Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Utnytte Spesialdesignede Galvanotaxis Chambers å studere Retnings Migrasjon av prostata celler

doi: 10.3791/51973 Published: December 7, 2014

Abstract

Den fysiologiske elektriske feltet serverer spesifikke biologiske funksjoner, som for eksempel å dirigere celle migrasjon i embryo utvikling, nevronale utvekst og epitel sårtilheling. Påføring av en likestrøm elektrisk felt til dyrkede celler in vitro induserer retningscellemigrering eller galvanotaxis. Den to-dimensjonale galvanotaxis metode demonstrerer vi her er modifisert med skreddersydd poly (vinylklorid) (PVC) kammer, glassoverflaten, platinaelektroder, og bruk av en motorisert stadium hvor cellene er avbildet. PVC kamre og platina elektroder viser lav cytotoksisitet og er rimelig og re-brukbar. Glassoverflaten og den motoriserte objektbord forbedre kvaliteten av bildene og tillate mulige modifikasjoner av glassoverflaten og behandlinger til cellene. Vi filmet galvanotaxis av to ikke-tumorigene, SV40-udødelig prostata cellelinjer, pRNS-1-1 og PNT2. Disse to cellelinjer viser lignende migrasjons hastigheter og begge migrere motkatoden, men de viser en annen grad av retnings i galvanotaxis. Resultatene oppnådd via denne protokollen resultatene tyder på at pRNS-1-1 og PNT2 cellelinjer kan ha ulike iboende egenskaper som styrer sine retnings trekkende svar.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Endogene elektriske felt blir detektert i forskjellige vev, slik som hud 1, 32, 33 og hjerne 2. Den fysiologiske elektriske felt tjener spesifikke biologiske funksjoner, inkludert dirigere embryoutvikling 3, 4, føring av utvekst av neuronal prosesser 5, 6 og fremme epitelial og hornhinnen til lukking av sår 1, 7. In vitro anvendelse av et likestrøms elektrisk felt til dyrkede celler ligner den fysiologiske elektrisk felt og induserer retningscellemigrasjon, eller galvanotaxis. Galvanotaxis har blitt studert i fibroblaster 8, fisk keratinocytter 9, menneskelig epitel og hornhinnen keratinocytter 10-12, lymfocytter 13, neuroblasts to, og nevrale stamceller 14. Når de utsettes for den påtrykte felt, de fleste undersøkte celler migrerer retnings mot katodisk (-) pol. Likevel, flere kreftceller, inkludert svært metastatiskhumane brystcancer-celler og den humane prostatacancercellelinje PC-3M, går til anodisk (+) pol 15, 16. Flere mekanismer er foreslått å mediere galvanotaxis eller for å forklare evnen til cellene for å avføle det elektriske felt, inkludert aktivering av EGF-reseptorer 12, epithelial natriumkanal 17, PI3K og PTEN 18, og frigjøring av kalsiumioner 15, 19. Mekanismen er ennå ikke fullt ut forstått, og det er mulig at flere signalveier er involvert i galvanotaxis.

Den to-dimensjonale galvanotaxis metode demonstrerer vi her er nyttig for å karakterisere retnings migrasjon av fastsittende, bevegelige celler, enten for å overvåke enkeltcellemigrering 10, 12, 17 eller migrering av en plate av konfluente celler 18, 20. Denne teknikken er modifisert fra Peng og Jaffe 21, og Nishimura et al. 10 med skreddersydde, klare PVC kamre, med avtagbart coverslips muliggjør enkel celle gjenfinning etter galvanotaxis for sekundær analyse, for eksempel immuno-fluorescens bildebehandling. Glassoverflaten av galvanotaxis kamrene er optisk-kompatibel, noe som gjør det mulig for filming ved høy forstørrelse og med fluoresceinmerkede celler. Den gjør også eksperimentell design med modifisering av glassoverflaten, for eksempel endring av overflatebelegg eller avgifter. Avstandsstykker laget av No. en dekkglass brukes i kamrene for å redusere strømflyten over cellene; derfor joule-varme, som er proporsjonal med kvadratet av strømmen som føres, ikke ville bli overopphetet cellene i løpet av eksperimentet. Forbindelses agar broer forhindre direkte kontakt av elektroder med cellene og hindre endring av pH i mediet eller ion konsentrasjon under galvanotaxis.

To ikke-tumorigene humane prostatacellelinjer ble undersøkt for sin respons galvanotaxis i denne studien. De pRNS-1-1 22 og PNT2 23 er både SV40-udødeliggjort, vekstfaktoravhengige cellelinjer som uttrykker de epiteliale markører cytokeratin 5, 8, 18 og 19 med lav eller ingen ekspresjon av prostata spesifikt antigen (PSA). Begge cellelinjer opprettholde polygonal morfologi av normale epitelceller, men kromosom abnormalitet ble observert i karyotypering 22, 24. Selv pRNS-1-1 og PNT2 dele lignende adferd i de fleste eksperimenter, de viser forskjeller i dannelsen av acinar struktur og i galvanotaxis. På en 3-D matrise, Matrigel, de pRNS-1-1 cellene danner hul acinar strukturer med lumen likner den normale vevet prostatakjertelen 25. Imidlertid PNT2 cellene danne faste kuler uten hulrom eller polarisert epitel 26. De pRNS-1-1 celler også demonstrere en høyere galvanotactic respons enn PNT2 i den aktuelle studien. Korrelasjonen mellom dannelsen av acinar struktur og galvanotaxis i pRNS-1-1 tyder på at de galvanotactic signaler kan spille en rolle i organiseringen av prostate kjertel vev bevegelser i respons til endogene elektriske felt, og gir ytterligere egenskaper for å diskriminere mellom disse to cellelinjer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Dyrking Prostata Cells

  1. Kultur de pRNS-1-1 og PNT2 prostata celler på 100 mm kultur retter i RPMI 1640 medium supplert med 10% FBS og Antibiotika fungal ved 37 ° C med 5% CO 2. Oppdatere dyrkingsmediumet hver dag frem til cellene nå 80% confluency for galvanotaxis eksperimenter.

2. Montere Galvanotaxis Chambers

  1. Montering bunn kamre
    1. Tørk en plast galvanotaxis kammer med 2-propanol. Påfør marine grade silisium sealer rundt sirkulære åpninger på undersiden av et kammer med en sprøyte og legge ved en stor dekkglass (figur 1). Bruk baksiden av en bomulls applikator å presse ned dekkglass og tørke av overflødig lim med bomullspinner. De sirkulære åpninger tillate mediet og elektrisk strøm til å flyte i løpet av de celler som ligger mellom de to indre mellomreservoar.
    2. Skjær et lite dekkglass for å gjøre 6 mm x 25 mm avstandsstykker med en diamantspiss markør.
    3. Vend kammeret. Anvende to striper av silikon lim med en sprøyte, og / eller en metallspatel for å lage en 10 mm x 25 mm kanalflate for cellebinding mellom de to sirkulære åpninger på den nederste glassplate. Lim to biter av glass spacer mellom de to sirkulære åpninger. Bruk baksiden av bomull applikatorer å presse ned avstandsstykkene og tørk av overflødig lim med bomullspinner og / eller tannpirkere.
    4. Tørk det kammer i 24 timer inntil silisium limet er herdet. Suge kammeret i destillert vann over natten for å fjerne eddiksyren rester fra lim. Tørk kammeret for umiddelbar bruk eller oppbevar kammer for senere bruk i en ren beholder.
      Figur 1
      Figur 1: Montering av bunnen galvanotaxis kammeret. A) En stor dekkglass er festet til bunnen av en ren kammer. B) Two stykker av glassavstandsstykkene er limt mellom de to sirkulære åpninger for å skape en 10 mm x 25 mm kanal for cellene å feste.
  2. Seeding celler på galvanotaxis kamre
    1. Klargjør kreve antall galvanotaxis kamre som trengs for forsøket. Hver cellelinje eller behandling krever en enkelt galvanotaxis kammer. Tørk av galvanotaxis kamre med 2-propanol. Vask kamrene med steril PBS tre ganger, og kontrollere væskestrømmen mellom de to sirkulære åpninger i kamrene.
    2. Omslutter kamrene i sterile cellekulturskåler og la dem ekvilibrere ved 37 ° C i 15 min. Ta av prostata celler fra deres kultur rett med 5 ml 0,25% Trypsin-EDTA ved 37 ° C i 5 min. Nøytralisere trypsin-EDTA med 5 ml 10% FBS i PBS.
    3. Overfør cellene i 15 ml rør og sentrifuger cellene i 5 min ved 200 x g, 37 ° C. Aspirer supernatanten og re-suspendere cellene i 1 ml kulturmedium.
    4. Ta 20 μl celleløsning for å laste et tellekammer, og beregne celletallet. Juster cellekonsentrasjonen til 8 x 10 4 celle / ml med kulturmedium.
    5. Ta galvanotaxis kamre ut av 37 ° C inkubator. Frø 350 ul av cellesuspensjonen på hvert kammer.
    6. Cellene inkuberes i kamrene over natten i dyrkningsskål med våt Kimwipe eller i et fuktighetskammer i inkubator ved 37 ° C med 5% CO2.

