Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Prostat Hücrelerinin Yönlü Göç Eğitim için özel tasarlanmış galvanotaksis Chambers kullanılması

doi: 10.3791/51973 Published: December 7, 2014

Abstract

fizyolojik elektrik alan gibi embriyo gelişimi, nöronal akıbet ve epitel yara iyileşmesinde hücre göçü yönetmenlik gibi belirli biyolojik fonksiyonları, hizmet vermektedir. In vitro olarak kültürlenen hücrelere doğru akım elektrik alanı uygulanması yönlü hücre göçü veya galvanotaksis neden olur. Burada ortaya 2 boyutlu galvanotaksis yöntemi ölçüye poli (vinil klorür) (PVC) odaları, cam yüzeyi, platin elektrot ve hücreler, görüntülü edildiği, bir motorlu kaide kullanımı ile modifiye edilir. PVC odaları ve platin elektrotları düşük sitotoksisite gösterirler ve uygun fiyatlı ve yeniden kullanılabilir vardır. Cam yüzeyi ve motorlu mikroskop sahne görüntülerin kalitesini artırmak ve hücrelere cam yüzeyi ve tedavileri mümkün değişikliklere izin. Biz olmayan iki tümörijenik, SV40-ölümsüzleştirdi prostat hücre hatları, prns-1-1 ve PNT2 ve galvanotaksis filme. Bu iki hücre hatları benzer göç hızları göstermek ve hem de doğru göçkatot, ancak galvanotaksis yönelmişlik farklı bir derecede gösteriyor. Bu protokol ile elde edilen sonuçlar prns-1-1 ve PNT2 hücre hatları kendi yönlü göç yanıtları yöneten farklı içsel özelliklere sahip olabileceğini düşündürmektedir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Endojen elektrik alanlar, cilt 1, 32, 33 ve beyin 2 gibi çeşitli dokularda, tespit edilir. fizyolojik elektrik alanı nöron 5, 6 büyümesinin yol ve epitelyal kornea yara kapanması 1, 7 teşvik yönlendiren embriyo gelişimi 3, 4 de dahil olmak üzere, belirli bir biyolojik fonksiyonları yerine getirir,. in vitro kültürlenmiş hücrelere doğru akım elektrik alanı uygulanması taklit fizyolojik elektrik alanı ve yön hücre göçü, ya da galvanotaksis uyarmaktadır. Galvanotaksis, neuroblasts 2, ve nöronal progenitör hücreleri 14, fibroblastlar 8, balık keratinositler 9, insan epitel ve kornea keratinositler 10-12 okudu 13 lenfosit olmuştur. (-) Kutbuna uygulamalı alana maruz kaldığında, incelenen hücrelerin çoğunluğu katot doğru yönde göç. Bununla birlikte, yüksek düzeyde metastatik dahil olmak üzere çeşitli kanser hücreleri,insan göğüs kanseri hücreleri ve insan prostat kanseri hücre kuşağı PC-3M, anodal (+) kutup 15, 16 hareket eder. Çeşitli mekanizmalar galvanotaksis aracılık aktivasyonu da dahil olmak üzere elektrik alanını duymak üzere hücrelerin yeteneği, açıklamak için öne sürülen EGF 12 reseptörleri olan, epitel sodyum kanalı 17, PI3K ve PTEN 18, ve kalsiyum serbest mekanizması henüz tam olarak anlaşılamamıştır. 15, 19 iyonların ve birden çok sinyal yollarının galvanotaksis katılan mümkündür.

Burada ortaya 2 boyutlu galvanotaksis yöntemi yapışık, hareketli hücrelerin belli bir yönde geçişini tanımlamak için, ya da 18, 20. Bu teknik, değiştirilmiş olan birleşik hücre tabakasının bireysel hücre göçü 10, 12, 17 ya da göç izlemek için yararlıdır Peng ve Jaffe 21, ve Nishimura ve ark. ısmarlama, açık PVC odaları ile 10, çıkarılabilir coversl ileIPS gibi bağışıklık floresan görüntüleme gibi ikincil analizi için galvanotaksis, sonra kolayca hücre alımı için izin. galvanotaksis odaları cam yüzeyi yüksek büyütmede ve floresan etiketli hücreleri ile filme sağlayan, optik-uyumludur. Aynı zamanda, bu tür bir yüzey kaplaması veya masraf değiştirilmesi gibi, cam yüzeyin modifikasyonu ile deney tasarımı sağlar. No: 1 coverglass yapılmış Aralayıcılar hücreleri üzerinde mevcut akışını en aza indirmek için odalar içinde kullanılır; Bu nedenle akım karesiyle orantılıdır joule ısıtma, deney sırasında hücreler aşırı ısınmasına olmaz. bağlayan köprüler Agar hücreleri ile elektrotların direkt temasını önlemek ve galvanotaksis sırasında ortam pH veya iyon konsantrasyonunun değişimi önlemek.

İki olmayan insan prostat kanser oluşturucu hücre çizgileri bu çalışmada kullanılan galvanotaksis yanıtı için incelenmiştir. prns-1-1 22 ve PNT2 23 hem SV4 olanBüyüme faktörüne bağlı hücre çizgileri, prostat spesifik antijeni (PSA) düşük ya da hiç bir ifade ile 5, 8, 18 ve 19 sitokeratin epitel işaretlerini ifade 0-ölümsüzleştirilmiş. Her iki hücre dizisi normal epitel hücreleri çokgen morfolojisini muhafaza ama kromozom anormalliği karar verildi.İşlemi 22, 24 gözlendi. Prns-1-1 ve PNT2 çoğu deneyde içindeki davranışları paylaşmalarına rağmen bunlar asinar yapısının oluşumu ve farklılıkları gösteriyor galvanotaksis. 3-boyutlu matrisi üzerinde Matrigel, prns-1-1 hücreleri, normal prostat bezi dokusu 25 benzeyen lümen içi boş asinar yapılar oluştururlar. Bununla birlikte, PNT2 hücreleri lümen veya polarize epitel 26 olmadan katı küreler oluşturma. prns-1-1 hücreler de bu çalışmada PNT2 daha yüksek bir galvanotactic tepki göstermektedir. Listesi asinar yapısının oluşumu ve galvanotaksis arasındaki korelasyon prns-1-1 galvanotactic sinyalleri pr organize edilmesinde rol oynayabileceğini öneriyorostate bezi dokusu endojen elektrik alanlarına tepki olarak hareket ve bu 2 hücre hatları arasında ayrım yapmak için daha fazla özelliklerini içerir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Kültürleme Prostat Hücreleri

  1. Kültür prns-1-1% 5 CO2 ile 37 ° C'de% 10 FBS ve antibiyotik antimikotik ile takviye edilmiş RPMI 1640 ortamı içinde, 100 mm kültür çanakları üzerinde ve PNT2 prostat hücreleri. Hücreler galvanotaksis deneyler için% 80 confluency ulaşana kadar her gün kültür ortamı yenileyin.

2. Montaj galvanotaksis Odaları

  1. Alt odalarını Montaj
    1. 2-propanol ile plastik galvanotaksis odası silin. Bir şırınga ile bir bölmenin alt tarafındaki dairesel açıklıklar etrafında deniz grade silikon astarı uygulayınız ve büyük bir coverglass (Şekil 1) takın. Coverglass bastırın ve pamuklu aşırı tutkal silmek için bir pamuk aplikatör arka tarafını kullanın. Yarı dairesel açıklıklar orta ve elektrik akımı, iki iç, orta rezervuar arasında yer alan hücreler üzerinde akmasına izin verir.
    2. 6 mm x 2 yapmak için küçük bir coverglass kesinBir elmas noktası işareti ile 5 mm tutucular.
    3. Odasına çevirin. Bir şırınga ve / veya alt camına 2 dairesel açıklıklar arasındaki hücre bağlanması için bir 10 mm x 25 mm kanal yüzey oluşturmak için metal bir spatula ile silikon tutkal şeritleri 2 uygulanır. 2 dairesel açıklıklar arasındaki cam aralama 2 adet Tutkal. Aralayıcıları aşağı doğru itin ve pamuklu ve / veya kürdan ile aşırı tutkal silmek için pamuk aplikatör arka tarafını kullanın.
    4. Silikon yapıştırıcı kürünü kadar 24 saat odasına kurutun. Tutkal, asetik asit kalıntılarını çıkarmak için damıtılmış su gece boyunca odası bekletin. Acil kullanım için odasına kurutun, veya temiz bir kap içinde daha sonra kullanılmak üzere odasına saklayın.
      Şekil 1,
      Şekil 1: bottom galvanotaksis odasının Meclisi. A) büyük coverglass) T, temiz odanın. B tabanına yerleştirilmiştirCam ayırıcılar adet 2 dairesel açıklıklar arasında yapıştırılmış wo hücreler eklemek için bir 10 mm x 25 mm kanal oluşturmak için.
  2. Galvanotaksis odalarına hücreleri Tohumlama
    1. Deney için gerekli galvanotaksis bölmelerin gerekli sayıda hazırlayın. Her bir hücre hattı veya tedavi tek galvanotaksis odası gerektirir. 2-propanol ile galvanotaksis odaları silin. Steril PBS ile 3 kez yıkayın odaları ve odalarına 2 dairesel açıklıklar arasındaki sıvı akışını kontrol edin.
    2. Steril hücre kültür tabaklarında odacıkları içine alın ve bunları, 15 dakika boyunca 37 ° C'de dengelenmeye gelmeye bırakın. 5 dakika için 37 ° C de, 5 ml% 0.25 tripsin-EDTA kullanılarak kültür kabı prostat hücreleri ayırmak. PBS içinde 5 ml% 10 FBS ile tripsin-EDTA nötralize.
    3. 15 ml tüpler hücreleri aktarın ve 200 x g, 37 ° C'de 5 dakika boyunca hücreler santrifüj. Süpernatan aspire ve kültür ortamı, 1 ml hücre yeniden askıya.
    4. 20 μ alHücre eriyiği bir sayım odasına yüklemek ve hücre sayısını hesaplayın. Kültür ortamında 8 x 10 4 hücre / ml hücre konsantrasyonunu ayarlayın.
    5. 37 ° C inkübatör dışına galvanotaksis odaları atın. Her bölmenin üzerine hücre süspansiyonu 350 ul Tohum.
    6. Islak Kimwipe ya da% 5 CO2 ile 37 ° C de kuluçka makinesi içinde bir nem odasında kültür çanağı içinde gece boyunca odalarında hücreleri inkübe edin.

Şekil 2,
Şekil 2:. Bölmeye tohum hücreleri alt bölme kurutuldu ve temizlenir A) Prostat hücreleri tripsinize sayılır ve bölmeye aktarılır ve bir gece boyunca inkübe edilir B) üst coverglass filme önce bölmeyi kapatmak için takılır...

  1. BirEn iyi odaları ssembling
    1. Çekimlerden önce üst odasını birleştirin. Mikroskop sadece bir seferde tek bir galvanotaksis odasını görüntüleme ağırlayacak. Her galvanotaksis bölmesi için 37 ° C'de kültür ortamında 10 ml kadar ısıtın. 37 ° C ısıtma plakasına kuluçka bir galvanotaksis odası aktarın.
    2. Birleşmeyen hücrelerin çıkarılması için kültür ortamı ile hücrelerin durulayın. Bölme ortamın 400 ul bırakın. Her iki cam aralama üstünde yüksek vakum yağı uygulamak için bir şırınga kullanın.
    3. Odasına mühür küçük bir coverglass ekleyin. Yavaşça bir pamuk aplikatör arka tarafı ile coverglass bastırın. Pamuklu aşırı orta siliniz.
    4. Cam yüzeyini kurulayın ve coverglass ve odanın arasındaki boşluğu kapatmak için yüksek vakum gres sürün. Yağ yaymak için bir metal spatula kullanın. İç rezervuarlar için kültür ortamı 4 ml ekleyin ve rezervuar arasındaki sıvı akışını kontrol edin.
  2. Agar olunköprüler
    1. 2 inç uzunluğunda bir PVC boru donanımının bir çift kesme (503/16 çapa x 5/16 dış çaplı x 1/16 duvar), çevirme ve 100 ml'lik bir beher içine yerleştirin.
    2. 200 mg Bacto-Agar ölçün ve% 2 agar jel için 10 ml kültür ortamı ile bir 50 ml'lik bir şişe içinde ilave edin. 30 saniye boyunca mikrodalga. Bir transfer pipet ile plastik boru agar jel yükleyin. Ağarı katılaştırmak için bir 10 dakika boyunca, oda sıcaklığında, agar köprüler bırakın.
    3. Galvanotaksis odasının dış rezervuar 2 ml kültür ortamı ekleyin. Akımını yapmak için iç ve dış ortam rezervuar agar köprüler yerleştirin.

Şekil 3,
Şekil 3:. Odasının üzerine hücreleri filme bir diyagram galvanotaksis odasının son montajını göstermek için. odası tamamen yüksek vakum gres ile mühürlenir. Orta t ilave edilirO rezervuarları doldurun ve iki agar köprü odasına yerleştirilir. Daha sonra galvanotaksis odası mikroskop kademesine aktarılmaktadır ve elektrotların elektrik alanı uygulamak için eklenir. Monte galvanotaksis odasının yan görünüşüdür elektrik akımı agar köprü ve cam kapak arasındaki boşluk boyunca hücrelerin üzerine akar göstermek için gösterilmiştir.

3. Time-lapse Görüntüleme

  1. Önce görüntüleme dolaşan hava, 2 saat içinde% 5 CO2 ile 37 ° C çevre odasında açın.
  2. Mikroskop açın ve görüntü elde yazılımı başlatmak. Mikroskop sahne kalibre ve 10X objektif seçin.
  3. , Mikroskop sahneye galvanotaksis odaları transfer bant ile sabitleyin odasına ve hücrelerin odaklanın. Sağ taraftaki katot ile dış rezervuar için galvanotaksis elektrotlar yerleştirin. Tel ve bant ile elektrotlar sabitleyin.
  4. Güç bo açınX odasına bir elektrik alanı uygulamak için. 25 mm uzunluğunda odasının (100 mV / mm) için 2.5 volt ulaşmak için odasına genelinde voltmetre ile çıkış gerilimini ölçün. Çıkış akımını ayarlayarak deney sırasında saha gücünü korumak.
  5. On Time-lapse filmleri oluşturmak için yazılım film odasının karşısında 10 puan seçin. 2 saat 10 dakika aralıklarla satın alma koşulları kurun.
  6. Filme başlatın ve gerektiği gibi çıkış akımını ayarlayın.
  7. Deneyin sonunda, sahneden odasına çıkarın ve% 95 alkol ile hücreleri tamir. Temizlemek için bir jilet ile açık odasını kırın ve tekrar kullanın.

Galvanotaksis 4. miktarının belirlenmesi

  1. Time-lapse film ve yeniden orient görüntülerin üstüne katot döndürün. Hücre izleme yazılımı filmleri verin.
  2. El ile her bir film (Şekil 4A, B), her bir zaman noktasında 10-20 hücrelerinin (x, y) konumu etiket.kuzey-güney doğrultusunda göre göç mesafeleri ve açıları, elektrik alanının aynı yönelimi, hücre izleme yazılımı (Şekil 4C) olarak hesaplanacaktır.
    NOT: Ortalama göç hızı, toplam göç mesafesi ve toplam filme zaman dönüştürülür. yön kosinüs değeri açılardan dönüştürülür. Hücreler rastgele yönlülük ile geçirirseniz, net kosinüs ortalaması sıfıra yakın olacaktır. Hücreler katot doğru doğrudan geçirirseniz, kosinüs değeri +1 olacaktır. Hücreler anot doğru doğrudan geçirirseniz, kosinüs değeri -1 olur.

Şekil 4,
Şekil 4: Hücre izleme yönünü ölçmek için hücre görüntüleri ile izleme hatlarının A) Kaplama.. Hücrelerin (x, y) konumu manua olanLly zaman atlamalı filmleri izlenir. . Hücreler rastgele göç varsa, ortalama kosinüs sıfıra yakın B) Ancak, hücreler katot veya anot doğru göç halinde, ortalama kosinüs değeri + (katot) ya da yakın -. (Anot) 1.0 ° C ) yön göç açıları (θ) dönüştürülür kosinüs değeri, tarafından sunulmaktadır. kosinüs (θ) mesafe b (elektrik alanının yönüne öngörülen mesafe) uzaklığa bir (göç mesafe) oranına eşittir.

