Summary
Zellkulturmodelle bieten detaillierte Kontrolle über Umweltbedingungen und damit eine leistungsfähige Plattform, um zahlreiche Aspekte neuronaler Zellbiologie aufzuklären. Wir beschreiben eine schnelle, kostengünstige und zuverlässige Methode, um von Hühnerembryonen zu isolieren, zu dissoziieren, und die Kultur sensorischen Neuronen. Details der Substrate Vorbereitung und Immunzytochemie sind ebenfalls vorhanden.
Abstract
Neuronen sind vielfältig Zellen, die wesentlichen Informationen für eine Vielzahl von Funktionen, einschließlich Sensation, Motorbewegung, Lernen und Gedächtnis zu tragen. Studium Neuronen in vivo kann eine Herausforderung sein aufgrund ihrer Komplexität, ihrer abwechslungsreichen und dynamischen Umgebungen und technische Grenzen. Aus diesen Gründen, Studium Neuronen in vitro kann von Vorteil sein, um die komplexen Geheimnisse von Neuronen zu entwirren. Die gut definierte Art der Zellkulturmodellen bietet detaillierte Kontrolle über Umweltbedingungen und Variablen. Hier beschreiben wir, wie zu isolieren, zu distanzieren und Kultur primären Neuronen aus Hühnerembryonen. Diese Technik ist schnell, billig und erzeugt ein robustes Wachstum sensorischen Neuronen. Das Verfahren konsequent produziert Kulturen hoch Neuronen angereichert sind und nur sehr wenige nicht-neuronale Zellen (weniger als 5%). Primären Neuronen nicht gut an unbehandeltem Glas oder Kunststoffgewebekultur, daher detaillierte Verfahren zu zwei Distin erstellenCT, gut definierte Laminin enthaltenden Substraten für neuronale Plattierung beschrieben. Kultivierten Neuronen sind sehr gut für mehrere zelluläre und molekulare Techniken, einschließlich Co-Immunopräzipitation, Live Cell Vorstellung, RNAi, und Immunzytochemie. Verfahren für die Doppel Immunzytochemie auf diesen kultivierten Neuronen wurden optimiert und hier beschrieben.
Introduction
Neuronen sind komplexe Zellen, die wesentlichen Informationen für eine Vielzahl von Funktionen, einschließlich Sensation, Vision, Motorbewegung, Lernen und Gedächtnis zu tragen. Einzigartig von anderen Zelltypen, Neuronen erstrecken Arm-wie Prozesse, die so genannte Axone, um wesentliche neuronale Autobahnen für die Kommunikation zu bilden. Während der Entwicklung spezialisiert Fächer an den Spitzen der wachsenden Axone, dem sogenannten Wachstumskegel, navigieren durch ein Konzert der extrazelluläre Signale, die Axon seine entsprechenden Ziel führen. Die komplizierten molekularen Mechanismen, die Wachstumskegel Navigation zugrunde liegen, sind nicht vollständig verstanden. Um diese Mechanismen besser zu verstehen, haben Forscher Zellkulturmodelle verwendet werden, um Nervenzellen in einem definierten und vereinfacht in vitro-Umgebung zu studieren. Neuronalen Differenzierung 2, Zytoskelett-Dynamik, Endozytose und Menschenhandel, Dendriten: Studieren Neuronen in Kultur 1 hat zu erheblichen Fortschritte in unserem Verständnis der neuronalen Zellbiologie einschließlich geführtRegulation 3,4, axonale Regeneration 5 und klinischen Zuständen, wie Neuropathien 6. Außerdem sind kultivierten Neuronen sehr gut für einen weiten Bereich von Forschungstechniken einschließlich Immunzytochemie Zelloberfläche co-Immunpräzipitation, Western Blot, Transfektion, RNAi, und die Bildgebung wie Zeitraffer Analyse der Wachstumskegel Motilität. So Kultivierung primären Neuronen ist ein leistungsfähiges Konzept für zahlreiche Aspekte der Zellbiologie von Neuronen aufzuklären.
Die Zellkultur-Modell bietet die Ermittler mit detaillierten Kontrolle über Umweltbedingungen und Variablen. Zum Beispiel kann der Substrate, auf denen Neuronen beschichtet (und wachsen auf) leicht manipuliert werden. Hier bieten wir detaillierte Anweisungen zur Erzeugung zwei unterschiedliche Substrate, eines mit einem niedrigen Laminin-1-Konzentration und das andere mit sättigenden Konzentrationen von Laminin-1. Überraschenderweise können unterschiedliche Konzentrationen des gleichen Moleküls dramatische Effekteauf dem internen Zustand der Neuronen sowie ihre Zelloberflächenzusammensetzung. Zum Beispiel sind intrazelluläre Niveaus von cAMP und der Oberflächenpegel der Integrine in Neuronen auf diesen beiden Substraten 7,8 plattiert signifikant unterschiedlich. Weitere Studien haben gezeigt, dass auch andere Moleküle, einschließlich Fibronektin und Chondroitinsulfatproteoglycane, Auswirkungen der Expression von Zelloberflächenmolekülen und neuronale Motilität 7-11. Weiterhin lassen sich lösliche Moleküle wie Neurotrophine und Neurotropine auch Auswirkungen Zellmembran Zusammensetzung und neuronalen Motilität 12-16 und kann in einem Zellkulturmodell leicht und genau bearbeitet werden.
Hier beschreiben wir Methoden zur Isolierung und Kultur dissoziiert sensorischen Neuronen von Hühnerembryonen. Dieses Verfahren wurde verwendet, um bedeutende Durchbrüche in der Neurobiologie, einschließlich Axon Auswuchs 5,7,8,10,11,16-21 machen und wurde von einem Verfahren entwickelt, um Ganglienzellen zu isolieren, 22 modifiziert. Es gibtmehrere Vorteile dieses Ansatzes. Zunächst werden viele Funktionen von Küken Hinterwurzelganglien (DRG) Entwicklung gut charakterisiert, einschließlich der Zeitrahmen für die Geburt, Axon Verlängerung und Proteinexpressionsprofile 2,23-28 und dadurch eine Grundlage, auf der lehr zu bauen informativ in-vitro-Experimenten. Zweitens, dissoziiert neuronalen Kulturen ermöglichen die Ermittler mehr direkt zu Nervenzellen zu untersuchen, verglichen mit alternativen Ansätzen mit intaktem DRG-Explantaten (die Neuronen und nicht-neuronalen Zellen enthalten) und / oder Mischkulturen, die sowohl dissoziierten Neuronen und nicht-neuronalen Zellen. Drittens ist das hier beschriebene Verfahren unkompliziert, kostengünstig und zugänglich für Studenten. Daher kann diese Technik für die Forschung als auch für Lehrzwecke verwendet werden. Außerdem sollten kleinere Variationen dieses Protokoll schnell, hohe Ausbeute Reinigung von Neuronen aus anderen Quellen als DRGs zu ermöglichen. Zum Beispiel könnte das Verfahren modifiziert, um neuronal bereitzustellen ENRiched Kulturen aus anderen Geweben, wie embryonalen Vorderhirns und des Rückenmarks.
Immunzytochemie Protokolle für diese dissoziierten neuronalen Kulturen optimiert und werden im Detail hier beschrieben. Das Verfahren für die Doppel Immunzytochemie gegen neuronale Zelladhäsionsmolekül (NCAM) und β1 Integrine ist. Aus diesen immunzytochemische Methoden erzeugten Daten werden verwendet, um die räumliche Musterung und Intensität von mehreren Molekülen in kultivierten Neuronen 8,16 untersuchen.
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Protocol
1. Deckglas Zubereitung: Acid-Waschung und Backen
- Mindestens 2 Tage vor der Dissektion (Schritt 2), beginnen die folgenden Schritte zur Deck vorzubereiten. Führen Sie den Säurewaschschritt, um Öle und gründlich sauber Deckgläser zu entfernen.
- Ladedeck Porzellan Halter, die vertikal positioniert Deck und verhindert, dass sie sich berühren. Tauchen Halter und Deckglas in der Histologie Behälter mit 2 M Salzsäure (HCl) gefüllt. Alternativ, wenn Porzellan Halter nicht verfügbar ist, zu verbreiten ~ 20 Deckgläser horizontal, um den Boden von 100 mm Glaspetrischale abdecken und tauchen Deckgläser in 2 M HCl.
- Zeigen Glasgefäß (mit Deckgläsern in Säure getaucht) auf Wippe Tabelle in Abzug und lassen sanfte Schaukel für mindestens 5 Stunden bei Raumtemperatur. Alternativ Deckgläser Säurewäsche über Nacht unter den gleichen Bedingungen.
- Waschen Deckgläser mit destilliertem H 2 O (dH 2 O) durch Über Porzellan Halter geladenenmit Deckgläsern von 2 M HCl auf einen sauberen Glasbehälter mit der Histologie dH 2 O gefüllt Alternativ dekantieren 2 M HCl aus Glaspetrischale mit Deckgläsern und füllen dH 2 O.
- Waschen durch Dekantieren dH 2 O wieder und Nachfüllen Glasgefäß mit frischem dH 2 O. Wiederholen Sie dies für insgesamt 3 schnelle Wäschen.
- Beginnen Sie längere Wasch Regime durch Rücksendung Glasgefäß (mit Deckgläsern und dH 2 O) auf Rocker. Ermöglichen leichtem Schütteln für 10-30 min bei Raumtemperatur. Dann dekantieren dH 2 O und fügen Sie frisches dH 2 O. Wiederholen von insgesamt mindestens zehn Wäschen. Alternativ weiterhin Waschen über Nacht.
- Platzieren gewaschen Deckgläser in den Ofen auf 350 ° C vorgewärmt. Bei der Verwendung von Porzellanhalter, entfernen Halter aus dH 2 O gefüllten Glasbehälter und legen Sie dann Halter mit Deckgläsern direkt in den Ofen. Bei Verwendung einer Glaspetrischale, dekantieren dH 2 O und legen Sie die Glasschale mit Deckgläsern in die furnace.
- Bake Deckgläser für mindestens fünf Stunden oder über Nacht bei 350 ° C aufweist.
- Nach der vollständigen Back ist, entfernen Deckgläser aus Porzellan Halter mit feinen Pinzette und legen in sterile 100 mm Glaspetrischale. Deckgläser lassen, die ursprünglich nicht in der Porzellanhalter in der Glaspetrischale wurden.
2. Küken Dissection und Isolierung von DRGs
- Entfernen fruchtbar, inszeniert White Leghorn-Küken Ei aus Inkubator (bei 37 bis 38,5 ° C auf dem Schüttler gehalten).
HINWEIS: Frühere Studien haben embryonalen Tag 7-10 für die Isolierung von DRGs 2,8,11-13,16 verwendet. - Ort Ausgewählter Ei in Laminarströmungshaube. Führen alle unten unter aseptischen Bedingungen in der Sterilbank mit sterilen Lösungen und Instrumente aufgeführten Verfahren. Pre-warmen alle Lösungen in einem 37 ° C Wasserbad.
- Knacken Ei und Ort Inhalt in einem Kunststoff 100 mm Petrischale. Verwenden Sie Standard-Pinzette Embryo zu einem anderen 100 mm Petrischale übertragen.
- Mit warmem F12HS10 (Ham-F12, 10 mM HEPES, 100 Einheiten / ml Penicillin, 0,1 mg / ml Streptomycin, das 10% fetales Rinderserum) mit Pasteur-Pipette austeilen, um Gewebe feucht zu halten. Verwenden Pinzette Embryo auf seiner dorsalen Seite (1A) zu positionieren.
- Zeigen 100 mm Kunststoff-Petrischale mit embryonalem Gewebe auf ein Fernglas Binokular Stereo in Laminarströmungshaube. Verwenden feinen Pinzette, um eine vertikale Mittellinienschnitt vom Schwanz bis zum Hals durch Kneifen den Entwicklungs Dermis, das Herz, Lunge und andere Organe aussetzen zu machen. Alternativ können Sie eine Reihe von kleinen Tränen in die inneren Organe aus.
- Vorsichtig mit 2 Sets von sterilen feinen Pinzette zu: a) begreifen, die Hals und b) erfassen die Aorta oder anderes Gewebe unmittelbar über dem Herzen und ziehen in Richtung des Schwanzes,Ausnehmen des Tieres.
- Werden, warmes F12HS10 mit Pasteur-Pipette, um Gewebe. Verwenden einer Pinzette, um alle verbleibenden Herz-Kreislauf, Atemwege oder Verdauungsorgane entfernen, um die Entwicklung von Rippen, Wirbelsäule und DRGs (1B-1D) aus.
- Unter dem Binokular, verwenden feinen Pinzette die Organe weiter zu entfernen und sammeln DRGs auf beiden Seiten der Lendenwirbelsäule, schlechter als die Rippen. Sammeln DRGs durch Zupfen intakt DRGs aus dem Embryo. Kneifen und durchtrennen die Wurzeln, die von der DRG in Richtung des Rückenmarks zu erreichen und das Greifen der Entwicklungs Nerv, der von der DRG in Richtung der Peripherie oder umgekehrt erreicht.
- Zeigen intakt DRGs in eine 35 mm Kulturschale mit warmem F12HS10 gefüllt. Entfernen Sie überschüssiges Gewebe, wie die dorsale oder ventrale Wurzeln, die DRGs festgesetzt haben, von den intakten DRGs in 35 mm-Schale durch Kneifen mit feinen Pinzette.
- Um DRGs überlegen Lendenbereich zu erhalten, entfernen Sie die ventrale Hälfte des Brustraums und Cervical Wirbelsäule. Dies wird durch einen Schnitt in der Entwicklungs Wirbelsäule senkrecht zur Achse der Wirbelsäule im oberen Halsbereich und einem anderen Schnitt im oberen Lendenwirbelbereich erfolgen. Dann stellen Schnitte parallel zum Rückenmark-Achse entlang der rechten und der linken Seite der Wirbelsäule. Heben Sie die ventrale Hälfte der Wirbelsäule aus dem Embryo, der das macht die Rückenmark (1E-1F) aussetzt.
- Einen einfachen Zugang zu ermöglichen DRGs, entfernen Sie die Brust-und Halsmark durch Ergreifen des Rückenmarks mit einer feinen Pinzette. Verwenden Sie die Pinzette, um das Rückenmark aus der Wirbelsäule zu heben. Näherungsweise ist die thorakale Wirbelsäule in der Ebene der Rippen und der Halsbereich ist besser als die Rippen.
- Sammeln intakten Brust-und Gebärmutterhalskrebs DRGs mit feinen Pinzette und legen Sie sie in den warmen F12HS10 mit anderen DRGs. Entfernen Sie überschüssiges Gewebe, das DRGs haften kann.
- Spülen Innere eines neuen Glaspasteurpipette mit F12HS10 zu helfenDRGs verhindern das Anhaften von Wänden der Pipette. Verwenden gespült Pipette, um alle DRGs und F12HS10 von kleinen Petrischale in ein steriles 15 ml konischen Röhrchen übertragen und sofort mit Schritt 3 fort.
HINWEIS: Zusätzliche Embryonen können zerlegt werden um die Anzahl der DRGs zu erhöhen. DRGs sollte in F12HS10 bei 37 ° C, bis sie für Schritt 3 gehalten werden.
3. Dissoziation, Anreicherung und Züchtung DRG-Neuronen - Teil 1
- Ort konischen Rohr mit intakten DRGs in Zentrifugen und sanft drehen (200 × g) für 2-3 min. Bestätigen Sie, dass DRGs haben den Boden des Röhrchens versenkt. Wenn nicht, drehen Sie es erneut.
- Mit einer Pipette vorsichtig entfernen F12HS10, so dass DRG-Pellet ungestört. 2 ml 1x Calcium und Magnesium kostenlos (CMF) PBS, verdrängen das Pellet der DRGs. Spin wieder entfernen und CMF PBS während das DRG-Pellet intakt. Dieser Waschschritt wiederholt für insgesamt drei Waschungen fötalen Rinderserum in F12HS10, die mit Trypsin Verdauung im nächsten Schritt stören würde entfernen.
- 2 ml Trypsin, erwärmt auf 15 ml-Röhrchen mit 2 ml PBS-CMF und DRGs. Das Röhrchen in 37 ° C Wasserbad für 10-15 min auf DRGs in dissoziierten Zellen zu verdauen.
- Während der Inkubation machen F12H + Ergänzung mit Medium (Ham-F12, 10 mM HEPES 100 Einheiten / ml Penicillin, 0,1 mg / ml Streptomycin, 10 ng / ml NT3, 10 ng / ml NGF, 200 mM L-Glutamin und N2) und Warm in 37 ° C Wasserbad. Typischerweise ist 10 ml Gesamt Medien reicht für 4-5 35 mm Gerichte der primären sensorischen Neuronen. Auch beginnen Auftauen Laminin-1 für die Beschichtung von Deckgläsern (Schritt 4).
- Sanft verreiben DRGs in Trypsin-Lösung mit p1000 Pipette und einer Sichtprüfung auf Abwesenheit von intakten DRGs. Weiterhin intakt, bis Verreiben DRGs werden nicht mehr von Auge gesehen und / oder erlauben mehr Trypsin Inkubation in 37 ° C warmes Wasserbad, bis intakt DRGs dissoziiert sind. DRG-Neuronen vor Schäden zu schützen, vermeiden Sie Luftblasen beim Verreiben und Trypsin Verdauung auf <30 min zu begrenzen.
- Centrifuge Röhrchen mit dissoziiert DRGs und Trypsin bei 200 g für 3-5 min zu Pellets zu bilden. Mehr drehen, wenn nötig, bis Pellet gebildet.
- Sorgfältig absaugen Trypsin ohne Unterbrechung Pellets. 2 ml F12HS10 zu pelletieren. Sanft verreiben DRGs mit einem P1000 Pipettenspitze.
- Übertragen Sie alle Inhalte aus 15 ml konischen Röhrchen in 100 mm Kulturschale. Spülen des Röhrchens mit 8 ml F12HS10 und übertragen sie in die Kulturschale, 2 ml in einer Zeit von insgesamt 10 ml auf. Dieser Schritt hilft Spülen sammeln Zellen, blieb an den Wänden der Röhre eingehalten haben.
- Platzieren 100 mm Kulturschale (10 ml F12HS10 und dissoziierten DRG Zellen) in einem befeuchteten Inkubator 37 ° C für 3 Stunden.
HINWEIS: CO 2 nicht in den Inkubator erforderlich, da HEPES-Puffer pH Medien in Abwesenheit von CO 2. Während der Inkubation binden an Gliazellen Oberfläche der Gewebekulturkunststoff und Neuronen dazu neigen, lose an Gliazellen Bett einzuhalten.
4. Beschichtung Acid WashedGebackene und Deckgläser mit Laminin-1
- Auftauen sterile Aliquots von gefrorenen Laminin-1 auf Eis.
- Unter sterilen Bedingungen, 1 ml steriler PBS 1x 50 ul Aliquot von Laminin-1.
- Verwenden Sie ein Spektrophotometer, um einen Absorptionswert von Laminin-1 bei 280 nm zu erhalten. Verwenden Sie diesen Wert in der folgenden Gleichung, um die Konzentration von Laminin-1 zu bestimmen.
ABS = 280 (Konzentration mg / ml) * (Extinktionskoeffizient von Protein)
Der Extinktionskoeffizient für Laminin-1 ist 0,86.
- Unter sterilen Bedingungen verdünnter Laminin-1 mit 1X PBS, um die Konzentrationen von 1 mg / ml und 20 mg / ml zu erhalten. Mit diesen beiden Anwendungskonzentrationen von Laminin-1, um eine zehnfache Differenz der Laminin-1 an das Deckglas (30 ng / cm 2 und 300 ng / cm 2, bzw.) nach Inkubation 7,8,10 gebunden zu erzielen.
- In einer Steril, feinen Pinzette verwenden, um eine Säure gewaschen und gebacken c legenoverslip in den Boden einer 35 mm Petrischale. Bei Bedarf wiederholen, um die Anzahl der Gerichte erforderlich zu erhalten.
- Unterwerfen die Deckgläser mit UV-Licht für 20-30 min, um weiter sicherzustellen Sterilisation. Schalendeckel halten während dieser Schritt.
- Fügen Sie 400 ul bereit Laminin-1 zu jedem Deckglas. Verwenden Pipettenspitze an Laminin-1 verteilt, um eine vollständige Abdeckung der Deckglas zu gewährleisten. Oberflächenspannung ermöglicht Laminin-1 auf Deckglas bleiben und nicht auf Boden der Kulturschale, die erforderlich ist, zu verbreiten.
- Platzieren Deckelschale auf und lassen Laminin-1, für 2-3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert (3 h ist optimal).
- Nach Laminin-1 Inkubation spülen Deckgläser unter aseptischen Bedingungen mit sterilem PBS in Laminarströmungshaube. Entfernen Lösung auf Deckglas und fügen Sie 400 ul PBS. Warten 5-10 min. Wiederholen Sie für insgesamt 3 Spülgänge.
- Verlassen PBS auf Deckglas nach der letzten Spülung. Nicht die Oberflächenspannung beim Spülen zu brechen und nicht zulassen Deck austrocknen. Leave Deckel auf, bis Sie sie auf den coverlip dissoziiert Neuronen Platte.
5. Dissoziation, Anreicherung und Züchtung DRG-Neuronen - Teil 2
- Nach der Inkubation mit einem 10 ml sterile Pipette vorsichtig spülen Sie den Boden der Schale mit 100 mm dissoziiert DRG-Zellen. Halten Schale bei ~ 45 ° Winkel, ziehen ~ 7 ml mit Pipette F12HS10 Hilfe, dann sanft zu vertreiben 7 ml auf etwa ein Drittel der Schale. Wiederholen 5x, sanft verdrängen Neuronen.
- Drehen Teller und wiederholen Spülvorgang, für weitere sechs Spülungen, auf einem anderen ein Drittel der Schale. Wiederholen Sie die Prozedur erneut Rest 3.1 von Gericht. Auf diese Weise sanft spülen Sie den gesamten Boden der Schale mit F12HS10 Neuronen zu entfernen.
- Mit derselben Pipette F12HS10 enthält Neuronen aus 100-mm-Schale bis 15 konischen Rohr. Zentrifuge für 5-10 min bei 200 g Zellen zu pelletieren.
- F12HS10 entfernen, so Pellet ungestört. Pellet mit 2 ml erwärmt F12H + Ergänzungsmittel.
- Verdünnte Zellen nach Bedarf mit F12H + Ergänzungen gewünschten Beschichtungskonzentration (120.000 Zellen / ml für die Deckgläser mit 1 ug / ml Laminin-1 und 40.000 Zellen / ml für die Deckgläser mit 20 ug / ml Laminin-1 8,16 beschichtet ist) zu erhalten.
- Entfernen PBS von Laminin beschichteten Deckgläschen und sofort setzen 400 ul Zellen auf Deckgläsern. Schüssel vorsichtig in einer feuchten, 37 ° C Zellkulturbrutschrank. Lassen Sie für mindestens 1 h und bis zu 3 Stunden inkubiert, damit Neuronen an Laminin-1 zu halten.
- Unter sterilen Bedingungen vorsichtig schwemmen 35 mm Schalen mit Neuronen mit 1,6 ml F12H + Ergänzungsmittel.
HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt Oberflächenspannung auf Deckglas gebrochen werden kann. Neuronen angemessen auf Laminin-1 auf Deckglas geklebt. - Zurück Zellen Inkubator beimpft und über Nacht. Experimente durchführen, wie Immunzytochemie am folgenden Tag.
6. Ichmmunocytochemistry
- Vor Immunzytochemie, warm Fixierlösung (4% Paraformaldehyd, 30% Saccharose 2X PBS) in 37 ° C Wasserbad.
HINWEIS: Vor der Befestigung Zellen, Behandlung mit verschiedenen Reagenzien, wie Netrin-1, Mn 2 +, sonic hedgehog, semaphorin und Ephrin 16,29-31. - Entfernen Sie langsam 1 ml der 2 ml F12H + Ergänzungen aus Kulturschale. Vorsichtig 1 ml Fixierungslösung erwärmt. Lassen Sie bei Raumtemperatur für 10-15 min inkubiert.
- Entfernen Sie vorsichtig Fixierungslösung und 2 ml PBS. Bewerben Lösung in Richtung Rand der Schale, die Vermeidung von möglichen Herauslösen fixierten Zellen aufgrund der Anwendung von PBS. Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min.
- Wiederholen PBS waschen für insgesamt 5 Wäschen. Erlauben keine Zellen, die während jeder Schritt der Immunzytochemie trocknen.
- PBS zu entfernen. Wenden Sie 1 ml Blocking-Lösung (0,1% Triton-X 1X PBS, 5% normalem Ziegenserum). Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur. Alternativ zu Oberflächenmoleküle Fleck, Verwenden Triton-X in Blockierlösung 8 nicht.
- Verdünnen primären Antikörper in Blockierungslösung pro Empfehlung Herstellers. Verwenden Sie 1: 500 für Antikörper gegen NCAM und aktiviert β1 Integrine 16. Entfernen Blockierlösung, 1 ml der primären Antikörperlösung und Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C.
- Entfernen primären Antikörperlösung und 2 ml 1X PBS. Inkubation für 5-10 min bei Raumtemperatur. Wiederholen für insgesamt 4 Waschungen mit PBS. Waschungen kann verlängert werden, wenn nötig.
- Verdünnen sekundären Antikörper 1: 1000 in Blockierlösung. Entfernen PBS, 1 ml Sekundärantikörperlösung und Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Sekundärantikörper sind lichtempfindlich. Halten Sie Lösungen und Zellen in der Dunkelheit so viel wie möglich von diesem Punkt an. - Entfernen sekundären Antikörperlösung und spülen Sie 5x mit PBS 1x, wie bisher.
- Gelten ~ 60-80 ul FluoromountG auf einen Objektträger. Mit feinen Pinzette vorsichtig anheben Deckglas von Gericht und unteren Deckglas in Fluoromount G auf Objektträger. Luftblasen vermeiden.
- Laden horizontal gleitet bei 4 ° C im Dunkeln. Nach 12-24 h wird Fluormount G polymerisieren und Deckglas wird fest mit Mikroskop-Objektträger befestigt werden. Bildzellen nach diesem Polymerisationsschritt beendet ist.
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Representative Results
Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht Ermittler Kultur eine angereicherte Population von dissoziierten embryonalen sensorischen Neuronen mit sehr wenigen (zB <5%) nicht-neuronalen Zellen 7,8,10,16. Zahlreiche DRGs aus der lumbosakralen, des Brustraums und zervikalen Regionen erhalten werden. Je nach den Bedürfnissen des Forschers kann DRGs aus diesen unterschiedlichen anatomischen Regionen leicht isoliert werden. Zum Beispiel zeigt 1 Bilder des Hühnerembryos durch verschiedene Stadien der Präparation mit den Lenden DRGs in den 1C und 1D und Brust DRGs in den Figuren 1E und 1F hervorgehoben.
Kultivierten Zellen leicht durch Immunzytochemie markiert. Hier werden kultivierte Zellen mit Antikörpern gegen β1-Integrin und NCAM (2) immungefärbt. Überraschenderweise waren wir in der Lage, nach diesen Fluoreszenzfärbung für bis zu einem Jahr zu visualisierenICC Verfahren, wenn die Objektträger wurden horizontal bei 4 ° C im Dunkeln gehalten. , Die Langlebigkeit der ICC Flecken muss jedoch nach Benutzer und pro Antikörper bestimmt werden.
Abhängig von der Dichte der Neuronen können Wachstumskegeln an den Spitzen der sich Neuriten visualisiert werden (Figuren 2D-2F). Neuronen bei 40.000 bis 120.000 Zellen / ml auf Deckgläsern mit 20 ug / ml und 1 ug / ml Laminin-1 bzw. beschichtet zogen, zahlreiche freie Neuriten bis zu 26 Stunden nach der Plattierung. Diese Kulturen können für die Analyse speziell Wachstumskegel neben der Analyse der gesamten Neuron verwendet werden. Bisher wurde dieses Verfahren verwendet, um Wachstumskegelgeschwindigkeit und Verhaltensweisen, wie beispielsweise Wachstumskegelzusammen 8,9,11,13,16 bewerten. Nieder Beschichtung Dichten auf diesen Deck Ergebnisse in toten Neuronen, die nicht auf die Substrate eingehalten werden. Die für jedes Experiment benötigt genaue angemessene Dichte muss pro Ermittler optimiert werden.
Abbildung 1. Phasen der embryonalen Hühner Dissektion DRGs zu erhalten. A) Hühnerembryo auf seiner dorsalen Seite liegt. Das Herz (H) sind Flügel (W) und die Beine (L) gekennzeichnet. Der obere Teil des Bildes ist in Richtung des Kopfes oder der oberen (S). Die Unterkante des Bildes in Richtung des Schwanzes oder inferior (I). R = rechte Seite des Tieres, L = linke Seite des Tieres. Alle nachfolgenden Bilder in der gleichen Orientierung. B) die internen Organe des Embryos in A. Die Wirbelsäule entfernt werden Rippen und DRGs gesehen. Der Einfachheit halber eine Rippe markiert ist, drei Vertreter DRGs sind durch schwarze Kreise Bild Same Hühnerembryo als B mit einem grauen Kasten Identifizierung der Region identifiziert und der thorakalen und lumbalen Wirbelsäule gekennzeichnet. C) gezeigt higihre Vergrößerung in D. D) Höhere Vergrößerung der lumbalen Wirbelsäule (VC) Region. Drei der elf DRGs in dieser Ansicht durch gestrichelte Kreise identifiziert. DRGs sind rund und gekapselt. Diese Eigenschaften machen es einfach, intakt DRGs mit einer Pinzette. E) Ein Hühnerembryo nach der Entfernung der inneren Organe und ventralen Hälfte der Brustwirbelsäule zu erhalten. Grau Feld zeigt, auf höherer Vergrößerung in F. F) Rückenmark (SC) in der Region gesehen, wo Wirbelsäule entfernt wurde gezeigt. In Richtung der Unterseite des Bildes ist der Lendenwirbelsäule (VC) noch intakt ist. 3 von 10 DRGs sind durch gestrichelte Kreise gekennzeichnet. DRGs werden zwischen jedem Satz von Rippen vorhanden.
Abbildung 2. kultivierten primären sensorischen Neuronen für NC-immunAM und β1 Integrine. Küken DRG-Neuronen auf hohe Konzentrationen von Laminin-1 kultiviert werden immun für NCAM (A) und β1-Integrin (B). C) fusioniert Bild von zwei Flecken zeigt, die meisten Zellen positiv für beide NCAM und β1 Integrin sind. Diese aviären sensorischen Neuronen immun für beide Marker. Allerdings gibt es eine Zelle, die mit einem Stern NCAM negativ und β1 Integrin positiv ist, was mit einem nicht-neuronalen Zellen. DF) Höhere Vergrößerung eines kultivierten sensorischen Neuronen markiert zeigt Neuriten, die sich von den Zellkörper. D) Inset in Weiß Feld zeigt eine höhere Vergrößerung Wachstumskegel an der Spitze eines Neuriten.
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Discussion
Hier präsentieren wir Ihnen ausführliche Protokolle zur Isolierung und Kultivierung dissoziiert sensorischen Neuronen aus einem Hühnerembryo. Dieses Verfahren erzeugt eine angereicherte Population der stark wachsenden Nervenzellen in vitro 7,8,10,16. Zahlreiche zelluläre und molekulare Techniken können auf diese Nervenzellen in Kultur, einschließlich Immunzytochemie, die hier beschrieben wird, angewendet werden. Dieses Protokoll wurde vor kurzem zur quantitativen Bewertung der Intensität der immun aktiviert Integrine in Wachstumskegel sensorischer 8,16. In diesen früheren Studien wurde ein Software-Programm verwendet werden, um einen Umriss der distalen 20 Mikron Ende des Wachstumskegels genau zu erstellen. Der Umriss wurde anhand von NCAM-Färbung vorgenommen. Die ubiquitäre Expression von NCAM in Neuronen aktiviert das Software-Programm, um den gesamten Wachstumskegel, anstatt einen begrenzten Teil des Wachstumskegels zu identifizieren. Diese Wachstumskegel Umriss wurde dann als eine Region von Interesse und die Integrin Färbungsintensität innerhalb dieses Regi identifiziertauf Interesse wurde durch die Software ermittelt. Auf diese Weise wird die Intensität eines Proteins von Interesse kann leicht in einer spezifischen Region in kultivierten sensorischen Neuronen gemessen werden.
Um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten, werden die folgenden Empfehlungen vorgesehen. Zunächst sicher, dass Deckgläser sind gut mit Wasser nach Inkubation in HCl Schritte 1,4-1,6 gewaschen. Andernfalls werden Moleküle wie Laminin-1 nicht gut verteilen auf dem Deckglas. Zweitens bestätigen, dass DRGs ausreichend dissoziiert (Schritt 3.5) nach Trypsin Verdauung, sonst Klumpen von Zellen zu bilden, und dies wird die neuronale Reinheit zu verringern. Drittens ist es optimal, DRG Zellen in Schritt 3.9 eine vollständige 3 h, um eine reinere Population von Neuronen erhalten inkubieren. Wenn diese Inkubationsschritt wird verkürzt, dann verringern Spülschritte 5.1 und 5.2, die Anzahl der nicht-neuronalen Zellen, die nach einer kürzeren Inkubationszeit verdrängt begrenzen. Viertens, sicherzustellen, dass die Oberflächenspannung aufrechterhalten wird, während die Anwendung von Laminin-1 und dissoabgeschrieben Neuronen zu den Deckgläsern. Wenn Oberflächenspannung verloren geht, wird die Lösung über dem Deckglas und trocken zu verlängern. Dadurch werden die Nervenzellen zu töten. Fünftens muss die optimale Zelldichte von jedem Prüfer bestimmt werden. Frühere Studien haben 120,00 Neuronen / ml und 40.000 Neuronen / ml auf Deckgläsern mit 1 ug / ml Laminin-1 und 20 ug / ml Laminin-1, die jeweils 8,16 beschichtet plattiert. Diese Konzentration war niedrig genug, um die Ermittler auf freie Axonendigungen (Endungen, die noch nicht mit einem anderen Neuron verbunden war) zu studieren. Sechste, während Immunzytochemie, sicher sein, sanft spülen Zellen. Entfernen oder Anwendung von Lösungen, zu schnell kann Neuronen aus dem Deckglas zu entfernen.
Einschränkungen dieses Verfahrens sind die etwas begrenzte Zeitfenster von Küken DRG-Dissektion. DRGs leicht von embryonalen Tag (E) 7-10 Hühnerembryonen gewonnen werden. Während es möglich ist, DRGs früher als E7 erhalten ist, ist es etwas schwierig. Nach E11, mehr Knorpel transitions Knochen und das macht die Präparation erschwert. So würden Studien, die zum Vergleich gegenüber embryonalen Neuronen Erwachsenen wollen nicht ideal für diese Küken-Modell, aber frühere Studien haben die Ratten-Modell für die Altersvergleich in DRGs 32 verwendet. Es ist zu beachten, dass Ratten DRG-Dissektion ist teurer, weniger robust und technisch anspruchsvoller als Küken werden. Ein weiterer Punkt ist die Fähigkeit der kultivierten embryonalen DRG-Neuronen zu Zeit in Kultur umstellen. Beispielsweise sind diese sensorischen Neuronen exprimieren verschiedene Ebenen von Rezeptoren innerhalb von 48 h in Abhängigkeit von der Anwesenheit von ausgewählten Neurotrophine 2,30.
Zwei Unterklassen von DRG-Neuronen kann durch Verwendung von selektiven Neurotrophine im Medien 2,12,30 angereichert werden. Beispielsweise Nervenwachstumsfaktor (NGF) und Neurotrophin-3 (NT3) hauptsächlich unterstützt das Überleben von Haut-und propriozeptive Neuronen bzw. 33. Die in diesem Experiment verwendeten Medien hat sowohl NGF und NT3Aber dies kann leicht modifiziert werden, um entweder der Haut oder der propriozeptiven sensorischen Neuronen aus.
Dissoziiert Neuronen zugänglich sind zahlreiche Live-Imaging-Techniken einschließlich Zeitraffer Vorstellung der Wachstumskegel Motilität und Kalzium-Imaging. Das hier eingesetzte Material wird zum lebenden Zellen vorteilhaft, weil es nicht CO 2 zur pH-Pufferung der Medien erforderlich. Somit kann die Datenerfassung von lebenden Zellen an einem Mikroskop mit einer erwärmten Stufe durchgeführt werden, aber nicht ausreichender Wartung CO 2 Ebenen erforderlich. Wachstumskegelgeschwindigkeit Zusammenbruch 8,16,30 und Calciumspiegel 17 sind in lebenden primären Hühner sensorischen Neuronen nach dem hier beschriebenen Verfahren isoliert untersucht. Zusätzlich kann RNAi erfolgreich Proteinspiegel in kultivierten Küken-DRG-Neuronen 34 zu verringern.
Erkenntnisse aus der in-vitro-Modellen gut definierten gewonnen kann als eine wesentliche Grundlage, um Experimente zu entwerfen verwendet werdenin einer komplexeren in vivo-Modell. Zum Beispiel sind verschiedene Ansätze wurden im Labor Silber 35 verwendet, um Axon-Auswuchs in einem in vitro-Modell der glialen Narbe stimulieren. Der Vielzahl von Reagenzien in vitro getestet, nur zwei (Entzündung Induktion und Verdauung von Chondroitinsulfat-Proteoglykane) Axonregenerierung fördern. Interessanterweise eine Kombination dieser beiden Behandlungen in vivo stimuliert dramatisch und funktionellen Axonregenerierung in das Rückenmark 35. In diesem Fall werden die in vitro-Experimente lieferten ein wichtiges Werkzeug zum schnellen Screening für Reagenzien, die Axon-Auswuchs zu. Die Reagenzien, die erfolgreich für das Axonwachstum in vitro auch in vivo nachgewiesen, die weiter unterstützt den Wert der Zellkulturversuchen erfolgreich.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir möchten Alison Philbrook, Belinda Barbagallo und Michael Francis für aufschlussreiche Kommentare zu diesem Beitrag danken. Forschung in dieser Veröffentlichung berichtet wurde von einem R15 Area Award 1R15NS070172-01A1 zu MLL ausgezeichnet unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile small culture dishes (35 mm) | Corning | 430165 | |
| Sterile large culture dishes (100 mm) | Falcon | 353003 | |
| Sterile large Petri dishes (100 mm) | VWR | 89000-302 | |
| Glass Petri dish (100 mm) | VWR | D108962 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Standard forceps | Fine Science Tools | 1100-12 | |
| Coverslips (22 x 22 mm) | Fisher | 12 518 105K | 0.13-0.17 mm thickness is optimal for microscopy |
| Porcelin coverslip holder | Thomas scientific | 8542E40 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 17502-048 | use 50 ml aliquots per 500 ml of Ham's F12 media |
| HCl | VWR | VW3204-1 | use at 2 M, can be used twice before discarding |
| NaCl | Sigma | S9888 | use 5 M NaCl solution for laminin-1 stock solution |
| Laminin-1 | Invitrogen | 23017-015 | Add 72 µl of sterile 5 M NaCl and aliquot into 50 µl |
| 15 ml Conical tube | cell treat | 229411 | |
| PBS CMF 10x | Gibco | 14200 | used at 1x, dilute with sterile Millipore filtered water |
| PBS 10x | Gibco | 14080 | used at 1x, dilute with sterile Millipore filtered water |
| Ham's F12 | Lonza | 12-615F | |
| Fetal Bovine Serum Albumin (BSA) | Gibco | 10438 | use in F12HS20 at 10% |
| HEPES | Sigma | H3375 | make sterile 1 M solution in distilled water, dilute in F12 media to obtain final concentration of 10 mM |
| Penicillin/streptomyocin | Sigma | P0781 | use 5 ml in 500 ml of F12 media |
| NT3 | Millipore | GF031 | Add 1 ml of sterile Millipore water, aliquot under sterile conditions, store at -20 °C, use at final concentration of 10 ng/ml in F12H media, keep in -20 °C non-defrosting freezer |
| NGF | RnD systems | 256-GF | Add 1 ml of sterile 1x PBS with 0.1% BSA, aliquot under sterile conditions, store at -20 °C, used at final concentration of 10 ng/ml in F12H media |
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | aliquot under sterile conditions, store at -20 °C, use at final concentration of 200 mM in F12H media |
| Trypsin | Sigma | T4049 | aliquot under sterile conditions, store at -20 °C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Gibco | 15260 | |
| Other items needed: general dissection instruments, including glass Pasteur pipettes, fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37 °C), cell incubation chamber (humidified, 37 °C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting scope | |||
| Immunocytochemistry Reagents Table | |||
| Sucrose | Sigma | S9378 | used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2x PBS) |
| Triton-X 100 | Sigma | T-8787 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2x PBS) |
| Fluoromount G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Normal goat serum | Life technologies | PCN500 | |
| Microscope slides | VWR | 16004-430 | |
| Primary Antibody Table | |||
| Antibody against NCAM | Millipore | AB5032 | polyclonal |
| Antibody against activated β1 ingegrin | Millipore | MAB19294 | monoclonal |
| Secondary Antibody Table | |||
| Goat anti-mouse IgG Alexa 488 | Life technologies | A11001 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa 548 | Life technologies | A11036 | |
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