmental chamber Nikon
Plan Fluor 10X/0.30 objective len Nikon
Retiga EX CCD camera  Qimaging Cooled CCD camara, mono-color, 12-bit
Compressed air with 5% CO2 Airgas special order
Volocity 6.3 PerkinElmer Image acquiring software
Improvision OpenLab 5.5.2 PerkinElmer Cell tracking software and customized to measure migration angles
FileMaker Pro Advanced, 8.0 FileMaker
Microsoft Excel 2008 for Mac Microsoft

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe. Nat Protoc. 2, (3), 661-669 (2007).
  2. Cao, L., et al. Endogenous electric currents might guide rostral migration of neuroblasts. EMBO Rep. 14, (2), 184-190 (2013).
  3. Hotary, K. B., Robinson, K. R. Endogenous electrical currents and voltage gradients in Xenopus embryos and the consequences of their disruption. Dev Biol. 166, (2), 789-800 (1994).
  4. Hotary, K. B., Robinson, K. R. Evidence of a role for endogenous electrical fields in chick embryo development. Development. 114, (4), 985-996 (1992).
  5. Yamashita, M. Electric axon guidance in embryonic retina: galvanotropism revisited. Biochem Biophys Res Commun. 431, (2), 280-283 (2013).
  6. Wood, M. D., Willits, R. K. Applied electric field enhances DRG neurite growth: influence of stimulation media, surface coating and growth supplements. J Neural Eng. 6, (4), 046003 (2009).
  7. Kucerova, R., et al. The role of electrical signals in murine corneal wound re-epithelialization. J Cell Physiol. 226, (6), 1544-1553 (2011).
  8. Sillman, A. L., Quang, D. M., Farboud, B., Fang, K. S., Nuccitelli, R., Isseroff, R. R. Human Dermal fibroblasts do not exhibit directional migration on collagen I in direct-current electric fields of physiological strength. Exp Dermatol. 12, (4), 396-402 (2003).
  9. Allen, G. M., Mogilner, A., Theriot, J. A. Electrophoresis of cellular membrane components creates the directional cue guiding keratocyte galvanotaxis. Curr Biol. 23, (7), 560-568 (2013).
  10. Nishimura, K. Y., Isseroff, R. R., Nuccitelli, R. Human keratinocytes migrate to the negative pole in direct current electric fields comparable to those measured in mammalian wounds. J Cell Sci. 109, (1), 199-207 (1996).
  11. Farboud, B., Nuccitelli, R., Schwab, I. R., Isseroff, R. R. DC electric fields induce rapid directional migration in cultured human corneal epithelial cells. Exp Eye Res. 70, (5), 667-673 (2000).
  12. Fang, K. S., Ionides, E., Oster, G., Nuccitelli, R., Isseroff, R. R. Epidermal growth factor receptor relocalization and kinase activity are necessary for directional migration of keratinocytes in DC electric fields. J Cell Sci. 112, (12), 1967-1978 (1999).
  13. Li, J., et al. Activated T lymphocytes migrate toward the cathode of DC electric fields in microfluidic devices. Lab Chip. 11, (7), 1298-1304 (2011).
  14. Meng, X., Arocena, M., Penninger, J., Gage, F. H., Zhao, M., Song, B. PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors. Exp Neurol. 227, (1), 210-217 (2011).
  15. Wu, D., Ma, X., Lin, F. DC Electric Fields Direct Breast Cancer Cell Migration, Induce EGFR Polarization, and Increase the Intracellular Level of Calcium Ions. Cell Biochem Biophys. 67, (3), 1115-1125 (2013).
  16. Martin-Granados, C., et al. A role for PP1/NIPP1 in steering migration of human cancer cells. PLoS One. 7, (7), 40769 (2012).
  17. Yang, H. Y., Charles, R. P., Hummler, E., Baines, D. L., Isseroff, R. R. The epithelial sodium channel mediates the directionality of galvanotaxis in human keratinocytes. J Cell Sci. 126, (9), 1942-1951 (2013).
  18. Zhao, M., et al. Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH kinase-gamma and PTEN. Nature. 442, (7101), 457-460 (2006).
  19. Shanley, L. J., Walczysko, P., Bain, M., MacEwan, D. J., Zhao, M. Influx of extracellular Ca2+ is necessary for electrotaxis in Dictyostelium. J Cell Sci. 119, (22), 4741-4748 (2006).
  20. Zhao, M., Agius-Fernandez, A., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Directed migration of corneal epithelial sheets in physiological electric fields. Invest Ophthalmol Vis Sci. 37, (13), 2548-2558 (1996).
  21. Peng, H. B., Jaffe, L. F. Polarization of fucoid eggs by steady electrical fields. Dev Biol. 53, (2), 277-284 (1976).
  22. Lee, M., et al. Characterization of adult human prostatic epithelial-cells immortalized by polybrene-induced DNA transfection with a plasmid containing an origin-defective sv40-genome. Int J Oncol. 4, (4), 821-830 (1994).
  23. Berthon, P., Cussenot, O., Hopwood, L., Leduc, A., Maitland, N. Functional expression of sv40 in normal human prostatic epithelial and fibroblastic cells - differentiation pattern of non-tumorigenic cell-lines. Int J Oncol. 6, (2), 333-343 (1995).
  24. Aurich-Costa, J., Vannier, A., Grégoire, E., Nowak, F., Cherif, D. IPM-FISH, a new M-FISH approach using IRS-PCR painting probes: application to the analysis of seven human prostate cell lines. Genes Chromosomes Cancer. 30, (2), 143-160 (2001).
  25. Tyson, D. R., Inokuchi, J., Tsunoda, T., Lau, A., Ornstein, D. K. Culture requirements of prostatic epithelial cell lines for acinar morphogenesis and lumen formation in vitro: role of extracellular calcium. Prostate. 67, (15), 1601-1613 (2007).
  26. Lang, S. H., Sharrard, R. M., Stark, M., Villette, J. M., Maitland, N. J. Prostate epithelial cell lines form spheroids with evidence of glandular differentiation in three-dimensional Matrigel cultures. Br J Cancer. 85, (4), 590-599 (2001).
  27. Babona-Pilipos, R., Popovic, M. R., Morshead, C. M. A galvanotaxis assay for analysis of neural precursor cell migration kinetics in an externally applied direct current electric field. J Vis Exp. (68), (2012).
  28. Meng, X., et al. Electric field-controlled directed migration of neural progenitor cells in 2D and 3D environments. J Vis Exp. (60), (2012).
  29. Pullar, C. E., Isseroff, R. R. Cyclic AMP mediates keratinocyte directional migration in an electric field. J Cell Sci. 118, (9), 2023-2034 (2005).
  30. Sheridan, D. M., Isseroff, R. R., Nuccitelli, R. Imposition of a physiologic DC electric field alters the migratory response of human keratinocytes on extracellular matrix molecules. J Invest Dermatol. 106, (4), 642-646 (1996).
  31. Feng, J. F., et al. Guided migration of neural stem cells derived from human embryonic stem cells by an electric field. Stem Cells. 30, (2), 349-355 (2012).
  32. Mukerjee, E. V., Isseroff, R. R., Nuccitelli, R., Collins, S. D., Smith, R. L. Microneedle array for measuring wound generated electric fields. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 1, 4326-4328 (2006).
  33. Nuccitelli, R., Nuccitelli, P., Li, C., Narsing, S., Pariser, D. M., Lui, K. The electric field near human skin wounds declines with age and provides a noninvasive indicator of wound healing. Wound Rep. and Reg. 19, 645-655 (2011).
الاستفادة من تصميم مخصص انجذاب غلفاني غرف لدراسة الاتجاه الهجرة من خلايا البروستاتا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, H. y., Dinh La, T., Isseroff, R. R. Utilizing Custom-designed Galvanotaxis Chambers to Study Directional Migration of Prostate Cells. J. Vis. Exp. (94), e51973, doi:10.3791/51973 (2014).More

Yang, H. y., Dinh La, T., Isseroff, R. R. Utilizing Custom-designed Galvanotaxis Chambers to Study Directional Migration of Prostate Cells. J. Vis. Exp. (94), e51973, doi:10.3791/51973 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter