Introduction
Den bløde agar kolonidannelse analysen er en teknik i vid udstrækning anvendes til at vurdere cellulær transformation in vitro. Historisk er en anden assay, klongenicitetsassayet beskrevet af Puck et al. I 1956 anvendes til at vurdere cellernes evne til at danne kolonier 1. Ved denne teknik blev cellerne dispergeret på en dyrkningsplade og dyrket i nærvær af 'feeder celler eller konditioneret medium til at give nødvendige vækstfaktorer. Begrænsningen af denne teknik var, at det kun givet oplysninger om koloni-dannelse. Normale celler er forhindret forankringsuafhængig vækst på grund af en bestemt type af apoptotisk død, kaldet anoikis 2. Men transformerede celler har evnen til at vokse og dele sig uden binding til et substrat. At kapitalisere på dette begreb, forskerne udviklet blød agar koloni dannelse assay. Den bløde agar koloni dannelse assay er siden blevet ændret, i de senere år, at tage specific behov. En variation involverer inkorporering af fluorometrisk farvestof for at muliggøre høj-throughput kolonitælling. En anden variation involverer anvendelsen af specialiseret agaropløsning at tillade hentning af levedygtige celler efter kolonidannelse, når der er behov for protein- eller DNA-prøver.
I den traditionelle blød agar-kolonidannelse assayet dyrkes celler i et lag af blød agar blandet med celledyrkningsmedium, der hviler på et andet lag af blød agar, også blandet med celledyrkningsmedium, men indeholder en højere koncentration af agar. Dette forhindrer celler i at klæbe til dyrkningspladen, men tillader, at transformerede celler til dannelse af synlige kolonier. Rationalet bag denne teknik er, at normale celler afhænger af celle til ekstracellulær matrix kontakt for at kunne vokse og dele sig. Omvendt transformerede celler har evnen til at vokse og dele uanset deres omgivende miljø. Derfor celler i stand til at danne kolonier i en forankringsuafhængig måde var considered at blive transformeret og kræftfremkaldende. Det overordnede mål med denne metode er at måle denne evne i celler i en semi-kvantitativ og stringent måde.
Den Wnt signalvej er kritisk i embryogenese og ofte deregulerede i tumorgenese 3-6. Der er flere veje er forbundet med Wnt signalering. Den kanoniske vej involverer Wnt signalering og regulering af downstream gentransskription gennem dens virkninger på det transkriptionelle coaktivator beta-catenin. Wnts også signalere gennem flere ikke-kanoniske veje, for eksempel plane cellepolaritet vej, som regulerer elementer, der indgår i cytoskelet struktur 7 og Wnt-calciumstien, som regulerer frigivelsen af calcium fra det endoplasmatiske reticulum 8. Wnt ligander udøver deres aktivitet gennem binding Frizzled receptorer. Selvom flere Wnts er blevet vist at være opreguleret i lungekræft har Wnt7a vist sig at være nedreguleret i ikke-small cellet lungekræft gennem promoter methylering 9. Wnt7a binder Fzd9 og fungerer som en tumor suppressor gennem en ikke-kanoniske pathway. Restaurering af Wnt-7a og FZD-9 hæmmer væksten af ikke-småcellet lungekræft celler 10. Virkningerne af Wnt7a / Fzd9 medieres gennem aktivering af ERK-5, som til gengæld aktiverer peroxisomproliferatoraktiverede receptor γ (PPARy) 11,12. Her viser vi, at overekspression af Wnt7a og Fzd9 resulterer i undertrykkelse af forankringsuafhængig vækst af en murin lunge carcinom cellelinie. Murine CMT167 celler blev afledt fra en lungecarcinom i C57BL / lcrf mus 13 og blev stabilt transficeret med Wnt7A og Fzd9. Overekspression af Wnt7A og Fzd9 blev bekræftet ved kvantitativ-PCR (Q-PCR) og funktionaliteten af Wnt7A og Fzd9 overekspression blev bekræftet gennem nedstrøms aktivering af PPARy.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af Materialer og reagenser
- Mærk hver brønd i en vævskulturbehandlet 6-brønds plade passende for hver cellelinie eller tilstand, der undersøges.
- Forbered 2x cellekulturmedium ved at opløse 1 g pulver medium og 0,2 g natriumbicarbonat i de-ioniseret vand til et endeligt volumen på 50 ml.
- Passere dette medium gennem et 0,2 um filter for at sterilisere.
- Tilføje yderligere komponenter, der er nødvendige for normal kultur af cellelinjen af interesse. For eksempel vokser CMT 167 cellelinje i RPMI 1640-medium suppleret med 10% FBS og 1% penicillin / streptomycin-opløsning. Varm medium til 37 ° C i varmt vandbad før brug.
- Forbered 1x cellekulturmedium separat som du ville gøre for normal celle kultur cellelinie af interesse.
- Forbered 1% noble agar ved tilsætning af 1 g noble agar til 100 ml deioniseret vand.
BEMÆRK: Noble agar vil ikke opløses fuldstændigt med agitation alene. - Forbered0,6% ædelt agar ved at tilsætte 0,6 g noble agar til 100 ml deioniseret vand. Kan gøres både agar løsninger i 100 ml glasflasker med lukkes låg til langtidsopbevaring.
- Autoklavér de ædle agar blandinger at sterilisere. Disse blandinger kan fremstilles i forvejen og opbevares ved 4 ° C, men skal opvarmes igen på tidspunktet for eksperimentet indtil agar er fuldstændig opløst.
- Forbered nitroblåt tetrazoliumchlorid opløsning ved at en 1 mg / ml stamopløsning i 1x PBS (8 g NaCl, 0,2 g KCI, 1,44 g Na 2 HPO 4, og 0,24 g KH 2 PO 4 i H 2 O til slutvolumen på 1.000 ml ). Dette vil blive brugt ved afslutningen af eksperimentet til at farve kolonierne.
2. Belægning af bundlag af Agar
- Løsn hætten på flaske 1% ædle agar og mikroovn i ca. 1-2 min. Ved opvarmning i en mikrobølgeovn, overvåge løsningen nøje for at undgå koger over. Fortsæt opvarmning under blanding intermitterendeindtil agar er fuldstændig opløst, og opløsningen er klar.
BEMÆRK: Brug varmeresistente handsker til at håndtere kolbe efter opvarmning. Undladelse af dette kan forårsage forbrændinger eller alvorlig personskade. - Placer smeltet agar opløsning og forvarmet 2x dyrkningsmedium i et is spand fyldt med varmt ledningsvand (42 ° C). Også placere en 50 ml konisk rør i et rør holder i ice bucket med varmt vand. Overfør spand til cellekultur hætte til efterfølgende trin.
- For det nederste lag af agar, skal du bruge 1,5 ml af en blanding af agar og medium per brønd i en 6-brønds plade.
- At sikre en tilstrækkelig mængde af blandingen, forberede alt 12 ml for hver 6-brønds plade.
- Start ved at tilsætte 6 ml dyrkningsmedium til 50 ml koniske rør og derefter 6 ml af 1% ædle agaropløsning.
- Vend konisk rør flere gange for at blande. Arbejde i et rask tempo vil forhindre for tidlig hærdning af blød agar.
- Udarbejde ca. 5,5 ml af blandingen i en 5 ml serologisk piPette.
- Tillad luftboblerne til at stige til toppen af pipette kolonne før deponering 1,5 ml af denne blanding i hver brønd. Udvis forsigtighed for at undgå aflejring af eventuelle luftbobler i pladebrøndene.
- Dække pladerne og tillade agar blanding at størkne ved stuetemperatur i cellekultur hætte, til 30 min.
3. Plating det øverste lag af agar indeholdende celler
- Når det nedre lag af agar er størknet, begynder fremstillingen af det øvre lag.
- Første høst celler ved trypsinbehandling og fortynde dem 1: 5 i dyrkningsmedium (fx 1 ml trypsin, tilsættes 4 ml medium) i en 15 ml konisk rør.
- Tæl celler og beregn antallet af celler, der er nødvendige per brønd for at fremstille en endelig cellesuspension på dette tidspunkt. Dette antal vil variere afhængig af celletype. Brug 5.000 celler / brønd som et udgangspunkt og justere efter behov. Til denne celle nummer, ville du forberede en celle suspension af 6667 celler / ml (dvs. hver well vil modtage 0,75 ml af denne suspension og 0,75 ml agar til et samlet volumen på 1,5 ml; koncentrationen af celler vil også blive fortyndet 1: 2 for en endelig samlet celletal på 5.000).
- Mængden af cellesuspension nødvendige pr brønd af en 6-brønds plade vil igen være 1,5 ml. Forberede yderligere cellesuspension i alt 12 ml pr 6-brønds plade.
- Smelt 0,6% agar opløsning i en mikrobølgeovn som ovenfor og anbringes i ice bucket indeholdende varmt vand sammen med en 50 ml konisk rør på en rørholder, og den endelige cellesuspension fra trin 3.3.
- Overfør ice bucket med smeltet 0,6% agar til cellekultur hætte for efterfølgende trin.
- Bland 0,6% agar og cellesuspension i et 1: 1 forhold, fremstilling af en samlet mængde på 12 ml per 6-brønds plade. 1,5 ml vil blive krævet pr godt, men ekstra bør som ovenfor.
- Pipette 6 ml cellesuspension til 50 ml konisk rør.
- Derefter tilsættes 6 ml af 0,6% agar til røret.
BEMÆRK: Temperaturen af denne blanding, skal væreholdt omkring 42 ° C for at undgå for tidlig hærdning og for at maksimere celleoverlevelse. - Arbejde hurtigt, pipette denne blanding 2-3x at distribuere celler, og derefter udarbejde 5,5 ml af blandingen i en 5 ml serologisk pipette.
- Tillad eventuelle luftbobler til at stige til toppen af pipette kolonne før deponere 1,5 ml af denne blanding i hver brønd. Udvis forsigtighed for at undgå aflejring af eventuelle luftbobler i pladebrøndene.
- Tillad celle / agar blandingen at størkne ved stuetemperatur i cellekultur hætte, til 30 minutter før anbringelse i en 37 ° C befugtet cellekultur inkubator.
- Den tid, der kræves for tilstrækkelig kolonidannelse varierer for hver cellelinie, typisk omkring 21 dage.
- Et lag vækstmedium bør opretholdes over det øverste lag af agar for at forhindre udtørring. 100 pi medium tilsat to gange om ugen er tilstrækkelig til dette formål.
4. farvning Plader og Counting Kolonier
- Farv celler ved tilsætning af 200 _6 l nitroblåt tetrazoliumchlorid opløsning per brønd og inkubere pladerne natten over ved 37 ° C.
- Når kolonier farves, tage fotografier af brønde med en imager og tælle kolonier ved hjælp af billedanalyse software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ekspressionen af Wnt7A og Fzd9 i CMT167 celler er effektiv tumor suppression som illustreret ved vores blød agar-kolonidannelse assay. Foreløbigt, brugte vi Q-PCR at vise, at Wnt7A og Fzd9 mRNA udtrykkes i lave niveauer i CMT167 celler. CMT167 celler viste lave niveauer af endogen Wnt7A og Fzd9 forhold til MLE-12-celler, en SV40-transformeret murine lunge epiteliale cellelinje (figur 1). Vi derefter transficeret CMT167 celler med to retrovirale overekspression vektorer udtrykker humane konstruktioner af Wnt7A (LNCX-Wnt7A) og Fzd9 (LPCX-Fzd9) at skabe en stabil cellelinie, der udtrykker både Wnt7A og Fzd9 (CMT LL Wnt7a / Fzd9). Vi bekræftede ekspression af Wnt7A og Fzd9 af Q-PCR i denne cellelinje (figur 2). Som vores tidligere arbejde har vist, PPARy er en downstream effektor af Wnt7A / Fzd9 signalering. Wnt signalveje er mangfoldige. Derfor skal korrekt ekspression og aktivering af en bestemt Wnt og FZD receptor være æslersed ved hjælp af en nedstrøms effektor, der vides at aktiveres af Wnt / FZD par af interesse. For Wnt7A og Fzd9 blev PPARy valgt til denne grund. Transficerede vi CMT167 celler, der overudtrykker tomme vektorer (LNCX / LPCX) eller Wnt7A / Fzd9 med et Luciferase reporter konstrukt, der indeholder en PPARy reaktion element. Vi viste, at vores CMT167 LL Wnt7A / Fzd9 cellelinje havde næsten seks gange øget PPAR-RE-aktivitet (figur 3). Endelig, som tidligere nævnt, at bekræfte tumorsuppressoraktivitet af Wnt7A og Fzd9 in vitro, udførte vi en blød agar-kolonidannelse assay. CMT167 vektor der udtrykker og Wnt7A / Fzd9 udtrykker stabile cellelinjer blev udpladet på bløde agarplader og fik lov til at danne kolonier i to til tre uger. CMT167 LL Wnt7A / Fzd9 celler dannet betydeligt mindre kolonier i forhold til vektor-transficerede celler, der illustrerer tumorsuppressorfunktion af Wnt7A og Fzd9 (figur 4). Billeder blev taget af alle plader, og Colonies blev talt under anvendelse af en billeddanner og imaging software.
Figur 1: Nedsat niveau af Wnt7A og Fzd9 mRNA i CMT167 celler sammenlignet med MLE-12-celler Q-PCR-analyse blev udført for at bestemme mRNA niveauer af Wnt7a og Fzd9 normaliseret til GAPDH.. Niveauer i CME167 murine lungecarcinomceller blev sammenlignet med dem i MLE-12 SV40-transformerede murine lungeepitelceller, som blev normaliseret til 1,0. CMT167 celler viste lavere niveauer af Wnt7a (A) og Fzd9 (B) mRNA i forhold til MLE-12-celler.
Figur 2:. Overekspression af Wnt7a / Fzd9 i CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 stabil cellelinje Wnt7A / Fzd9 stabil overekspression menneskelige konstruktioner blev foretaget ved hjælp af en LN CX retroviral vektor. Q-PCR blev udført for Wnt7A og Fzd9, og mRNA-niveauer blev normaliseret til GAPDH i tomme vektor transficerede celler og i Wnt7A / Fzd9 overudtrykker celler. CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 celler udtrykte høje niveauer af Wnt7a (A) og Fzd9 (B) mRNA.
Figur 3: CMT167 Wnt7a / Fzd9 stabil overekspression cellelinje udviser forøget PPAR-RE promotoraktivitet CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 eller tom vektor CMT167 LNCX / LPCX stabile overudtrykker celler blev transficeret med en PPAR-responselement promotor luciferase plasmid ved hjælp af lipofectaminreagens.. Promotoraktivitet blev kvantificeret i forhold til vektor-transficerede celler, hvor promotor-aktivitet blev normaliseret til 1,0. CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 stabile overudtrykkende celler viste en ca. seksdobling i PPAR promoter aktivitet.
Figur 4:. Blød agar Colony Dannelse Assay af vektor-udtrykkende CMT167 LNCX / LPCX celler og CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 overudtrykkende celler Vector-udtrykkende CMT167 LNCX / LPCX celler og CMT167 LL Wnt7A / Fzd9 overudtrykker celler blev udsået i en blød agar koloni dannelse assay pr ovenfor beskrevne protokol. CMT167 LL Wnt7A / Fzd9 celler viste et markant fald i koloni-dannelse. Repræsentative brønde viser kolonier for hver cellelinie. Billede af brønde er repræsentative for tre uafhængige forsøg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vitro bekræftelse af tumor-undertrykkende funktion signalproteiner er vanskelig. En af de mest strenge assays tilgængelige til at undersøge denne egenskab er blød agar-kolonidannelse assay. Her har vi vist den bløde agar kolonidannelse under anvendelse af en murin lungecarcinom-cellelinje stabilt overudtrykker Wnt7a og Fzd9 sammenlignet med dens parentale CMT167 cellelinie.
Der er flere vigtige punkter at overveje med hensyn til blød agar assay. Det mest kritiske trin i dette assay er udpladning af cellerne. Celletællinger skal være korrekte, og agaropløsningen må ikke være for varmt. Hvis der ikke dannes kolonier, kan cellerne er blevet beskadiget som følge af varmestress. I denne situation bør analysen gentages, tage forholdsregler for at holde agar temperatur så tæt på 42 ° C som muligt. Alternativt kan et større antal celler udpladet.
Der er nogle få begrænsninger i blød agar-assay.En sådan begrænsning er, at det tager to til tre uger til færdiggørelse. En anden er, at det ikke giver mulighed for celleudtagningen efter afslutningen. Modifikationer af denne teknik anvender specialiserede agar løsninger for at tillade celler, der skal høstes til DNA eller protein ved assay afslutning. Alternative metoder også udnytte fluorometrisk farvestof for at muliggøre assays med højt gennemløb. Ikke desto mindre traditionel blød agar-kolonidannelse assayet forbliver som en af de mest strenge tests til bekræftelse af forankringsuafhængig cellevækst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cancer Cell Line of Interest | Sigma-Aldrich | 10032302 | CMT-167 Cells |
| Powdered RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-089 | Used to prepare 2x cell culture medium. |
| Liquid RPMI 1650 Medium | Cellgro | 10-040-CV | Referred to as 1x cell culture medium. |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30910.03 | Used to supplement cell culture medium. |
| Penicillin/Streptomycin | CellGro | 30-002-Cl | Used in cell culture medium. |
| Difco Noble Agar | BD Biosciences | 214230 | Used to prepare 1.0% and 0.6% agar. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | BP-328-1 | Used in 2x cell culture medium. |
| Trypsin | Cellgro | 25-050-Cl | |
| Sterile Bottle-Top Filters | Fisher | 09-761-126 | Used to sterile filter 2x medium. |
| Lipofectamine Reagent | Invitrogen | 18324-020 | Used in PPAR-RE luciferase assay. |
| 6-well Plates Tissue-culture Treated | |||
| 37 °C/5% CO2 Incubator | |||
| Chemi-Doc Imager | Bio-Rad | Used to take pictures of colonies. | |
| Quantity One Software | Bio-Rad | Used to count cell colonies. | |
| 15 ml Conical Tubes | |||
| 50 ml Conical Tubes | |||
| 250 ml Erlenmeyer Flasks | |||
| Microwave | |||
| 5 ml Serological Pipettes | |||
| Pipette Aid | |||
| Micropipette | |||
| Hemacytometer w/ cover slip | |||
| Pipette Tips | |||
| Inverted Light Microscope | |||
| Centrifuge | |||
| Heat-Resistant Gloves | |||
| Saran Wrap | |||
| Ice Bucket |
References
- Puck, T. T., Marcus, P. I., Cieciura, S. J. Clonal growth of mammalian cells in vitro; growth characteristics of colonies from single HeLa cells with and without a feeder layer. J Exp Med. 103, 273-283 (1956).
- Taddei, M. L., Giannoni, E., Fiaschi, T., Chiarugi, P. Anoikis: an emerging hallmark in health and diseases. The Journal of pathology. 226, 380-393 (2012).
- Wend, P., Holland, J. D., Ziebold, U., Birchmeier, W. Wnt signaling in stem and cancer stem cells. Semin Cell Dev Biol. 21, 855-863 (2010).
- Reya, T., et al. A role for Wnt signalling in self-renewal of haematopoietic stem cells. Nature. 423, 409-414 (2003).
- Klaus, A., Birchmeier, W. Wnt signalling and its impact on development and cancer. Nat Rev Cancer. 8, 387-398 (2008).
- Clevers, H. Wnt/beta-catenin signaling in development and disease. Cell. 127, 469-480 (2006).
- Takahashi-Yanaga, F., Kahn, M. Targeting Wnt signaling: can we safely eradicate cancer stem cells. Clin Cancer Res. 16, 3153-3162 (2010).
- De, A. Wnt/Ca2+ signaling pathway: a brief overview. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 43, 745-756 (2011).
- Tennis, M. A., Vanscoyk, M. M., Wilson, L. A., Kelley, N., Winn, R. A. Methylation of Wnt7a is modulated by DNMT1 and cigarette smoke condensate in non-small cell lung cancer). PLoS One. 7, (2012).
- Winn, R. A., et al. Restoration of Wnt-7a expression reverses non-small cell lung cancer cellular transformation through frizzled-9-mediated growth inhibition and promotion of cell differentiation. J Biol Chem. 280, 19625-19634 (2005).
- Winn, R. A., et al. Antitumorigenic effect of Wnt 7a and Fzd 9 in non-small cell lung cancer cells is mediated through ERK-5-dependent activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma. J Biol Chem. 281, 26943-26950 (2006).
- Tennis, M. A., et al. Sprouty-4 inhibits transformed cell growth, migration and invasion, and epithelial-mesenchymal transition, and is regulated by Wnt7A through PPARgamma in non-small cell lung cancer. Mol Cancer Res. 8, 833-843 (2010).
- Steele, J. G., Rowlatt, C., Sandall, J. K., Franks, L. M. Cell surface properties of high- and low-metastatic cell lines selected from a spontaneous mouse lung carcinoma. Int J Cancer. 32, 769-779 (1983).
