Summary

Isolamento e Cultura de Dissociated neurônios sensoriais de Chick Embriões

Published: September 24, 2014
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Summary

Modelos de cultura celular proporcionar um controle detalhado sobre as condições ambientais e, assim, proporcionar uma plataforma poderosa para elucidar vários aspectos da biologia celular neuronal. Nós descrevemos um método rápido, barato e confiável para isolar, dissociar e cultura neurônios sensoriais a partir de embriões de galinha. Os detalhes da preparação substratos e imunocitoquímica também são fornecidos.

Abstract

Os neurônios são as células multifacetadas que carregam informações essenciais para uma variedade de funções, incluindo a sensação, movimento motor, aprendizagem e memória. Estudar neurônios in vivo pode ser um desafio, devido à sua complexidade, seus ambientes variados e dinâmicos, e as limitações técnicas. Por estas razões, estudando neurônios in vitro pode ser benéfico para desvendar os mistérios complexos de neurônios. A natureza bem definida de modelos de cultura celular fornece controle detalhado sobre as condições ambientais e variáveis. Aqui nós descrevemos como isolar, dissociar, e neurônios cultura primária de embriões de galinha. Esta técnica é rápida, barata, robusta e gera crescente neurónios sensoriais. O procedimento produz consistentemente culturas que estão altamente enriquecidas em neurónios e tem muito poucas células não neuronais (menos do que 5%). Neurônios primários não adere bem ao vidro não tratada ou de cultura de tecidos de plástico, portanto, os procedimentos detalhados para criar dois disct, substratos contendo laminina bem definida para o chapeamento neuronais são descritos. Neurônios cultivados são altamente suscetíveis a várias técnicas celulares e moleculares, incluindo a co-imunoprecipitação, imaginação de células vivas, RNAi, e imunocitoquímica. Procedimentos para imunocitoquímica duas vezes nesses neurônios cultivados foram otimizados e descrito aqui.

Introduction

Os neurônios são células complexas que levam informações essenciais para uma variedade de funções, incluindo a sensação, visão, movimento motor, aprendizagem e memória. Único a partir de outros tipos de células, os neurônios estender os processos de braço-like, chamadas axônios, para formar rodovias neurais essenciais para a comunicação. Durante o desenvolvimento especializada compartimentos localizados na ponta dos axônios em crescimento, chamados cones de crescimento, navegar através de um concerto de sinais extracelulares para liderar o axônio para o seu destino apropriado. Os mecanismos moleculares que estão na base intrincadas do cone de crescimento de navegação não são completamente compreendidos. Para entender melhor esses mecanismos, os pesquisadores usaram modelos de cultura de células para estudar neurônios em um ambiente vitro definido e simplificado. Estudar neurônios em cultura 1 levou a avanços significativos em nossa compreensão da biologia de células neuronais, incluindo: a diferenciação neuronal 2, a dinâmica do citoesqueleto, endocitose e tráfico, dendritoregulação 3,4, a regeneração axonal 5, e as condições clínicas, tais como neuropatias 6. Além disso, os neurónios em cultura são altamente susceptível a uma vasta gama de técnicas de pesquisa, incluindo a imunocitoquímica, de células da superfície de co-imunoprecipitação, transferência Western, transfecção, ARNi, e imagens em tempo real, tais como análise de Timelapse cone de crescimento motilidade. Assim, a cultura de neurônios primários é uma abordagem poderosa para elucidar vários aspectos da biologia celular dos neurônios.

O modelo de cultura celular fornece investigadores com controle detalhado sobre as condições ambientais e variáveis. Por exemplo, o substrato sobre o qual os neurónios foram semeadas (e crescer em cima) pode ser facilmente manipulado. Aqui, nós fornecemos instruções detalhadas para a geração de dois substratos distintos, um com uma baixa concentração de laminina-1 e outro com concentrações de saturação de laminina-1. Surpreendentemente, concentrações diferentes da mesma molécula pode ter efeitos dramáticossobre o estado interno de neurónios, bem como a sua composição da superfície da célula. Por exemplo, os níveis intracelulares de cAMP e níveis de superfície de integrinas são significativamente diferentes nos neurónios plaqueados sobre estes dois substratos 7,8. Outros estudos têm mostrado que outras moléculas, incluindo fibronectina e proteoglicanos de sulfato de condroitina, o impacto da expressão de moléculas da superfície celular e a motilidade neuronal 7-11. Além disso, as moléculas solúveis, tais como neurotrofinas e neurotropins também afectar a composição da membrana celular e a motilidade neuronal e 12-16 podem ser facilmente e com precisão manipulado em um modelo de cultura de células.

Aqui, descrevemos os métodos para isolar e cultura dissociada neurônios sensoriais a partir de embriões de galinha. Este procedimento tem sido usado para fazer avanços significativos em neurobiologia, incluindo axônio conseqüência 5,7,8,10,11,16-21 e foi modificado a partir de um procedimento destinado a isolar as células ganglionares 22. Temvárias vantagens para esta abordagem. Em primeiro lugar, muitas características da garota gânglio da raiz dorsal (DRG) desenvolvimento estão bem caracterizados, incluindo o período de tempo para o parto, a extensão do axônio, e expressão da proteína perfis 2,23-28, proporcionando assim uma base instrutiva sobre a qual construir informativo experimentos in vitro. Em segundo lugar, dissociado culturas neuronais permitem ao investigador para estudar mais directa em comparação com os neurónios de abordagens alternativas que utilizam explantes DRG intactos (que contêm neurónios e células não neuronais) e / ou culturas mistas que contêm ambos os neurónios dissociados e células não-neuronais. Em terceiro lugar, o procedimento descrito aqui é simples, barato e passível de graduação. Portanto, essa técnica pode ser usada para pesquisa, bem como para fins de ensino. Além disso, pequenas variações deste protocolo deve permitir a purificação rápida, alto rendimento de neurônios a partir de outras fontes de GDH. Por exemplo, este procedimento pode ser modificado para proporcionar neuronalmente enriched culturas de outros tecidos, tais como prosencéfalo embrionário ou da medula espinal.

Imunocitoquímica protocolos foram optimizados para estas culturas neuronais dissociadas e são descritos em detalhe aqui. O procedimento para a imunocitoquímica dupla contra molécula de adesão de células neurais (NCAM) e integrinas β1 é fornecido. Os dados gerados a partir destes métodos imunocitoquímicos foram utilizados para examinar o padrão espacial e intensidade de várias moléculas em neurónios cultivados 8,16.

Protocol

1. Coverslip Preparação: lavagem ácida e Bake Pelo menos 2 dias antes da dissecção (passo 2), começam as seguintes etapas para preparar lamelas. Execute o passo de lavagem de ácido para remover óleos e lamelas completamente limpas. Lamelas de carga em suporte de porcelana que posiciona verticalmente lamelas e impede que eles se toquem. Submergir titular e lamelas em recipiente de vidro cheio histologia com ácido clorídrico 2 M (HCl). Alternativamente, se o titular de porcelana não está d…

Representative Results

O protocolo aqui descrito permite que os investigadores a cultura de uma população enriquecida de neurónios sensoriais dissociados de embriões com muito poucas células (por exemplo, <5%) não neuronais 7,8,10,16. Numerosos GDHs pode ser obtido a partir da região cervical lombossacral, torácicas e. Dependendo das necessidades do investigador, DRGs destas regiões anatómicas distintas pode ser facilmente isolado. Por exemplo, a Figura 1 mostra imagens do embrião de galinha …

Discussion

Aqui apresentamos protocolos detalhados para isolar e cultura dissociada neurônios sensoriais de um embrião de galinha. Este procedimento gera uma população enriquecida de neurónios em crescimento in vitro de forma robusta 7,8,10,16. Numerosas técnicas celulares e moleculares podem ser aplicados a essas culturas de neurónios, incluindo a imunocitoquímica, o qual é descrito aqui. Este protocolo foi recentemente utilizado para avaliar quantitativamente a intensidade das integrinas ativados imu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gostaríamos de agradecer a Alison Philbrook, Belinda Barbagallo e Michael Francis para comentários perspicazes sobre este papel. A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada por um prêmio AREA R15 1R15NS070172-01A1 atribuído a MLL.

Materials

sterile small culture dishes (35mm) Corning 430165
sterile large culture dishes (100mm) Falcon 353003
sterile large petri dishes (100mm) VWR 89000-302
glass petri dish (100mm) VWR D108962 
fine forceps Fine Science Tools 11251-10 
standard forceps Fine Science Tools 1100-12
coverslips  (22×22) Fisher 12 518 105K 0.13-0.17 mm thickness is optimal for microscopy
porcelin coverslip holder Thomas scientific 8542E40
Fetal Bovine serum Gibco 17502-048 use 50ml aliquots per 500 mls of Ham's F12 media 
HCL VWR VW3204-1 use at 2M, can be used twice before discarding
NaCl Sigma S9888 use 5M NaCl solution for laminin-1 stock solution
laminin-1 Invitrogen 23017-015 Add 72ul of sterile 5M NaCl and aliquot into 50ul
15 ml conical tube cell treat 229411
PBS CMF 10X Gibco 14200 used at 1X, dilute with sterile millipore filtered water
PBS 10X Gibco 14080 used at 1X, dilute with sterile milliporee filtered water
Ham's F12 Lonza 12-615F
Fetal Bovine Serum Albumin (BSA) Gibco 10438 use in F12HS20 at 10%
HEPES Sigma H3375 make sterile 1M solution in distilled water, dilute in F12 media to obtain final concentration of 10mM
Penicillin streptomyocin Sigma P0781 use 5mls in 500mls of F12 media
NT3 Millipore GF031 Add 1ml of sterile millipore water, aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, use at final concentration of 10ng/ml in F12H media, keep in -20 C  non-defrosting freezer 
N2 Invitrogen 17502048  aliquot under sterile conditions,stored at -20 0C,  use 100ul per 10ml of F12H media
NGF RnD systems 256-GF Add 1ml of sterile 1X PBS with 0.1% BSA, aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, usd at final concentration of 10 ng/ml in F12H media 
l-glutamine Sigma G7513 aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, use at final concentration of 200mM in F12H media
Trypsin Sigma T4049 aliquot under sterile conditions, store at -20 0C
Bovine Serum Albumin (BSA) Gibco 15260
Other items needed:  general dissection instruments, including  glass pasteur pipettes, fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37 degrees C), cell incubation chamber (humidified, 37  degrees C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting scope
Immunocytochemistry Reagents Table
Sucrose Sigma S9378 used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2X PBS) 
Triton-X 100 Sigma T-8787
Paraformaldehyde Sigma P6148 used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2X PBS) 
Fluoromount G Southern Biotech 0100-01
normal goat serum Life technologies PCN500
microscope slides VWR 16004-430
Primary Antibody Table
Antibody against NCAM Millipore AB5032 polyclonal
Antibody against activated beta 1 ingegrin Millipore MAB19294 monoclonal
Seconday Antibody Table
Goat anti-mouse IgG Alexa 488 Life technologies A11001
Goat anti-rabbit IgG Alexa 548 Life technologies A11036

References

  1. Millet, L. J., Gillette, M. U. Over a century of neuron culture: from the hanging drop to microfluidic devices. The Yale journal of biology and medicine. 85, 501-521 (2012).
  2. Guan, W., Puthenveedu, M. A., Condic, M. L. Sensory neuron subtypes have unique substratum preference and receptor expression before target innervation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 1781-1791 (2003).
  3. Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Which way to go? Cytoskeletal organization and polarized transport in neurons. Molecular and cellular neurosciences. 46, 9-20 (2011).
  4. Kapitein, L. C., Yau, K. W., Hoogenraad, C. C. Microtubule dynamics in dendritic spines. Methods in cell biology. 97, 111-132 (2010).
  5. Snow, D. M. Pioneering studies on the mechanisms of axonal regeneration. Developmental neurobiology. 71, 785-789 (2011).
  6. Melli, G., Hoke, A. Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies. Expert opinion on drug discovery. 4, 1035-1045 (2009).
  7. Condic, M. L., Letourneau, P. C. Ligand-induced changes in integrin expression regulate neuronal adhesion and neurite outgrowth. Nature. 389, 852-856 (1997).
  8. Lemons, M. L., Condic, M. L. Combined integrin activation and intracellular cAMP cause Rho GTPase dependent growth cone collapse on laminin-1. Experimental neurology. 202, 324-335 (2006).
  9. Beller, J. A., et al. Comparison of sensory neuron growth cone and filopodial responses to structurally diverse aggrecan variants, in vitro. Experimental neurology. 247, 143-157 (2013).
  10. Condic, M. L., Snow, D. M., Letourneau, P. C. Embryonic neurons adapt to the inhibitory proteoglycan aggrecan by increasing integrin expression. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 19, 10036-10043 (1999).
  11. Lemons, M. L., Barua, S., Abanto, M. L., Halfter, W., Condic, M. L. Adaptation of sensory neurons to hyalectin and decorin proteoglycans. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 4964-4973 (2005).
  12. Guan, W., Condic, M. L. Characterization of Netrin-1, Neogenin and cUNC-5H3 expression during chick dorsal root ganglia development. Gene Expr Patterns. 3, 369-373 (2003).
  13. Guan, W., Wang, G., Scott, S. A., Condic, M. L. Shh influences cell number and the distribution of neuronal subtypes in dorsal root ganglia. Developmental biology. 314, 317-328 (2008).
  14. Kolpak, A., Zhang, J., Bao, Z. Z. Sonic hedgehog has a dual effect on the growth of retinal ganglion axons depending on its concentration. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 3432-3441 (2005).
  15. Kolpak, A. L., et al. Negative guidance factor-induced macropinocytosis in the growth cone plays a critical role in repulsive axon turning. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 10488-10498 (2009).
  16. Lemons, M. L., et al. Integrins and cAMP mediate netrin-induced growth cone collapse. Brain research. 1537, 46-58 (2013).
  17. Snow, D. M., Atkinson, P. B., Hassinger, T. D., Letourneau, P. C., Kater, S. B. Chondroitin sulfate proteoglycan elevates cytoplasmic calcium in DRG neurons. Developmental biology. 166, 87-100 (1994).
  18. Snow, D. M., Brown, E. M., Letourneau, P. C. Growth cone behavior in the presence of soluble chondroitin sulfate proteoglycan (CSPG), compared to behavior on CSPG bound to laminin or fibronectin. Int J Dev Neurosci. 14, 331-349 (1996).
  19. Snow, D. M., Lemmon, V., Carrino, D. A., Caplan, A. I., Silver, J. Sulfated proteoglycans in astroglial barriers inhibit neurite outgrowth in vitro. Experimental neurology. 109, 111-130 (1990).
  20. Snow, D. M., Letourneau, P. C. Neurite outgrowth on a step gradient of chondroitin sulfate proteoglycan (CS-PG). Journal of neurobiology. 23, 322-336 (1992).
  21. Snow, D. M., Mullins, N., Hynds, D. L. Nervous system-derived chondroitin sulfate proteoglycans regulate growth cone morphology and inhibit neurite outgrowth: A light, epifluorescence, and electron microscopy study. Microsc Res Tech. 54, 273-286 (2001).
  22. Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning. Neuron. 1, 791-803 (1988).
  23. Firnhaber, C., Hammarlund, M. Neuron-specific feeding RNAi in C. elegans and its use in a screen for essential genes required for GABA neuron function. PLoS genetics. 9, e1003921 (2013).
  24. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 195, 231-272 (1992).
  25. Hollyday, M. Chick wing innervation. I. Time course of innervation and early differentiation of the peripheral nerve pattern. The Journal of comparative neurology. 357, 242-253 (1995).
  26. Hollyday, M., Morgan-Carr, M. Chick wing innervation. II. Morphology of motor and sensory axons and their growth cones during early development. The Journal of comparative neurology. 357, 254-271 (1995).
  27. Honig, M. G., Kueter, J. The expression of cell adhesion molecules on the growth cones of chick cutaneous and muscle sensory neurons. Developmental biology. 167, 563-583 (1995).
  28. Tosney, K. W., Landmesser, L. T. Development of the major pathways for neurite outgrowth in the chick hindlimb. Developmental biology. 109, 193-214 (1985).
  29. Dontchev, V. D., Letourneau, P. C. Nerve growth factor and semaphorin 3A signaling pathways interact in regulating sensory neuronal growth cone motility. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 6659-6669 (2002).
  30. Munoz, L. M., et al. Ephrin-A5 inhibits growth of embryonic sensory neurons. Developmental biology. 283, 397-408 (2005).
  31. Roche, F. K., Marsick, B. M., Letourneau, P. C. Protein synthesis in distal axons is not required for growth cone responses to guidance cues. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 638-652 (2009).
  32. Condic, M. Adult neuronal regeneration induced by transgenic integrin expression. Journal of Neuroscience. 21, 4782-4788 (2001).
  33. Hory-Lee, F., Russell, M., Lindsay, R. M., Frank, E. Neurotrophin 3 supports the survival of developing muscle sensory neurons in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2613-2617 (1993).
  34. Toyofuku, T., et al. FARP2 triggers signals for Sema3A-mediated axonal repulsion. Nature neuroscience. 8, 1712-1719 (2005).
  35. Steinmetz, M. P., et al. Chronic enhancement of the intrinsic growth capacity of sensory neurons combined with the degradation of inhibitory proteoglycans allows functional regeneration of sensory axons through the dorsal root entry zone in the mammalian spinal cord. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 8066-8076 (2005).

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Cite This Article
Powell, S., Vinod, A., Lemons, M. L. Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos. J. Vis. Exp. (91), e51991, doi:10.3791/51991 (2014).

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