Figur 2
Fig. 2: poding av cellene til kammeret Bunnkammeret er tørket og renset A) Prostata celler blir trypsinert, telles og overføres til kammeret og inkubert over natten B) En øvre dekkglass er festet for å forsegle kammeret før filming...

  1. Assembling de beste kamre
    1. Monter det øvre kammeret før filming. Mikroskopet kan bare romme imaging en enkelt galvanotaxis kammer på en gang. Varm opp 10 ml dyrkningsmedium ved 37 ° C for hver galvanotaxis kammer. Overføre en galvanotaxis kammeret fra inkubatorene til en 37 ° C varmeplate.
    2. Rens cellene med kulturmedium for å fjerne de ufestede celler. La 400 ul av mediet i kammeret. Bruk en sprøyte for å søke høyt vakuum fett på toppen av begge glassavstandsstykker.
    3. Legg en liten dekkglass å forsegle kammeret. Trykk forsiktig ned på dekkglass med baksiden av en bomulls applikator. Tørk av overflødig medium med bomullspinner.
    4. Tørk glassoverflaten og anvende høyvakuum fett for å tette gapet mellom dekkglass og kammeret. Bruk en metallspatel for å spre fett. Tilsett 4 ml av kulturmediet med de indre reservoarer og kontrollere væskestrømmen mellom reservoarene.
  2. Gjør agarbroer
    1. Skjær et par 2 tommer lang PVC rør (503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall), snu og sette dem inn i et 100 ml begerglass.
    2. Måle 200 mg Bacto-agar og legge den i en 50 ml flaske med 10 ml kultur medium for å lage 2% agar gel. Mikrobølgeovn i 30 sekunder. Laste agar gel til plastrør med en overføring pipette. La agar broer ved romtemperatur i 10 minutter for å størkne agar.
    3. Tilsett 2 ml kulturmedium til de ytre reservoarer av galvanotaxis kammeret. Sett agar broer til de indre og ytre mellom reservoarer for å lede strømmen.

Figur 3
Fig. 3: filming cellene på kammeret Et diagram for å demonstrere den endelige montering av galvanotaxis kammeret. Kammeret er fullstendig forseglet med høyvakuum fett. Medium ble tilsatt to fylle reservoarene, og to agar broene settes inn i kammeret. Deretter galvanotaxis kammeret blir overført til objektbordet, og elektrodene er koblet til å anvende det elektriske felt. Sideriss av den sammenstilte galvanotaxis kammeret er vist for å vise at den elektriske strøm som flyter gjennom cellene gjennom agar broer og mellomrommet mellom dekkglasset.

3. Time-lapse Imaging

  1. Slå på miljøkammeret til 37 ° C med 5% CO2 i den sirkulerende luft i 2 timer før avbildning.
  2. Slå på mikroskopet og initiere den bilde anskaffe programvare. Kalibrere mikroskop scenen og velg 10X objektiv.
  3. Overfør galvanotaxis kamrene til mikroskopet scenen, sikre kammeret med tape og fokus på cellene. Sett i galvanotaxis elektroder til de ytre reservoarer med katoden på høyre side. Fest wire og elektrodene med tape.
  4. Slå på strømmen box å påføre et elektrisk felt til kammeret. Måle utgangsspenningen med voltmeteret over kammeret for å nå 2,5 volt for den 25 mm lange kammer (100 mV / mm). Opprettfeltstyrken under forsøket ved å justere utgangsstrømmen.
  5. Velg 10 poeng over kammeret for å filme i programvaren til å generere ti time-lapse filmer. Sett opp oppkjøps forholdene på 10-minutters intervaller for 2 timer.
  6. Begynne å filme og justere utgangsstrømmen som trengs.
  7. Ved slutten av eksperimentet, fjerner kammeret fra scenen og fikser cellene med 95% alkohol. Bryte åpne kammeret med et barberblad for å rense og gjenbruke det.

4. Kvantifisering av Galvanotaxis

  1. Rotere time-lapse filmer og re-orientere katoden til toppen av bildene. Eksportere filmer til celle sporing programvare.
  2. Manuelt spore (x, y) posisjon på 10-20 celler ved hvert tids punkt fra hver film (figur 4 A, B).Migrasjons avstander og vinkler i forhold til nord-sør retning, samme retning av det elektriske feltet, vil bli beregnet i cellen sporing programvare (Figur 4C).
    MERK: Den gjennomsnittlige migrasjon hastighet er konvertert fra den totale migrasjon distanse og total filming tid. Direktivitet er konvertert fra vinklene til cosinus verdi. Hvis cellene migrerer med tilfeldig retnings, vil gjennomsnittet av netto cosinus være nær null. Hvis cellene migrerer direkte mot katoden, vil cosinus-verdien være en. Hvis cellene migrerer direkte mot anoden, vil cosinus-verdien være -1.

Figur 4
Figur 4: Cell tracking for å måle retnings A) Overlegg av sporingslinjer med celle bilder.. De (x, y) posisjon av cellene er manually spores i time-lapse filmer. . Hvis cellene migrerer tilfeldig, er den gjennomsnittlige cosinus nær null B) Dersom cellene migrerer mot katoden eller anoden, er verdien av det gjennomsnittlige cosinus nær + (katode) eller -. (Anode) 1.0 C ) Den retnings presenteres av cosinus verdien, som er konvertert fra migrasjons vinkler (θ). Cosinus (θ) er lik forholdet mellom avstanden a (migrerings avstand) til avstanden b (avstanden anslått til retningen av det elektriske felt).

  1. Lagre målingene. Importere dataene til en database applikasjon for å beregne de samlede resultatene.
  2. Eksportere den kombinerte data for gjennomsnittlig migrasjonshastighet og gjennomsnittlig cosinus verdien til et regneark å plotte søylediagram (figur 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

To linjer med prostata celler (pRNS-1-1 og PNT2) ble undersøkt med denne metoden. Celler i begge linjer migrere ved lignende hastigheter på 1,0 +/- 0,3 mikron / min i løpet av 2 timer (figur 5A). Imidlertid er den retnings til det elektriske felt på 0,7 +/- 0,3 for pRNS-1-1-linjen, og 0,2 +/- 0,8 for PNT2 linjen (figur 5B). Resultatene viser en betydelig forskjell i galvanotaxis av disse to cellelinjer (p <0,01, ble 100 celler spores), noe som tyder på at de har forskjellige cellulære signal mekanismer som resulterer i forskjellige retningsresponser til posisjonsangivelser.