  1. Ölçümleri kaydedin. Kombine sonuçları hesaplamak için bir veritabanı uygulaması veri almak.
  2. Çubuk grafikler (Şekil 5) çizmek için bir tablo ortalama göç hızı ve ortalama kosinüs değerinin kombine İhracat verileri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Prostat hücreleri (prns-1-1 ve PNT2) iki satır, bu yöntemle araştırılmıştır. Her iki hatta hücreler 2 saate (Şekil 5A) boyunca 1.0 +/- 0.3 mikron / dakika arasında benzer hızlarda göç ederler. Bununla birlikte, elektrik alanına yön prns-1-1 hattı için 0.7 +/- 0.3 ve PNT2 hattı (Şekil 5B) 0.2 +/- 0.8. Sonuçlar, pozisyonel ipuçları farklı yön yanıtlarına neden farklı hücresel sinyal mekanizmalarına sahip olduğunu düşündüren, (100 hücre izlendi p <0.01), bu iki hücre hatları galvanotaksis önemli bir fark.

Şekil 5,
Şekil 5: galvanotaksis prostat hücrelerinin. Hücreler elektrik alanına maruz kaldıkları zaman, A) prns-1-1 ve PNT2 hatlarının geçiş hızları aynıdır.PNT2 hattı elektrik alanı içinde düşük bir yönünü (kosinüs = 0.2) gösterdi B) Bununla birlikte, prns-1-1 hattı, katot (kosinüs = 0.7) karşı yüksek bir yönünü göstermektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bir hücrenin galvanotaksis tepki analizi pek çok hücresel göçmen veya büyüme için önemli bir fonksiyonel gösterge 27, 28 süreçleri olmuştur. Burada iki prostat hücre hatları film cam yüzeyi ile bir ısmarlama odasına kullanın. Bu hücre hatları galvanotaksis farklı derecelerde gösterdi, ve hücre içi lokalizasyonu veya galvanotaksis-sağlayan proteinlerin aktivasyonu galvanotaksis karşılık olarak gözlenen farkın neden ölümsüz hücre sıraları oluşturma işlemi sırasında müdahale olabilir düşünmekteyiz.

Kültür yemekleri 27, 28 yılında yapılan diğer galvanotaksis odası tasarımları ile karşılaştırıldığında, mevcut tasarım birçok yararları vardır. İlk olarak, cam yüzeyi görüntüleme için uygun olan ve hücreler ile coverglass immün galvanotaksis sonra alınabilir. Bu çalışmada hücrelerin bir grup izlemek için 10X objektif düşük büyütme kullanılır. Bununla birlikte, thes ileE geliştirilmiş cam optik, floresan proteinleri ile etiketli hücreleri hücrelerin 17 lider kenarında lamellipodial hızlı uzantısı ve geri çekilmesini izleme, ya da izlemek için, bir 60X petrol amacı ile yüksek büyütmede bir tek hücreyi film mümkündür. İkinci olarak, cam yüzeyi matris proteini kaplamalar 10, 12 ile modifiye edilmiş ya da mikro-kanallı desenli olabilir. Kimyasal tedaviler de 29 filme önce hücreleri tedavi öncesi etmek mümkündür. Matris kaplama Burada kullanılan prostat hücre hattı için gerekli değildir, ve matris kaplama hücre tipine bağlıdır. Örneğin, kolajen I kaplama insan keratinositleri 30 galvanotaksis için gereklidir, ancak laminin kaplama insan nöral kök hücreler 31 galvanotaksis için gereklidir. Bu, kolajen I, kolajen IV, fibronektin ve laminin ile keratinosit galvanotaksis test edilmiştir. Farklı matriks proteinleri hücre göçü hız değişmiş, ama katot Migrati değişmedi galvanotaksis 29 üzerinde. Üçüncü olarak, tadil edilmiş platin elektrot elektrik alanında atıldır. Diğer galvanotaksis yöntemleri 27 kullanıldığı gibi gümüş elektrotlar ile karşılaştırıldığında, onlar yıkmak değil ya galvanotaksis sitotoksisteye azaltır orta, metal iyonları bırakın. Dördüncü, bize hızlı ya da yavaş ya hücre göçü izlemek için yardımcı olur çerçeve yakalama, aralıklarını değişebilir. motorlu mikroskop aynı zamanda bir odasında farklı alanlarda birden film elde etmek için fırsat sağlar. Uygulanan bir elektrik alanı olmadan bir kontrol deneyi elektrik alan hücrelerin göç hızını değiştirir olmadığını belirlemek için de önemlidir.

Bununla birlikte, mevcut galvanotaksis odaları bağlı rezervuarların ortamın küçük bir hacme kadar 4 saat boyunca filme hücre göçü ile sınırlıdır. Odası tasarımı büyütülmüş versiyonu ile, daha uzun bir süre için hücrelerin film mümkün olacaktır.

ve_content "> yönteminde bazı potansiyel sorunlar şunlardır:. Onlar kurutulmuş kalırsanız odasının (400 ul) orta çok küçük hacimli olduğundan 1) hücreler odası montaj sırasında ölebilir, bu havayı yakalama önlemek için önemlidir o önce kabarcıklar odasında ve hücre durulama aşamasında hücreleri kapsayan bazı sıvı tutmak için. 2) odasındaki geçen akımı azalacağı, hangi görüntüleme sırasında sızıntı olabilir. odasındaki sıvı akışı dikkatle kontrol edilmelidir uygulanan mikroskop aşamasında ve daha yüksek vakum gres transfer gerekli. 3) yüksek vakum gres filme engel olabilir mürekkep eğer. cam yüzeyi yağ çıkarmak için% 95 alkol ile temizlenebilir. 4) Sahne sürüklenme veya odalarına herhangi bir yerinden Motorlu mikroskop sahne önyargı olabilir yönlü göç ölçümleri. Bu nedenle, yeterli sahne tutucu ve etiketleme bant ile galvanotaksis odaları güvenceye önemlidir.

ntent "> Genel, galvanotaksis yöntemi bize daha fazla organizmalarda yönlü göç anlamak için yardımcı olacak bir uygulamalı elektrik alanında, hareketli hücrelerin içsel yönünü ortaya çıkarmak için yararlıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

prostat hücre hatları nazik Kanser Merkezi, UC Davis Dr. Ling-Yu Wang ve Dr. Hsing-Jien Kung tarafından sağlanmaktadır. Bu proje NIH galvanotaksis hibe 4R33AI080604 tarafından desteklenmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells
pRNS-1-1 prostate cells Lee, et al. (1994)
PNT2 prostate cells Sigma-Aldrich 95012613-1VL Berthon, et al. (1995)
Medium and solutions
RPMI 1640 medium  Invitrogen 11875-093 warm up to 37 °C before use
Fetal Bovine Serum - Premium Atlanta Biologicals S11150 10% in PBS, warm up to 37 °C before use
Antibiotic-Antimycotic (100x) Life Technologies 15240 add 5 ml to 500 ml medium
2-propanol VWR BDH1133-5GL
PBS - - 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4 and 1.5 mM KH2PO4 in 1,000 ml of H2O, pH to 7.4 and autoclaved, warm up to 37 °C before use
0.25% Trypsin-EDTA  Invitrogen 25200-056 warm up to 37 °C before use, treat cells for 3-5 min at 37 °C
Galvanotaxis device
Galvanotaxis chambers Precision Plastics Inc, CA Custom-designed (1/4" x 2" x 3.5"), non-toxic, clear PVC chambers. Please contact the authors for the design specs.
Galvanotaxis electrodes UCD electric shop platinum coiled electrodes with flexable cords
Galvanotaxis power box Substrate Engineering, CA custom-designed DC power output with voltmeter
Microscope Cover Glass, Large, 45 x 50 mm, No. 1.5 Fisher 12-544-F
Microscope Cover Glass, small, 25 x 25 mm, No. 1 ThermoScientific 3307
Diamond point marker ThermoScientific 750
Marine grade silicon sealer, clear 3M 051135-08019
High vacuum grease Dow Corning 2021846-0807
6 ml syringe Fisher Scientific 05-561-64
Nichiryo Syringe, 1.5 ml Nichiryo SG-M
Cotton applicators Purtian Medical Products 806-WC
Qtips Johnson & Johnson 729389
Nalgene 180 PVC tubing  Nalgene 8000-9030 503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall
Bacto-Agar Difco 0140-01 make 2% agar solution
Razor Blade Personna 74-0001
Equipments and Software
Benchtop Centrifuge Eppendorf 5810R operated with an A-4-62 rotor
Cellometer Auto T4 Nexcelom Auto T4
Cellometer counting chambers Nexcelom CHT4-SD100-002 load 20 μl cell solutions to count
Culture Temp Warming plate Bel-Art Scienceware 370150000 to keep the galvanotaxis chambers at 37 °C 
Eclipse TE-2000 microscope with motorized stage and environmental chamber Nikon
Plan Fluor 10X/0.30 objective len Nikon
Retiga EX CCD camera  Qimaging Cooled CCD camara, mono-color, 12-bit
Compressed air with 5% CO2 Airgas special order
Volocity 6.3 PerkinElmer Image acquiring software
Improvision OpenLab 5.5.2 PerkinElmer Cell tracking software and customized to measure migration angles
FileMaker Pro Advanced, 8.0 FileMaker
Microsoft Excel 2008 for Mac Microsoft

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe. Nat Protoc. 2, (3), 661-669 (2007).
  2. Cao, L., et al. Endogenous electric currents might guide rostral migration of neuroblasts. EMBO Rep. 14, (2), 184-190 (2013).
  3. Hotary, K. B., Robinson, K. R. Endogenous electrical currents and voltage gradients in Xenopus embryos and the consequences of their disruption. Dev Biol. 166, (2), 789-800 (1994).
  4. Hotary, K. B., Robinson, K. R. Evidence of a role for endogenous electrical fields in chick embryo development. Development. 114, (4), 985-996 (1992).
  5. Yamashita, M. Electric axon guidance in embryonic retina: galvanotropism revisited. Biochem Biophys Res Commun. 431, (2), 280-283 (2013).
  6. Wood, M. D., Willits, R. K. Applied electric field enhances DRG neurite growth: influence of stimulation media, surface coating and growth supplements. J Neural Eng. 6, (4), 046003 (2009).
  7. Kucerova, R., et al. The role of electrical signals in murine corneal wound re-epithelialization. J Cell Physiol. 226, (6), 1544-1553 (2011).
  8. Sillman, A. L., Quang, D. M., Farboud, B., Fang, K. S., Nuccitelli, R., Isseroff, R. R. Human Dermal fibroblasts do not exhibit directional migration on collagen I in direct-current electric fields of physiological strength. Exp Dermatol. 12, (4), 396-402 (2003).
  9. Allen, G. M., Mogilner, A., Theriot, J. A. Electrophoresis of cellular membrane components creates the directional cue guiding keratocyte galvanotaxis. Curr Biol. 23, (7), 560-568 (2013).
  10. Nishimura, K. Y., Isseroff, R. R., Nuccitelli, R. Human keratinocytes migrate to the negative pole in direct current electric fields comparable to those measured in mammalian wounds. J Cell Sci. 109, (1), 199-207 (1996).
  11. Farboud, B., Nuccitelli, R., Schwab, I. R., Isseroff, R. R. DC electric fields induce rapid directional migration in cultured human corneal epithelial cells. Exp Eye Res. 70, (5), 667-673 (2000).
  12. Fang, K. S., Ionides, E., Oster, G., Nuccitelli, R., Isseroff, R. R. Epidermal growth factor receptor relocalization and kinase activity are necessary for directional migration of keratinocytes in DC electric fields. J Cell Sci. 112, (12), 1967-1978 (1999).
  13. Li, J., et al. Activated T lymphocytes migrate toward the cathode of DC electric fields in microfluidic devices. Lab Chip. 11, (7), 1298-1304 (2011).
  14. Meng, X., Arocena, M., Penninger, J., Gage, F. H., Zhao, M., Song, B. PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors. Exp Neurol. 227, (1), 210-217 (2011).
  15. Wu, D., Ma, X., Lin, F. DC Electric Fields Direct Breast Cancer Cell Migration, Induce EGFR Polarization, and Increase the Intracellular Level of Calcium Ions. Cell Biochem Biophys. 67, (3), 1115-1125 (2013).
  16. Martin-Granados, C., et al. A role for PP1/NIPP1 in steering migration of human cancer cells. PLoS One. 7, (7), 40769 (2012).
  17. Yang, H. Y., Charles, R. P., Hummler, E., Baines, D. L., Isseroff, R. R. The epithelial sodium channel mediates the directionality of galvanotaxis in human keratinocytes. J Cell Sci. 126, (9), 1942-1951 (2013).
  18. Zhao, M., et al. Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH kinase-gamma and PTEN. Nature. 442, (7101), 457-460 (2006).
  19. Shanley, L. J., Walczysko, P., Bain, M., MacEwan, D. J., Zhao, M. Influx of extracellular Ca2+ is necessary for electrotaxis in Dictyostelium. J Cell Sci. 119, (22), 4741-4748 (2006).
  20. Zhao, M., Agius-Fernandez, A., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Directed migration of corneal epithelial sheets in physiological electric fields. Invest Ophthalmol Vis Sci. 37, (13), 2548-2558 (1996).
  21. Peng, H. B., Jaffe, L. F. Polarization of fucoid eggs by steady electrical fields. Dev Biol. 53, (2), 277-284 (1976).
  22. Lee, M., et al. Characterization of adult human prostatic epithelial-cells immortalized by polybrene-induced DNA transfection with a plasmid containing an origin-defective sv40-genome. Int J Oncol. 4, (4), 821-830 (1994).
  23. Berthon, P., Cussenot, O., Hopwood, L., Leduc, A., Maitland, N. Functional expression of sv40 in normal human prostatic epithelial and fibroblastic cells - differentiation pattern of non-tumorigenic cell-lines. Int J Oncol. 6, (2), 333-343 (1995).
  24. Aurich-Costa, J., Vannier, A., Grégoire, E., Nowak, F., Cherif, D. IPM-FISH, a new M-FISH approach using IRS-PCR painting probes: application to the analysis of seven human prostate cell lines. Genes Chromosomes Cancer. 30, (2), 143-160 (2001).
  25. Tyson, D. R., Inokuchi, J., Tsunoda, T., Lau, A., Ornstein, D. K. Culture requirements of prostatic epithelial cell lines for acinar morphogenesis and lumen formation in vitro: role of extracellular calcium. Prostate. 67, (15), 1601-1613 (2007).
  26. Lang, S. H., Sharrard, R. M., Stark, M., Villette, J. M., Maitland, N. J. Prostate epithelial cell lines form spheroids with evidence of glandular differentiation in three-dimensional Matrigel cultures. Br J Cancer. 85, (4), 590-599 (2001).
  27. Babona-Pilipos, R., Popovic, M. R., Morshead, C. M. A galvanotaxis assay for analysis of neural precursor cell migration kinetics in an externally applied direct current electric field. J Vis Exp. (68), (2012).
  28. Meng, X., et al. Electric field-controlled directed migration of neural progenitor cells in 2D and 3D environments. J Vis Exp. (60), (2012).
  29. Pullar, C. E., Isseroff, R. R. Cyclic AMP mediates keratinocyte directional migration in an electric field. J Cell Sci. 118, (9), 2023-2034 (2005).
  30. Sheridan, D. M., Isseroff, R. R., Nuccitelli, R. Imposition of a physiologic DC electric field alters the migratory response of human keratinocytes on extracellular matrix molecules. J Invest Dermatol. 106, (4), 642-646 (1996).
  31. Feng, J. F., et al. Guided migration of neural stem cells derived from human embryonic stem cells by an electric field. Stem Cells. 30, (2), 349-355 (2012).
  32. Mukerjee, E. V., Isseroff, R. R., Nuccitelli, R., Collins, S. D., Smith, R. L. Microneedle array for measuring wound generated electric fields. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 1, 4326-4328 (2006).
  33. Nuccitelli, R., Nuccitelli, P., Li, C., Narsing, S., Pariser, D. M., Lui, K. The electric field near human skin wounds declines with age and provides a noninvasive indicator of wound healing. Wound Rep. and Reg. 19, 645-655 (2011).
Prostat Hücrelerinin Yönlü Göç Eğitim için özel tasarlanmış galvanotaksis Chambers kullanılması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, H. y., Dinh La, T., Isseroff, R. R. Utilizing Custom-designed Galvanotaxis Chambers to Study Directional Migration of Prostate Cells. J. Vis. Exp. (94), e51973, doi:10.3791/51973 (2014).More

Yang, H. y., Dinh La, T., Isseroff, R. R. Utilizing Custom-designed Galvanotaxis Chambers to Study Directional Migration of Prostate Cells. J. Vis. Exp. (94), e51973, doi:10.3791/51973 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter