Summary
Modelos de cultura celular proporcionar um controle detalhado sobre as condições ambientais e, assim, proporcionar uma plataforma poderosa para elucidar vários aspectos da biologia celular neuronal. Nós descrevemos um método rápido, barato e confiável para isolar, dissociar e cultura neurônios sensoriais a partir de embriões de galinha. Os detalhes da preparação substratos e imunocitoquímica também são fornecidos.
Abstract
Os neurônios são as células multifacetadas que carregam informações essenciais para uma variedade de funções, incluindo a sensação, movimento motor, aprendizagem e memória. Estudar neurônios in vivo pode ser um desafio, devido à sua complexidade, seus ambientes variados e dinâmicos, e as limitações técnicas. Por estas razões, estudando neurônios in vitro pode ser benéfico para desvendar os mistérios complexos de neurônios. A natureza bem definida de modelos de cultura celular fornece controle detalhado sobre as condições ambientais e variáveis. Aqui nós descrevemos como isolar, dissociar, e neurônios cultura primária de embriões de galinha. Esta técnica é rápida, barata, robusta e gera crescente neurónios sensoriais. O procedimento produz consistentemente culturas que estão altamente enriquecidas em neurónios e tem muito poucas células não neuronais (menos do que 5%). Neurônios primários não adere bem ao vidro não tratada ou de cultura de tecidos de plástico, portanto, os procedimentos detalhados para criar dois disct, substratos contendo laminina bem definida para o chapeamento neuronais são descritos. Neurônios cultivados são altamente suscetíveis a várias técnicas celulares e moleculares, incluindo a co-imunoprecipitação, imaginação de células vivas, RNAi, e imunocitoquímica. Procedimentos para imunocitoquímica duas vezes nesses neurônios cultivados foram otimizados e descrito aqui.
Introduction
Os neurônios são células complexas que levam informações essenciais para uma variedade de funções, incluindo a sensação, visão, movimento motor, aprendizagem e memória. Único a partir de outros tipos de células, os neurônios estender os processos de braço-like, chamadas axônios, para formar rodovias neurais essenciais para a comunicação. Durante o desenvolvimento especializada compartimentos localizados na ponta dos axônios em crescimento, chamados cones de crescimento, navegar através de um concerto de sinais extracelulares para liderar o axônio para o seu destino apropriado. Os mecanismos moleculares que estão na base intrincadas do cone de crescimento de navegação não são completamente compreendidos. Para entender melhor esses mecanismos, os pesquisadores usaram modelos de cultura de células para estudar neurônios em um ambiente vitro definido e simplificado. Estudar neurônios em cultura 1 levou a avanços significativos em nossa compreensão da biologia de células neuronais, incluindo: a diferenciação neuronal 2, a dinâmica do citoesqueleto, endocitose e tráfico, dendritoregulação 3,4, a regeneração axonal 5, e as condições clínicas, tais como neuropatias 6. Além disso, os neurónios em cultura são altamente susceptível a uma vasta gama de técnicas de pesquisa, incluindo a imunocitoquímica, de células da superfície de co-imunoprecipitação, transferência Western, transfecção, ARNi, e imagens em tempo real, tais como análise de Timelapse cone de crescimento motilidade. Assim, a cultura de neurônios primários é uma abordagem poderosa para elucidar vários aspectos da biologia celular dos neurônios.
O modelo de cultura celular fornece investigadores com controle detalhado sobre as condições ambientais e variáveis. Por exemplo, o substrato sobre o qual os neurónios foram semeadas (e crescer em cima) pode ser facilmente manipulado. Aqui, nós fornecemos instruções detalhadas para a geração de dois substratos distintos, um com uma baixa concentração de laminina-1 e outro com concentrações de saturação de laminina-1. Surpreendentemente, concentrações diferentes da mesma molécula pode ter efeitos dramáticossobre o estado interno de neurónios, bem como a sua composição da superfície da célula. Por exemplo, os níveis intracelulares de cAMP e níveis de superfície de integrinas são significativamente diferentes nos neurónios plaqueados sobre estes dois substratos 7,8. Outros estudos têm mostrado que outras moléculas, incluindo fibronectina e proteoglicanos de sulfato de condroitina, o impacto da expressão de moléculas da superfície celular e a motilidade neuronal 7-11. Além disso, as moléculas solúveis, tais como neurotrofinas e neurotropins também afectar a composição da membrana celular e a motilidade neuronal e 12-16 podem ser facilmente e com precisão manipulado em um modelo de cultura de células.
Aqui, descrevemos os métodos para isolar e cultura dissociada neurônios sensoriais a partir de embriões de galinha. Este procedimento tem sido usado para fazer avanços significativos em neurobiologia, incluindo axônio conseqüência 5,7,8,10,11,16-21 e foi modificado a partir de um procedimento destinado a isolar as células ganglionares 22. Temvárias vantagens para esta abordagem. Em primeiro lugar, muitas características da garota gânglio da raiz dorsal (DRG) desenvolvimento estão bem caracterizados, incluindo o período de tempo para o parto, a extensão do axônio, e expressão da proteína perfis 2,23-28, proporcionando assim uma base instrutiva sobre a qual construir informativo experimentos in vitro. Em segundo lugar, dissociado culturas neuronais permitem ao investigador para estudar mais directa em comparação com os neurónios de abordagens alternativas que utilizam explantes DRG intactos (que contêm neurónios e células não neuronais) e / ou culturas mistas que contêm ambos os neurónios dissociados e células não-neuronais. Em terceiro lugar, o procedimento descrito aqui é simples, barato e passível de graduação. Portanto, essa técnica pode ser usada para pesquisa, bem como para fins de ensino. Além disso, pequenas variações deste protocolo deve permitir a purificação rápida, alto rendimento de neurônios a partir de outras fontes de GDH. Por exemplo, este procedimento pode ser modificado para proporcionar neuronalmente enriched culturas de outros tecidos, tais como prosencéfalo embrionário ou da medula espinal.
Imunocitoquímica protocolos foram optimizados para estas culturas neuronais dissociadas e são descritos em detalhe aqui. O procedimento para a imunocitoquímica dupla contra molécula de adesão de células neurais (NCAM) e integrinas β1 é fornecido. Os dados gerados a partir destes métodos imunocitoquímicos foram utilizados para examinar o padrão espacial e intensidade de várias moléculas em neurónios cultivados 8,16.
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Protocol
1. Coverslip Preparação: lavagem ácida e Bake
- Pelo menos 2 dias antes da dissecção (passo 2), começam as seguintes etapas para preparar lamelas. Execute o passo de lavagem de ácido para remover óleos e lamelas completamente limpas.
- Lamelas de carga em suporte de porcelana que posiciona verticalmente lamelas e impede que eles se toquem. Submergir titular e lamelas em recipiente de vidro cheio histologia com ácido clorídrico 2 M (HCl). Alternativamente, se o titular de porcelana não está disponível, espalhe ~ 20 lamelas horizontalmente para cobrir o fundo de 100 milímetros de vidro placa de Petri e submergir lamelas em HCl 2 M.
- Coloque recipiente de vidro (com lamelas submersas em ácido) na tabela de balancim em hotte e permitir agitação suave durante pelo menos 5 horas à temperatura ambiente. Alternativamente, lavagem ácida lamelas durante a noite sob as mesmas condições.
- Lavar as lamelas com H2O destilada (dH2O), transferindo o suporte carregado porcelanacom lamelas de HCl 2 M para um recipiente de vidro limpo histologia preenchido com dH2O Alternativamente, decantar M HCl 2 de vidro placa de Petri com lamelas e encha com dH 2 O.
- Lave por decantação dH2O novamente e recarregar recipiente de vidro com dH fresco 2 O. Repetir para um total de três lavagens rápidas.
- Comece já esquema de lavagem retornando recipiente de vidro (com lamelas e dH 2 O) na cadeira de balanço. Permitir a agitação suave durante 10-30 minutos à temperatura ambiente. Então, decantar dH2O e adicionar dH fresco 2 O. Repita o procedimento para um total de pelo menos dez lavagens. Como alternativa, continuar a lavar durante a noite.
- Coloque lamelas foram lavadas em forno pré-aquecido a 350 ° C. Se utilizar o suporte de porcelana, remova o suporte de dH 2 recipiente de vidro O-preenchido e coloque titular com lamelas diretamente no forno. Se estiver usando uma placa de Petri de vidro, decantar dH2O e coloque o prato de vidro com lamelas na furnace.
- Asse lamelas durante pelo menos cinco horas ou durante a noite a 350 ° C.
- Após o cozimento estiver concluída, remova lamelas do suporte de porcelana com uma pinça fina e coloque em estéril 100 milímetros de vidro placa de Petri. Deixe lamelas que não foram originalmente colocados no suporte de porcelana no vidro placa de Petri.
2. Pintinho dissecção e isolamento da GDH
- Remover fértil, encenado White Leghorn pintcher da incubadora (realizada no 37-38,5 ° C com balanço suave).
NOTA: estudos anteriores usaram dia embrionário 7-10 para isolamento de GDH 2,8,11-13,16. - Coloque ovo selecionado na capela de fluxo laminar. Realizar todos os procedimentos listados abaixo, sob condições assépticas na câmara de fluxo laminar, com soluções e instrumentos esterilizados. Pré-quentes todas as soluções em um banho de água a 37 ° C.
- Rachadura conteúdo dos ovos e coloque em um plástico 100 milímetros placa de Petri. Use uma pinça padrão para transferência de embriões para outra 100 milímetros placa de Petri.
- Adicionar F12HS10 quente (F12 de Ham, HEPES 10 mM, 100 unidades / ml de penicilina, 0,1 mg / ml de estreptomicina, 10% de soro fetal bovino) a repartir com pipeta de Pasteur a manter o tecido molhado. Use fórceps para posicionar embrião no seu lado dorsal (Figura 1A).
- Coloque 100 milímetros de plástico placa de Petri contendo tecido embrionário em um microscópio binocular estereoscópica dissecação em capela de fluxo laminar. Use uma pinça fina para fazer uma incisão na linha vertical a partir da cauda para o pescoço, apertando a derme em desenvolvimento para expor o coração, pulmão e outros órgãos. Como alternativa, fazer uma série de pequenas lágrimas para expor os órgãos internos.
- Suavemente utilizar dois conjuntos de pinça fina estéreis para: a) compreender o pescoço e b) compreender a aorta ou outro tecido imediatamente superior ao coração e ao puxar para a cauda,evisceração do animal.
- Aplicar F12HS10 quente com pipeta Pasteur para o tecido. Use uma pinça para remover todos os restantes órgãos cardiovasculares, respiratórias ou digestivas para expor as costelas em desenvolvimento, coluna vertebral e GDH (Figuras 1B-1D).
- Sob o microscópio de dissecação, use uma pinça fina para remover mais órgãos e recolher GDH ao longo de ambos os lados da coluna vertebral lombar, inferior das costelas. Colete GDHs arrancando GDHs intactas do embrião. Aperte e cortar as raízes que chegam do DRG para a medula espinhal e agarrando o nervo desenvolvimento que chega do DRG para a periferia, ou vice-versa.
- Coloque GDHs intactas em uma placa de cultura 35 milímetros cheio de F12HS10 quente. Remova qualquer excesso de tecido, como a dorsal ou raízes ventrais que possam ter aderido a GDH, a partir dos GDH intactas em 35 milímetros prato de compressão com uma pinça fina.
- Para obter GDHs superiores para a região lombar, retire a metade ventral do tórax e Cervicoluna vertebral cal. Isso é feito por meio de corte na coluna vertebral em desenvolvimento perpendicular ao eixo da medula espinal na região cervical superior e outro corte na região lombar superior. Em seguida, fazer os cortes paralelos ao eixo da medula espinal ao longo do lado esquerdo da coluna vertebral e da direita. Levante a metade ventral da coluna vertebral do embrião, o que expõe os expõe a medula espinhal (Figuras 1E-1F).
- Para permitir o acesso fácil para os GDH, retire a medula espinhal torácica e cervical, segurando a medula espinhal com uma pinça fina. Utilizar as pinças para levantar a medula da coluna vertebral. Como aproximação, a medula espinal torácica é ao nível de costelas e a área do colo do útero é superior à das nervuras.
- Colete torácica intacta e GDH cervical com uma pinça fina e colocá-los em F12HS10 quente com outros GDH. Retire o excesso de tecido que podem aderir a GDH.
- Lavar interior de uma nova pipeta Pasteur de vidro com F12HS10 para ajudarevitar GDH de degola para paredes de pipeta. Use pipeta lavado para transferir todos os GDH e F12HS10 de pequena placa de Petri a uma estéril tubo de 15 ml e proceder de imediato para a etapa 3.
NOTA: Adicionais embriões podem ser dissecados para aumentar o número de GDH. GDH deveria ser mantido na F12HS10 a 37 ° C até estar pronto para a etapa 3.
3. dissociação, enriquecendo, e Cultivo DRG Neurônios - Parte 1
- Coloque o tubo cônico com GDHs intactas para centrífuga e girar suavemente (200 xg) por 2-3 min. Confirme que GDHs ter afundado ao fundo do tubo. Se não, girar novamente.
- Com uma pipeta, remova cuidadosamente F12HS10, deixando DRG pellet imperturbável. Adicionam-se 2 ml de 1x de cálcio e magnésio livres (CMF) PBS, desalojando o sedimento de DRG. Girar novamente e retire CMF PBS, deixando a pelota DRG intacta. Repetir esta etapa de lavagem para um total de três lavagens para remover o soro fetal bovino em F12HS10, o que iria interferir com a digestão da tripsina na próxima etapa.
- Adicionam-se 2 ml de tripsina aquecida ao tubo de 15 ml contendo 2 ml de PBS e CMF DRGs. Coloque o tubo de 37 ° C banho-maria durante 10-15 minutos para digerir GDH em células dissociadas.
- Durante a incubação, fazer F12H + suplemento contendo meio (F12 de Ham, 10 mM de HEPES a 100 unidades / ml de penicilina, 0,1 mg / ml de estreptomicina, 10 ng / ml de NT3, 10 ng / mL de NGF, 200 mM de L-glutamina e N2) e aquecer em 37 ° C num banho de água. Tipicamente, 10 ml de meio total é suficiente para 4-5 pratos de 35 mm de neurónios sensoriais primários. Também começar o descongelamento da laminina-1 para lamelas de revestimento (passo 4).
- GDH suavemente triturado em solução de tripsina com pipeta P1000 e inspecionar visualmente a ausência de GDH intactas. Continue trituração até GDHs intactas já não são vistos a olho nu e / ou permitir mais tempo de incubação de tripsina em 37 ° C banho-maria até GDHs intactas são dissociados. Para proteger os neurônios DRG de danos, evitar bolhas de ar durante a trituração e limitar digestão com tripsina a <30 min.
- Centrifugtubo e contendo GDHs dissociados e tripsina a 200 xg por 3-5 min para formar pelotas. Girar mais longo se necessário, até que se formou sedimento.
- Aspirar cuidadosamente tripsina sem interromper pellet. Adicionar 2 ml de F12HS10 para sedimentar. Gentilmente triturar GDH com uma ponta de pipeta P1000.
- Transferir todo o conteúdo do tubo de 15 ml em 100 milímetros placa de cultura. Lavar o tubo com 8 ml F12HS10 e transferi-lo para o prato de cultura, 2 ml de cada vez, para um total de 10 ml. Esta etapa de lavagem permite a recolha de células que podem ter permanecido adere às paredes do tubo.
- Coloque 100 mm prato de cultura (com 10 ml F12HS10 e células dissociadas DRG) em atmosfera húmida a 37 ° C durante 3 horas incubadora.
NOTA: CO 2, não é necessária na incubadora porque buffers HEPES pH do meio, na ausência de CO 2. Durante a incubação, as células gliais se ligam a superfície de cultura de tecidos de plástico e tendem a aderir neurónios frouxamente a cama da glia.
4 Ácido Coating LavadoLamelas e cozidas com laminina-1
- Descongele alíquotas estéreis congelado laminina-1 no gelo.
- Sob condições estéreis, adicionar 1 ml de PBS estéril 1x a alíquota de 50 ul da laminina-1.
- Utilizar um espectrofotómetro para se obter um valor de absorção de laminina-1 a 280 nm. Utilizar este valor na seguinte equação para determinar a concentração de laminina-1.
ABS 280 = (concentração mg / ml) * (coeficiente de extinção da proteína)
O coeficiente de extinção para a laminina-1 é de 0,86.
- Sob condições de esterilidade, diluído laminina-1 com 1X PBS para se obter as concentrações de 1 mg / ml e 20 mg / ml. Usar estas duas concentrações aplicadas de laminina-1 para atingir uma diferença de dez vezes da laminina-1 ligado a lamela (30 ng / cm 2 e 300 ng / cm 2, respectivamente), após incubação 7,8,10.
- Em uma capela de fluxo laminar, use uma pinça fina para colocar uma lavada com ácido e cozido coverslip no fundo de um prato de cultura de 35 mm. Repita conforme necessário para obter o número de pratos necessários.
- Apresentar as lamelas a luz UV por 20-30 min para garantir ainda mais a esterilização. Manter tampa prato, durante este passo.
- Adicionar 400 mL de preparadas laminina-1 para cada lamela de vidro. Use a ponta da pipeta para espalhar laminina-1 para garantir a cobertura completa da lamela. A tensão superficial vai permitir que a laminina-1 permaneça na lamela e não espalhada na parte inferior da placa de cultura, que é necessária.
- Colocar a tampa no prato e permitir que a laminina-1 a incubar durante 2-3 horas à temperatura ambiente (3 horas é o ideal).
- Depois de laminina-1 de incubação, lavar lamelas usando uma técnica asséptica com PBS estéril em capela de fluxo laminar. Remova a solução em lamela e adicionar 400 mL de PBS. Espere 5-10 min. Repita o procedimento para um total de 3 lavagens.
- Deixe PBS em lamela após a última lavagem. Não quebrar a tensão superficial durante a lavagem e não permitem lamelas a secar. Letampa av em até estar pronto para a chapa neurônios dissociados na coverlip.
5. dissociação, enriquecendo, e Cultivo DRG Neurônios - Parte 2
- Após a incubação, usar uma pipeta estéril 10 mL para lavar suavemente a parte inferior da placa de 100 mm contendo células DRG dissociados. Segure prato em ~ 45 ° de ângulo, puxe ~ 7 ml de F12HS10 com auxílio de pipeta, em seguida, expulsar gentilmente 7 ml para cerca de 1/3 do prato. Repita 5x, deslocando suavemente neurônios.
- Rodar prato e repetir procedimento de lavagem, para outros seis lavagens, por outro 1/3 do prato. Repita o procedimento novamente para 1/3 restante do prato. Desta forma, lavar cuidadosamente toda a parte inferior do prato com F12HS10 para remover os neurónios.
- Usando mesma pipeta, transferir F12HS10 contendo neurônios de prato de 100 mm a 15 tubo cônico. Centrifuga-se durante 5-10 minutos a 200 g para sedimentar as células.
- Remover F12HS10, deixando sedimento imperturbável. Ressuspender o sedimento com 2 mL de F12H aquecida + suplementos.
- Dilui-se as células conforme necessário com F12H + suplementos para obter a concentração desejada chapeamento (120.000 células / ml para lamelas revestidas com 1 ug / ml de células de laminina-1 e 40000 / ml para lamelas revestidas com 20 ug / ml de laminina-1 8,16).
- Remover PBS de lamelas revestido de laminina e coloque imediatamente 400 mL de células em lamelas. Transferir cuidadosamente prato para um umidificado, 37 ° C de cultura de células incubadora. Deixa-se incubar durante pelo menos 1 hora e até 3 horas para permitir que os neurónios para aderir à laminina-1.
- Em condições estéreis, inundar suavemente 35 milímetros pratos contendo neurônios com 1,6 ml de F12H + suplementos.
NOTA: Neste momento, a tensão superficial na lamela pode ser quebrado. Os neurônios têm suficientemente respeitado laminina-1 na lamela. - Voltar células para incubadora e incubar durante a noite. Realizar experimentos tais como imunocitoquímica no dia seguinte.
6.mmunocytochemistry
- Antes de imunocitoquímica, a solução fixadora quente (paraformaldeído a 4%, sacarose a 30% 2X PBS) em 37 ° C num banho de água.
NOTA: Antes de fixar as células, trata-se com vários reagentes, como a netrina-1, Mn 2 +, sonic hedgehog, semaforina, e efrina 16,29-31. - Lentamente remover 1 ml dos 2 ml de F12H + suplementos do prato de cultura. Suavemente adicionar 1 ml de solução fixadora aquecido. Deixa-se incubar à temperatura ambiente durante 10-15 min.
- Remova cuidadosamente a solução fixadora e adicionar 2 ml de PBS. Aplicar a solução para a borda do prato, evitando possível desalojamento de células fixas devido à aplicação de PBS. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
- Repetir lavagem com PBS para um total de cinco lavagens. Não permitir que as células secar durante qualquer passo de imunocitoquímica.
- Remover PBS. Aplicar 1 ml de solução de bloqueio (0,1% de Triton-X, 1X PBS, 5% de soro normal de cabra). Incubar durante 1 h à temperatura ambiente. Alternativamente, para corar as moléculas de superfície, Não use Triton-X em solução 8 bloqueio.
- Dilui-se os anticorpos primários em solução de acordo com a recomendação do fabricante bloqueio. Use 1: 500 para anticorpos contra NCAM e ativado β1 integrinas 16. Retirar solução de bloqueio, adicionar 1 ml de uma solução de anticorpo primário e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.
- Remover solução de anticorpo primário e adicionar 2 ml de 1X PBS. Incubar durante 5-10 min à temperatura ambiente. Repetir para um total de 4 lavagens com PBS. Lavagens pode ser prorrogado, se necessário.
- Dilui-se o anticorpo secundário de 1: 1000 em solução de bloqueio. Remover PBS, adicionar 1 ml de solução de anticorpo secundário e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente.
NOTA: anticorpos secundários são sensíveis à luz. Manter as soluções e células no escuro, tanto quanto possível a partir deste ponto em diante. - Remova a solução anticorpo secundário e enxaguar 5x com 1x PBS, como feito anteriormente.
- Aplicar ~ 60-80 ul de FluoromountG sobre uma lâmina de microscópio. Usando uma pinça fina, levante suavemente lamela de prato e menor lamela em Fluoromount G em lâmina de microscópio. Evite bolhas de ar.
- Loja desliza horizontalmente, a 4 ° C no escuro. Após 12-24 horas, Fluormount G polimerizará e lamela será firmemente ligado a lâmina de microscópio. Células imagem após esta etapa de polimerização está completa.
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Representative Results
O protocolo aqui descrito permite que os investigadores a cultura de uma população enriquecida de neurónios sensoriais dissociados de embriões com muito poucas células (por exemplo, <5%) não neuronais 7,8,10,16. Numerosos GDHs pode ser obtido a partir da região cervical lombossacral, torácicas e. Dependendo das necessidades do investigador, DRGs destas regiões anatómicas distintas pode ser facilmente isolado. Por exemplo, a Figura 1 mostra imagens do embrião de galinha por várias fases de dissecção com os GDH lombares em destaque na Figura 1C e 1D e GDH torácicas nas Figuras 1E e 1F.
As células em cultura são facilmente marcados por imunocitoquímica. Aqui, as células são cultivadas com os anticorpos contra a integrina β1 e MACN (figura 2). Surpreendentemente, temos sido capazes de visualizar coloração fluorescente para até um ano após estesProcedimentos ICC, se as lâminas foram mantidas horizontalmente a 4 ° C e no escuro. No entanto, a longevidade das manchas ICC precisa de ser determinada pelo utilizador e por anticorpo.
Dependendo da densidade de neurônios, cones de crescimento nas pontas das neurites que se estendem, também podem ser visualizadas (Figuras 2E-2F). Neurônios banhado a 40.000 e 120.000 células / ml em lamelas revestidos com 20 mg / ml e de 1 mg / ml de laminina-1, respectivamente, têm inúmeras neurites grátis até 26 horas após plaqueamento. Essas culturas podem ser utilizados para analisar, especificamente, os cones de crescimento, além de análise de todo o neurónio. Anteriormente, este procedimento tem sido utilizado para avaliar o crescimento cone velocidade e comportamentos, como o crescimento cone colapso 8,9,11,13,16. Densidades de revestimento mais baixas nessas Lamelas resulta em neurônios mortos que não estão aderidos ao substrato. A densidade adequada exato necessário para cada experimento precisa ser otimizado por investigador.
Figura 1. Estágios de pinto embrionário dissecção obter GDH. A) de embrião de galinha deitado de lado dorsal. O coração (H), asas (W) e pernas (L) são rotulados. A parte de cima da imagem é na direcção da cabeça, ou superior, (S). A parte inferior da imagem é no sentido da cauda, ou inferior (I). R = direita do animal, L = esquerda do animal. Todas as imagens subsequentes estão na mesma orientação. B) Os órgãos internos foram removidos a partir do embrião em A. A coluna vertebral, costelas e DRG são vistos. Para simplificar, uma costela é rotulado, três GDHs representativos são identificados por círculos pretos e torácica e coluna vertebral lombar é rotulado. C) imagem embrião de galinha Igual a B com uma caixa cinza identificar a região mostrada na higsua ampliação em D. D) Maior aumento da região lombar da coluna vertebral (VC). Três dos onze GDHs nessa visão são identificados por círculos tracejadas. GDH são redondos e encapsulado. Estas características fazem com que seja fácil obter GDHs intactas com uma pinça. E) Um embrião de galinha, após a remoção de órgãos internos e metade ventral da coluna vertebral torácica. Caixa cinza indica a região mostrada com maior ampliação na F. F) da medula espinal (SC) é visto na região onde a coluna vertebral foi removida. Para a parte inferior da imagem, a coluna vertebral lombar (VC) está ainda intacto. 3 de 10 DRGs são identificados pelos círculos a tracejado. DRGs são encontrados entre cada conjunto de nervuras.
Figura 2 neurônios sensoriais primários cultivados immunolabeled para NCAM e β1 integrinas. Neurónios DRG em cultura em concentrações elevadas de laminina-1 são imunopositivas para MACN (A) e β1 integrina (B). C) fusionado imagem de duas manchas revela a maioria das células são positivas tanto para MACN e β1 integrina. Estes neurónios sensoriais aviário são imunopositivas para ambos os marcadores. No entanto, há uma célula, marcado por um asterisco, que é negativo e MACN integrina β1 positiva, consistente com a de células não-neuronais. DF) Maior ampliação de um neurónio sensorial cultivadas mostra neurites que se estendem a partir do corpo da célula. D) Inserção em branco caixa mostra uma ampliação maior do cone de crescimento, na ponta de uma neurite.
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Discussion
Aqui apresentamos protocolos detalhados para isolar e cultura dissociada neurônios sensoriais de um embrião de galinha. Este procedimento gera uma população enriquecida de neurónios em crescimento in vitro de forma robusta 7,8,10,16. Numerosas técnicas celulares e moleculares podem ser aplicados a essas culturas de neurónios, incluindo a imunocitoquímica, o qual é descrito aqui. Este protocolo foi recentemente utilizado para avaliar quantitativamente a intensidade das integrinas ativados imunomarcadas em cones de crescimento sensoriais 8,16. Nesses estudos anteriores, um programa de software foi utilizado para criar um contorno de forma precisa o distal 20 micron final do cone de crescimento. O esboço foi feito com base na coloração NCAM. A expressão ubíqua de NCAM em neurónios activado o programa de software para identificar todo o cone de crescimento em vez de uma porção limitada do cone de crescimento. Este contorno do cone de crescimento foi, em seguida, identificada como uma região de interesse e a intensidade de coloração da integrina que dentro regina de interesse foi avaliada pelo software. Deste modo, a intensidade de uma proteína de interesse pode ser facilmente medido em uma região específica de neurónios sensoriais cultivados.
A fim de obter resultados confiáveis, as seguintes recomendações são fornecidos. Em primeiro lugar, garantir que lamelas são bem lavados com água após HCl incubação em etapas 1,4-1,6. Caso contrário, as moléculas, tais como laminina-1 não irá dispersar bem na lamela. Em segundo lugar, confirmar que são DRG dissociados de forma adequada (passo 3.5), após digestão com tripsina, caso contrário, aglomerados de células formarão e isto irá diminuir a pureza neuronal. Em terceiro lugar, é ideal para incubar células DRG no passo 3.9 para um total de 3 h para se obter uma população pura de neurónios. Se este passo de incubação é encurtada, depois diminuir enxaguamento passos 5.1 e 5.2 para limitar o número de células não-neuronais que estão deslocadas após um tempo de incubação mais curto. Em quarto lugar, garantir que a tensão superficial é mantida durante a aplicação da laminina-1 e Dissoneurônios ciadas para as lamelas. Se a tensão superficial é perdida, a solução vai estender para além da lamela e seco. Isso vai matar os neurônios. Em quinto lugar, a densidade celular ideal deve ser determinada por cada investigador. Estudos anteriores têm banhado 120,00 neurônios / ml e 40.000 neurônios / ml em lamelas revestidas com 1 ug / ml de laminina-1 e 20 ng / ml de laminina-1, respectivamente 8,16. Esta concentração foi baixa o suficiente para permitir que os investigadores a estudar as terminações dos axônios livres (finais que ainda não tinha ligado a outro neurônio). Sexto, durante imunocitoquímica, a certeza de lavar cuidadosamente as células. A remoção ou aplicação de soluções muito rapidamente pode desalojar os neurônios da lamela.
As limitações deste procedimento incluem a janela de pinto DRG dissecção tempo um tanto limitada. GDH podem ser facilmente obtidos a partir de dia embrionário (E) 7-10 embriões de galinha. Embora seja possível obter DRGs mais cedo do que E7, é um pouco difícil. Após E11, mais cartilagem transitions para osso e isso faz com que a dissecção mais difícil. Assim, os estudos que visam comparar embrionário contra neurônios adultos não seria ideal para este modelo de garota, no entanto, estudos anteriores usaram o modelo de rato para comparação idade em GDH 32. Deve-se notar que DRG rato dissecção é mais caro, menos robusto e tecnicamente mais desafiador do que pinto. Outro ponto a considerar é a capacidade de cultura neurônios DRG embrionárias para mudar ao longo do tempo em cultura. Por exemplo, estes neurónios sensoriais expressam diferentes níveis de receptores dentro de 48 horas, dependendo da presença de escolha neurotrofinas 2,30.
Duas subclasses de neurônios DRG pode ser enriquecido pelo uso de neurotrofinas seletivos na mídia 2,12,30. Por exemplo, o factor de crescimento do nervo (NGF) e neurotrofina-3 (NT3), principalmente apoiar a sobrevivência dos neurónios proprioceptivos cutâneas e 33, respectivamente. Os meios de comunicação utilizados no experimento tem tanto NGF e NT3No entanto, isso pode ser facilmente modificado para selecionar tanto para os neurônios sensoriais cutâneos ou proprioceptivos.
Neurônios dissociados são passíveis de inúmeras técnicas de imagem ao vivo, incluindo timelapse imaginação do cone de crescimento motilidade e imagens de cálcio. A mídia usada aqui é vantajoso para imagens de células vivas, porque ele não exige CO 2 para pH buffer da mídia. Assim, a aquisição de dados a partir de células vivas pode ser realizada num microscópio com uma fase aquecida, mas não necessita de manutenção adequados níveis de CO 2. Crescimento velocidade cone, colapso 8,16,30, e cálcio níveis de 17 têm sido estudadas em neurônios sensoriais primários de bico vivas isoladas pela técnica descrita aqui. Além disso, o RNAi pode diminuir com sucesso os níveis de proteína no PINTINHO culta DRG neurônios 34.
O conhecimento adquirido bem definida em modelos in vitro podem ser utilizados como uma base para desenhar experiências essencialem um modelo mais complexo in vivo. Por exemplo, várias abordagens foram usadas em laboratório de prata 35 para estimular a excrescência axonal em um modelo in vitro da cicatriz glial. Da variedade de reagentes testados in vitro, apenas dois (indução da inflamação e a digestão dos proteoglicanos de sulfato de condroitina) pode promover a regeneração axonal. Curiosamente, uma combinação destes dois tratamentos in vivo estimularam a regeneração de axónios dramática e funcional na medula espinal 35. Neste caso, os experimentos in vitro desde uma ferramenta importante para a tela rapidamente para os reagentes que aumentaram axônio conseqüência. Os reagentes que promoveram com sucesso o crescimento do axônio in vitro também foi bem sucedida in vivo, o que também justifica o valor de experimentos de cultura celular.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Alison Philbrook, Belinda Barbagallo e Michael Francis para comentários perspicazes sobre este papel. A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada por um prêmio AREA R15 1R15NS070172-01A1 atribuído a MLL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile small culture dishes (35 mm) | Corning | 430165 | |
| Sterile large culture dishes (100 mm) | Falcon | 353003 | |
| Sterile large Petri dishes (100 mm) | VWR | 89000-302 | |
| Glass Petri dish (100 mm) | VWR | D108962 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Standard forceps | Fine Science Tools | 1100-12 | |
| Coverslips (22 x 22 mm) | Fisher | 12 518 105K | 0.13-0.17 mm thickness is optimal for microscopy |
| Porcelin coverslip holder | Thomas scientific | 8542E40 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 17502-048 | use 50 ml aliquots per 500 ml of Ham's F12 media |
| HCl | VWR | VW3204-1 | use at 2 M, can be used twice before discarding |
| NaCl | Sigma | S9888 | use 5 M NaCl solution for laminin-1 stock solution |
| Laminin-1 | Invitrogen | 23017-015 | Add 72 µl of sterile 5 M NaCl and aliquot into 50 µl |
| 15 ml Conical tube | cell treat | 229411 | |
| PBS CMF 10x | Gibco | 14200 | used at 1x, dilute with sterile Millipore filtered water |
| PBS 10x | Gibco | 14080 | used at 1x, dilute with sterile Millipore filtered water |
| Ham's F12 | Lonza | 12-615F | |
| Fetal Bovine Serum Albumin (BSA) | Gibco | 10438 | use in F12HS20 at 10% |
| HEPES | Sigma | H3375 | make sterile 1 M solution in distilled water, dilute in F12 media to obtain final concentration of 10 mM |
| Penicillin/streptomyocin | Sigma | P0781 | use 5 ml in 500 ml of F12 media |
| NT3 | Millipore | GF031 | Add 1 ml of sterile Millipore water, aliquot under sterile conditions, store at -20 °C, use at final concentration of 10 ng/ml in F12H media, keep in -20 °C non-defrosting freezer |
| NGF | RnD systems | 256-GF | Add 1 ml of sterile 1x PBS with 0.1% BSA, aliquot under sterile conditions, store at -20 °C, used at final concentration of 10 ng/ml in F12H media |
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | aliquot under sterile conditions, store at -20 °C, use at final concentration of 200 mM in F12H media |
| Trypsin | Sigma | T4049 | aliquot under sterile conditions, store at -20 °C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Gibco | 15260 | |
| Other items needed: general dissection instruments, including glass Pasteur pipettes, fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37 °C), cell incubation chamber (humidified, 37 °C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting scope | |||
| Immunocytochemistry Reagents Table | |||
| Sucrose | Sigma | S9378 | used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2x PBS) |
| Triton-X 100 | Sigma | T-8787 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2x PBS) |
| Fluoromount G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Normal goat serum | Life technologies | PCN500 | |
| Microscope slides | VWR | 16004-430 | |
| Primary Antibody Table | |||
| Antibody against NCAM | Millipore | AB5032 | polyclonal |
| Antibody against activated β1 ingegrin | Millipore | MAB19294 | monoclonal |
| Secondary Antibody Table | |||
| Goat anti-mouse IgG Alexa 488 | Life technologies | A11001 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa 548 | Life technologies | A11036 | |
References
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