Figur 5
Figur 5: Galvanotaxis av prostata celler. A) De vandringshastigheter pRNS-1-1 og PNT2 linjer er like når cellene eksponeres for det elektriske feltet.B) Imidlertid pRNS-1-1 linje viste en høy direktivitet mot katoden (cosinus = 0,7), mens PNT2 linje viste lav direktivitet (cosinus = 0,2) i det elektriske felt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Analysen av en celles galvanotaxis responsen har vært en viktig funksjonell indikator for mange mobil trekkfugl eller vekstprosesser 27, 28. Her bruker vi en skreddersydd kammer med glassoverflate for å filme to prostata cellelinjer. Disse cellelinjene viste forskjellige grader av galvanotaxis, og vi spekulerer i at den intracellulære lokalisering eller aktivering av galvanotaxis-medierende proteiner kan bli forstyrret i løpet av prosessen med å generere de udødelige cellelinjer, noe som resulterer i den observerte forskjellen i galvanotaxis respons.

Sammenlignet med andre galvanotaxis kammer design laget i kultur retter 27, 28, er det flere fordeler til dagens design. Først, er glassflaten egnet for bildebehandling og dekkglass med celler kan hentes etter galvanotaxis for farging. I denne studien ble det benyttet en lav forstørrelse på 10X objektiv for å overvåke en gruppe av celler. Men med these forbedret glass optikk, er det mulig å filme en enkelt celle ved høyere forstørrelse med et 60X objektiv olje, for relativ rask utvidelse og tilbaketrekning av lamellipodial ved forkanten av cellene 17, eller sporing celler merket med fluorescerende proteiner. For det andre kan glassflaten endres med matrise proteinbelegg 10, 12 eller mønstret med mikro-kanaler. Kjemiske behandlinger er også mulig å fore behandle cellene før filming 29. Matrix belegget er ikke nødvendig for prostata cellelinjer som brukes her, og matrisebelegget er celletype-avhengig. For eksempel er kollagen I belegg som kreves for galvanotaxis av humane keratinocytter 30, men laminin belegg er nødvendig for galvanotaxis av humane neuralstamceller 31. Vi testet human keratinocytt galvanotaxis på collagen I, collagen IV, fibronektin og laminin. Ulike matriksproteiner endret cellemigrasjon fart, men ikke endre katodisk migrati på i galvanotaxis 29. For det tredje, modifisert platinaelektroder er inert i det elektriske felt. Sammenlignet med sølvelektroder som brukes i andre fremgangsmåter galvanotaxis 27, har de ikke brytes ned eller frigjøre metallioner i mediet, noe som reduserer cytotoksisitet i galvanotaxis. Fjerde, kan vi endre intervaller på ramme fange, som hjelper oss til å overvåke enten rask eller langsom celle migrasjon. Den motoriserte mikroskop gir også mulighet til å tilegne flere filmer fra ulike områder i ett kammer. Et kontrollforsøk uten at det påtrykte elektriske felt som er viktig for å bestemme om det elektriske felt forandrer vandringshastigheten av cellene.

Imidlertid er de nåværende galvanotaxis kamre begrenset til filming cellemigrering i opp til 4 timer, på grunn av det lille volum av medium i reservoarene. Med en forstørret versjon av kammer konstruksjon, ville det være mulig å filme celler i en lengre tidsperiode.

ve_content "> Noen potensielle problemer i fremgangsmåten omfatter:. 1) cellene kan dø i løpet av kammerenheten dersom de blir uttørket Siden det er et meget lite volum av mediet i kammeret (400 ul), er det viktig å unngå overlapping luft bobler i kammeret og for å holde en viss væske som dekker cellene i celleskylletrinnet. 2) Kammeret kan lekke under avbildning, noe som ville redusere den strøm som passerer gjennom kammeret. Den væskestrøm i kammeret bør være nøye kontrollert før den er overført til objektbordet og mer høyvakuum fett anvendes hvis nødvendig. 3) er gnidd høyvakuum fett kan forstyrre filming. Glassflaten kan vaskes med 95% alkohol for å fjerne fett. 4) Trinn drift eller forskyvning av kamrene i en motorisert objektbord kunne forspenne målinger av retnings migrasjon. Derfor er det viktig å sikre galvanotaxis kamre med tilstrekkelig stadium holderen og merketape.

ntent "> Totalt sett er galvanotaxis metoden nyttig for å avsløre den iboende retningen på bevegelige celler i en anvendt elektrisk felt, som vil hjelpe oss til videre forstå retnings migrasjon i organismer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

De prostata cellelinjer er vennlig levert av Dr. Ling-Yu Wang og Dr. Hsing-Jien Kung ved Cancer Center, UC Davis. Dette prosjektet er støttet av NIH galvanotaxis stipend 4R33AI080604.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells
pRNS-1-1 prostate cells Lee, et al. (1994)
PNT2 prostate cells Sigma-Aldrich 95012613-1VL Berthon, et al. (1995)
Medium and solutions
RPMI 1640 medium  Invitrogen 11875-093 warm up to 37 °C before use
Fetal Bovine Serum - Premium Atlanta Biologicals S11150 10% in PBS, warm up to 37 °C before use
Antibiotic-Antimycotic (100x) Life Technologies 15240 add 5 ml to 500 ml medium
2-propanol VWR BDH1133-5GL
PBS - - 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4 and 1.5 mM KH2PO4 in 1,000 ml of H2O, pH to 7.4 and autoclaved, warm up to 37 °C before use
0.25% Trypsin-EDTA  Invitrogen 25200-056 warm up to 37 °C before use, treat cells for 3-5 min at 37 °C
Galvanotaxis device
Galvanotaxis chambers Precision Plastics Inc, CA Custom-designed (1/4" x 2" x 3.5"), non-toxic, clear PVC chambers. Please contact the authors for the design specs.
Galvanotaxis electrodes UCD electric shop platinum coiled electrodes with flexable cords
Galvanotaxis power box Substrate Engineering, CA custom-designed DC power output with voltmeter
Microscope Cover Glass, Large, 45 x 50 mm, No. 1.5 Fisher 12-544-F
Microscope Cover Glass, small, 25 x 25 mm, No. 1 ThermoScientific 3307
Diamond point marker ThermoScientific 750
Marine grade silicon sealer, clear 3M 051135-08019
High vacuum grease Dow Corning 2021846-0807
6 ml syringe Fisher Scientific 05-561-64
Nichiryo Syringe, 1.5 ml Nichiryo SG-M
Cotton applicators Purtian Medical Products 806-WC
Qtips Johnson & Johnson 729389
Nalgene 180 PVC tubing  Nalgene 8000-9030 503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall
Bacto-Agar Difco 0140-01 make 2% agar solution
Razor Blade Personna 74-0001
Equipments and Software
Benchtop Centrifuge Eppendorf 5810R operated with an A-4-62 rotor
Cellometer Auto T4 Nexcelom Auto T4
Cellometer counting chambers Nexcelom CHT4-SD100-002 load 20 μl cell solutions to count
Culture Temp Warming plate Bel-Art Scienceware 370150000 to keep the galvanotaxis chambers at 37 °C 
Eclipse TE-2000 microscope with motorized stage and environmental chamber Nikon
Plan Fluor 10X/0.30 objective len Nikon
Retiga EX CCD camera  Qimaging Cooled CCD camara, mono-color, 12-bit
Compressed air with 5% CO2 Airgas special order
Volocity 6.3 PerkinElmer Image acquiring software
Improvision OpenLab 5.5.2 PerkinElmer Cell tracking software and customized to measure migration angles
FileMaker Pro Advanced, 8.0 FileMaker
Microsoft Excel 2008 for Mac Microsoft

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe. Nat Protoc. 2, (3), 661-669 (2007).
  2. Cao, L., et al. Endogenous electric currents might guide rostral migration of neuroblasts. EMBO Rep. 14, (2), 184-190 (2013).
  3. Hotary, K. B., Robinson, K. R. Endogenous electrical currents and voltage gradients in Xenopus embryos and the consequences of their disruption. Dev Biol. 166, (2), 789-800 (1994).
  4. Hotary, K. B., Robinson, K. R. Evidence of a role for endogenous electrical fields in chick embryo development. Development. 114, (4), 985-996 (1992).
  5. Yamashita, M. Electric axon guidance in embryonic retina: galvanotropism revisited. Biochem Biophys Res Commun. 431, (2), 280-283 (2013).
  6. Wood, M. D., Willits, R. K. Applied electric field enhances DRG neurite growth: influence of stimulation media, surface coating and growth supplements. J Neural Eng. 6, (4), 046003 (2009).
  7. Kucerova, R., et al. The role of electrical signals in murine corneal wound re-epithelialization. J Cell Physiol. 226, (6), 1544-1553 (2011).
  8. Sillman, A. L., Quang, D. M., Farboud, B., Fang, K. S., Nuccitelli, R., Isseroff, R. R. Human Dermal fibroblasts do not exhibit directional migration on collagen I in direct-current electric fields of physiological strength. Exp Dermatol. 12, (4), 396-402 (2003).
  9. Allen, G. M., Mogilner, A., Theriot, J. A. Electrophoresis of cellular membrane components creates the directional cue guiding keratocyte galvanotaxis. Curr Biol. 23, (7), 560-568 (2013).
  10. Nishimura, K. Y., Isseroff, R. R., Nuccitelli, R. Human keratinocytes migrate to the negative pole in direct current electric fields comparable to those measured in mammalian wounds. J Cell Sci. 109, (1), 199-207 (1996).
  11. Farboud, B., Nuccitelli, R., Schwab, I. R., Isseroff, R. R. DC electric fields induce rapid directional migration in cultured human corneal epithelial cells. Exp Eye Res. 70, (5), 667-673 (2000).
  12. Fang, K. S., Ionides, E., Oster, G., Nuccitelli, R., Isseroff, R. R. Epidermal growth factor receptor relocalization and kinase activity are necessary for directional migration of keratinocytes in DC electric fields. J Cell Sci. 112, (12), 1967-1978 (1999).
  13. Li, J., et al. Activated T lymphocytes migrate toward the cathode of DC electric fields in microfluidic devices. Lab Chip. 11, (7), 1298-1304 (2011).
  14. Meng, X., Arocena, M., Penninger, J., Gage, F. H., Zhao, M., Song, B. PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors. Exp Neurol. 227, (1), 210-217 (2011).
  15. Wu, D., Ma, X., Lin, F. DC Electric Fields Direct Breast Cancer Cell Migration, Induce EGFR Polarization, and Increase the Intracellular Level of Calcium Ions. Cell Biochem Biophys. 67, (3), 1115-1125 (2013).
  16. Martin-Granados, C., et al. A role for PP1/NIPP1 in steering migration of human cancer cells. PLoS One. 7, (7), 40769 (2012).
  17. Yang, H. Y., Charles, R. P., Hummler, E., Baines, D. L., Isseroff, R. R. The epithelial sodium channel mediates the directionality of galvanotaxis in human keratinocytes. J Cell Sci. 126, (9), 1942-1951 (2013).
  18. Zhao, M., et al. Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH kinase-gamma and PTEN. Nature. 442, (7101), 457-460 (2006).
  19. Shanley, L. J., Walczysko, P., Bain, M., MacEwan, D. J., Zhao, M. Influx of extracellular Ca2+ is necessary for electrotaxis in Dictyostelium. J Cell Sci. 119, (22), 4741-4748 (2006).
  20. Zhao, M., Agius-Fernandez, A., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Directed migration of corneal epithelial sheets in physiological electric fields. Invest Ophthalmol Vis Sci. 37, (13), 2548-2558 (1996).
  21. Peng, H. B., Jaffe, L. F. Polarization of fucoid eggs by steady electrical fields. Dev Biol. 53, (2), 277-284 (1976).
  22. Lee, M., et al. Characterization of adult human prostatic epithelial-cells immortalized by polybrene-induced DNA transfection with a plasmid containing an origin-defective sv40-genome. Int J Oncol. 4, (4), 821-830 (1994).
  23. Berthon, P., Cussenot, O., Hopwood, L., Leduc, A., Maitland, N. Functional expression of sv40 in normal human prostatic epithelial and fibroblastic cells - differentiation pattern of non-tumorigenic cell-lines. Int J Oncol. 6, (2), 333-343 (1995).
  24. Aurich-Costa, J., Vannier, A., Grégoire, E., Nowak, F., Cherif, D. IPM-FISH, a new M-FISH approach using IRS-PCR painting probes: application to the analysis of seven human prostate cell lines. Genes Chromosomes Cancer. 30, (2), 143-160 (2001).
  25. Tyson, D. R., Inokuchi, J., Tsunoda, T., Lau, A., Ornstein, D. K. Culture requirements of prostatic epithelial cell lines for acinar morphogenesis and lumen formation in vitro: role of extracellular calcium. Prostate. 67, (15), 1601-1613 (2007).
  26. Lang, S. H., Sharrard, R. M., Stark, M., Villette, J. M., Maitland, N. J. Prostate epithelial cell lines form spheroids with evidence of glandular differentiation in three-dimensional Matrigel cultures. Br J Cancer. 85, (4), 590-599 (2001).
  27. Babona-Pilipos, R., Popovic, M. R., Morshead, C. M. A galvanotaxis assay for analysis of neural precursor cell migration kinetics in an externally applied direct current electric field. J Vis Exp. (68), (2012).
  28. Meng, X., et al. Electric field-controlled directed migration of neural progenitor cells in 2D and 3D environments. J Vis Exp. (60), (2012).
  29. Pullar, C. E., Isseroff, R. R. Cyclic AMP mediates keratinocyte directional migration in an electric field. J Cell Sci. 118, (9), 2023-2034 (2005).
  30. Sheridan, D. M., Isseroff, R. R., Nuccitelli, R. Imposition of a physiologic DC electric field alters the migratory response of human keratinocytes on extracellular matrix molecules. J Invest Dermatol. 106, (4), 642-646 (1996).
  31. Feng, J. F., et al. Guided migration of neural stem cells derived from human embryonic stem cells by an electric field. Stem Cells. 30, (2), 349-355 (2012).
  32. Mukerjee, E. V., Isseroff, R. R., Nuccitelli, R., Collins, S. D., Smith, R. L. Microneedle array for measuring wound generated electric fields. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 1, 4326-4328 (2006).
  33. Nuccitelli, R., Nuccitelli, P., Li, C., Narsing, S., Pariser, D. M., Lui, K. The electric field near human skin wounds declines with age and provides a noninvasive indicator of wound healing. Wound Rep. and Reg. 19, 645-655 (2011).
Utnytte Spesialdesignede Galvanotaxis Chambers å studere Retnings Migrasjon av prostata celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, H. y., Dinh La, T., Isseroff, R. R. Utilizing Custom-designed Galvanotaxis Chambers to Study Directional Migration of Prostate Cells. J. Vis. Exp. (94), e51973, doi:10.3791/51973 (2014).More

Yang, H. y., Dinh La, T., Isseroff, R. R. Utilizing Custom-designed Galvanotaxis Chambers to Study Directional Migration of Prostate Cells. J. Vis. Exp. (94), e51973, doi:10.3791/51973 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter