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Biology

शीतल अग्रवाल कालोनी गठन परख

doi: 10.3791/51998 Published: October 27, 2014

Introduction

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नरम अगर कॉलोनी गठन परख व्यापक रूप से इन विट्रो में सेलुलर परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल एक तकनीक है. ऐतिहासिक, पक एट अल द्वारा वर्णित है. 1956 में एक और परख, clonogenic परख, कालोनियों 1 फार्म करने के लिए कोशिकाओं की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. इस तकनीक में, कोशिकाओं एक संस्कृति की थाली पर बिखरे थे और आवश्यक वृद्धि कारकों प्रदान करने के लिए 'फीडर' कोशिकाओं या वातानुकूलित माध्यम की उपस्थिति में हो गई. इस तकनीक की सीमा है कि यह केवल कॉलोनी गठन के बारे में जानकारी प्रदान की थी. सामान्य कोशिकाओं के कारण anoikis 2 बुलाया apoptotic मौत की एक विशेष प्रकार, के लिए, लंगर स्वतंत्र विकास से रोका जाता है. हालांकि, बदल कोशिकाओं एक सब्सट्रेट के लिए बाध्य बिना विकसित करने की क्षमता है और विभाजित है. इस अवधारणा को भुनाने के लिए, शोधकर्ताओं नरम अगर कॉलोनी गठन परख विकसित की है. नरम अगर कॉलोनी गठन परख के बाद सपा को संबोधित करने के लिए, और हाल के वर्षों में, संशोधित किया गया हैecific की जरूरत है. एक बदलाव के उच्च throughput कॉलोनी की गिनती के लिए अनुमति देने के लिए fluorometric डाई का समावेश शामिल है. एक और बदलाव प्रोटीन या डीएनए नमूने की जरूरत है जब कॉलोनी गठन के बाद व्यवहार्य कोशिकाओं की पुनर्प्राप्ति के लिए अनुमति देने के लिए विशेष अगर समाधान का इस्तेमाल शामिल है.

पारंपरिक नरम अगर कॉलोनी गठन परख में, कोशिकाओं को भी सेल संस्कृति माध्यम के साथ मिश्रित नरम अग्रवाल, की एक और परत पर टिकी हुई है कि सेल संस्कृति माध्यम के साथ मिश्रित नरम अगर की एक परत में हो गई, लेकिन अगर की एक उच्च एकाग्रता से युक्त होते हैं. इस संस्कृति की थाली का पालन करने से कोशिकाओं को रोकता है, अभी तक दिखाई कालोनियों के लिए फार्म कोशिकाओं से बदल देता है. इस तकनीक के पीछे तर्क सामान्य कोशिकाओं को विकसित और विभाजित करने के लिए सक्षम होने के लिए बाह्य मैट्रिक्स संपर्क करने के लिए सेल पर निर्भर करता है. इसके विपरीत, तब्दील कोशिकाओं के विकास और भले ही उनके आसपास के वातावरण का विभाजित करने की क्षमता है. इसलिए, एक लंगर स्वतंत्र ढंग से कालोनियों के रूप में सक्षम कोशिकाओं सी थेonsidered तब्दील और कैंसर हो. इस विधि के समग्र लक्ष्य के लिए एक अर्द्ध मात्रात्मक और कड़े तरीके से कोशिकाओं में इस क्षमता को मापने के लिए है.

Wnt संकेतन मार्ग embryogenesis में महत्वपूर्ण और अक्सर tumorigenesis 3-6 में डे-विनियमित है. Wnt संकेत के साथ जुड़े कई रास्ते होते हैं. विहित मार्ग ट्रांस्क्रिप्शनल coactivator बीटा catenin पर इसके प्रभाव के माध्यम से Wnt संकेत और नीचे की ओर जीन प्रतिलेखन के विनियमन शामिल है. Wnts भी उदाहरण के लिए, कई गैर विहित रास्ते के माध्यम से संकेत, endoplasmic जालिका 8 से कैल्शियम की रिहाई को नियंत्रित करता है जो cytoskeletal संरचना 7 में शामिल तत्वों को नियंत्रित करता है जो तलीय सेल polarity के मार्ग, और Wnt-कैल्शियम मार्ग,. WNT ligands के Frizzled रिसेप्टर्स बंधन के माध्यम से अपनी गतिविधि डालती है. कई Wnts फेफड़ों के कैंसर में upregulated होना दिखाया गया है, Wnt7a गैर smal में नीचे विनियमित किया जाना दिखाया गया हैप्रमोटर मेथिलिकरण 9 के माध्यम से एल सेल फेफड़ों का कैंसर. Wnt7a एक गैर विहित मार्ग के माध्यम से एक ट्यूमर शमन के रूप में Fzd9 और कृत्यों बांधता है. Wnt-7A और FZD-9 की बहाली गैर छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर की कोशिकाओं को 10 के विकास को रोकता है. Wnt7a / Fzd9 का प्रभाव ERK-5, बारी में, peroxisome proliferator सक्रिय रिसेप्टर γ सक्रिय है जो (PPARγ) 11,12 के सक्रियण के माध्यम से मध्यस्थता कर रहे हैं. यहाँ, हम Wnt7a और Fzd9 की overexpression एक murine फेफड़ों कार्सिनोमा सेल लाइन का लंगर स्वतंत्र विकास के दमन में परिणाम बताते हैं कि. Murine CMT167 कोशिकाओं C57BL / lcrf चूहों 13 में एक फेफड़ों कार्सिनोमा से प्राप्त किए गए और stably Wnt7A और Fzd9 साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे. Wnt7A और Fzd9 की overexpression मात्रात्मक पीसीआर (क्यू पीसीआर) और Wnt7A और Fzd9 overexpression की कार्यक्षमता द्वारा पुष्टि की गई PPARγ के बहाव के सक्रियण के माध्यम से पुष्टि की गई.

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Protocol

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माल और अभिकर्मकों के 1. तैयारी

  1. लेबल एक टिशू कल्चर के प्रत्येक अच्छी तरह से प्रत्येक कोशिका लाइन या हालत के लिए उचित 6 अच्छी तरह से थाली में इलाज की जांच की जा रही है.
  2. पाउडर माध्यम की 1 ग्राम और 50 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा को de-ionized पानी में सोडियम बाइकार्बोनेट की 0.2 ग्राम भंग करके 2x सेल संस्कृति के माध्यम से तैयार करें.
  3. बाँझ 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से इस माध्यम से गुजरती हैं.
  4. ब्याज की सेल लाइन के सामान्य संस्कृति के लिए आवश्यक अतिरिक्त घटक जोड़ें. उदाहरण के लिए, 10% FBS और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान के साथ पूरक 1640 RPMI मध्यम में CMT 167 सेल लाइन हो जाना. उपयोग करने के लिए गर्म पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म मध्यम से पहले.
  5. आप ब्याज की सेल लाइन के सामान्य सेल संस्कृति के लिए होगा के रूप में अलग से 1x सेल संस्कृति के माध्यम से तैयार करें.
  6. विआयनीकृत पानी की महान अगर 100 मिलीलीटर की 1 ग्राम जोड़कर 1% महान अगर तैयार करें.
    नोट: नोबल अगर अकेले आंदोलन के साथ पूरी तरह से भंग नहीं होगी.
  7. तैयार करना0.6% de-ionized पानी की 100 मिलीलीटर के लिए अगर महान का 0.6 जी जोड़कर अगर महान. दोनों अगर समाधान लंबी अवधि के भंडारण के लिए closable lids के साथ 100 मिलीलीटर कांच की बोतलों में बनाया जा सकता है.
  8. बाँझ महान अगर मिश्रण आटोक्लेव. ये मिश्रण अग्रिम में किया और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत लेकिन अगर पूरी तरह से भंग कर दिया है जब तक प्रयोग के समय फिर से गरम किया जाना चाहिए किया जा सकता है.
  9. 1000 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा को एच 2 ओ में पीओ 4 HPO 4 1x पीबीएस (8 छ NaCl, 0.2 ग्राम KCl, 1.44 छ 2 ना में एक 1 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान बनाकर nitroblue tetrazolium क्लोराइड समाधान तैयार है, और 0.24 छ के.एच. 2 ). इस कालोनियों दाग प्रयोग के अंत में इस्तेमाल किया जाएगा.

अग्रवाल के नीचे की परत के 2. चढ़ाना

  1. के बारे में 1-2 मिनट के लिए 1% महान अगर और माइक्रोवेव की बोतल पर टोपी ढीला. एक माइक्रोवेव में हीटिंग, वहीं पर उबलते से बचने के लिए बारीकी से समाधान की निगरानी. बीच-बीच में मिश्रण करते हुए, हीटिंग जारी रखें,अगर पूरी तरह भंग है और जब तक समाधान स्पष्ट है.
    नोट: हीटिंग के बाद फ्लास्क को संभालने के लिए गर्मी प्रतिरोधी दस्ताने का प्रयोग करें. ऐसा न होने जला या गंभीर चोट के कारण हो सकता है.
  2. गर्म पानी के नल (42 डिग्री सेल्सियस) से भरा एक बर्फ बाल्टी में पिघल अगर समाधान और पूर्व गर्म 2x संस्कृति के माध्यम रखें. इसके अलावा गर्म पानी के साथ बर्फ बाल्टी में एक ट्यूब धारक में एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब जगह है. बाद के चरणों के लिए सेल कल्चर हुड को बाल्टी स्थानांतरण.
  3. अगर के नीचे की परत के लिए, आप एक 6 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से एक अगर के मिश्रण और मध्यम के 1.5 मिलीलीटर की आवश्यकता होगी.
  4. मिश्रण की एक पर्याप्त राशि सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक 6 अच्छी तरह से थाली के लिए 12 मिलीलीटर की कुल तैयार करते हैं.
  5. 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब संस्कृति के माध्यम से 6 मिलीग्राम और 1% महान अगर समाधान की तो 6 मिलीलीटर जोड़कर शुरू करो.
  6. मिश्रण करने के लिए शंक्वाकार ट्यूब कई बार पलटना. एक तेज गति से काम कर नरम अगर समय से पहले सख्त कर पाएगा.
  7. एक 5 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक गड़बड़ी में मिश्रण का लगभग 5.5 मिलीलीटर ड्राpette.
  8. हवाई बुलबुले अच्छी तरह से प्रत्येक में इस मिश्रण की 1.5 मिलीलीटर जमा करने से पहले पिपेट स्तंभ के शीर्ष को जन्म देने की अनुमति है. थाली कुओं में किसी भी हवाई बुलबुले के बयान से बचने के लिए सावधानी बरतें.
  9. प्लेटें कवर और अगर मिश्रण 30 मिनट के लिए, सेल संस्कृति हुड में कमरे के तापमान पर जमना करने की अनुमति.

3. चढ़ाना अगर युक्त कोशिकाओं की ऊपरी परत

  1. अगर की निचली परत जम जाने के बाद, ऊपरी परत की तैयारी शुरू करते हैं.
  2. (Trypsin के 1 मिलीलीटर के लिए जैसे माध्यम के 4 मिलीलीटर जोड़ने) संस्कृति के माध्यम में 5 एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में: प्रथम, trypsinization द्वारा फसल कोशिकाओं और उन्हें 1 पतला.
  3. कोशिकाओं की गणना और इस समय एक अंतिम सेल निलंबन तैयार करने के लिए अच्छी तरह से प्रति आवश्यक कोशिकाओं की संख्या की गणना. यह संख्या सेल प्रकार के आधार पर अलग अलग होंगे. 5000 कोशिकाओं / साथ ही एक शुरुआती बिंदु का प्रयोग करें और जरूरत के रूप में समायोजित करें. इस सेल नंबर के लिए, आप यानी प्रत्येक wel के (6667 कोशिकाओं / एमएल के एक सेल निलंबन तैयार होगाएल इस निलंबन के 0.75 मिलीग्राम और 1.5 मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए अगर की 0.75 मिलीग्राम प्राप्त होगा; 5000 की अंतिम कुल सेल गिनती) के लिए 2: कोशिकाओं की एकाग्रता भी 1 पतला हो जाएगा.
  4. 6 अच्छी तरह से थाली की अच्छी तरह से प्रति जरूरत सेल निलंबन की मात्रा फिर से 1.5 मिलीलीटर हो जाएगा. 6 अच्छी तरह से थाली प्रति 12 मिलीलीटर कुल अतिरिक्त सेल निलंबन तैयार करें.
  5. ऊपर के रूप में एक माइक्रोवेव में 0.6% अगर समाधान पिघल और एक ट्यूब धारक में एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और कदम 3.3 से अंतिम सेल निलंबन के साथ गर्म पानी युक्त बर्फ बाल्टी में जगह है.
  6. बाद के चरणों के लिए सेल कल्चर हुड को पिघला 0.6% अगर साथ बर्फ बाल्टी स्थानांतरण.
  7. 6 अच्छी तरह से थाली प्रति 12 मिलीलीटर की कुल मात्रा तैयारी: 1 के अनुपात में एक 1 में 0.6% अगर और सेल निलंबन मिलाएं. 1.5 मिलीलीटर प्रति अच्छी तरह से की आवश्यकता होगी लेकिन अतिरिक्त के रूप में ऊपर बनाया जाना चाहिए.
  8. पिपेट 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में सेल निलंबन के 6 मिलीलीटर.
  9. फिर, ट्यूब को 0.6% अगर के 6 मिलीलीटर जोड़ें.
    नोट: इस मिश्रण का तापमान होना चाहिएसमय से पहले सख्त से बचने के लिए और सेल अस्तित्व को अधिकतम करने के लिए चारों ओर 42 डिग्री सेल्सियस रखा.
  10. पिपेट कोशिकाओं को वितरित करने के लिए इस मिश्रण 2-3x, जल्दी से काम करते हुए, तो एक 5 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट में मिश्रण की 5.5 मिलीलीटर आकर्षित.
  11. किसी भी हवाई बुलबुले अच्छी तरह से प्रत्येक में इस मिश्रण की 1.5 मिलीलीटर जमा करने से पहले पिपेट स्तंभ के शीर्ष करने के लिए वृद्धि करने के लिए अनुमति दें. थाली कुओं में किसी भी हवाई बुलबुले के बयान से बचने के लिए सावधानी बरतें.
  12. सेल / अगर मिश्रण एक 37 डिग्री सेल्सियस humidified सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में रखने से पहले 30 मिनट के लिए, सेल संस्कृति हुड में कमरे के तापमान पर जमना करने की अनुमति दें.
  13. पर्याप्त कॉलोनी गठन के लिए आवश्यक समय लगभग 21 दिनों आम तौर पर, प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए भिन्न होता है.
  14. मध्यम विकास की एक परत सुखाना को रोकने के लिए अगर की ऊपरी परत पर बनाए रखा जाना चाहिए. दो बार साप्ताहिक जोड़ा माध्यम के 100 μl इस प्रयोजन के लिए पर्याप्त है.

4. प्लेट्स धुंधला हो जाना और गिनती कालोनियों

  1. 200 जोड़कर दाग कोशिकाओं _6; अच्छी तरह से और 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात प्लेटें incubating प्रति nitroblue tetrazolium क्लोराइड समाधान के एल.
  2. कालोनियों दाग रहे हैं एक बार, एक इमेजर का उपयोग कुओं की तस्वीरें लेने के लिए और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर कालोनियों गिनती.

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Representative Results

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हमारे नरम अगर कॉलोनी गठन परख से यह साफ रूप CMT167 कोशिकाओं में Wnt7A और Fzd9 की अभिव्यक्ति ट्यूमर दमन में प्रभावी है. प्रारंभिक, हम Wnt7A और Fzd9 mRNA के CMT167 कोशिकाओं में निम्न स्तर में व्यक्त कर रहे हैं कि दिखाने के लिए क्यू पीसीआर इस्तेमाल किया. MLE-12 कोशिकाओं, एक SV40 तब्दील murine फेफड़ों उपकला कोशिका लाइन (चित्रा 1) की तुलना में जब CMT167 कोशिकाओं अंतर्जात Wnt7A और Fzd9 के निम्न स्तर से पता चला है. हम तो दो रेट्रोवायरल overexpression वैक्टर Wnt7A और Fzd9 (CMT डालूँगा Wnt7a / Fzd9) दोनों व्यक्त करता है कि एक स्थिर सेल लाइन बनाने के लिए Wnt7A (LNCX-Wnt7A) और Fzd9 (LPCX-Fzd9) के मानव निर्माणों को व्यक्त करने के साथ CMT167 कोशिकाओं ट्रांसफ़ेक्ट. हम इस सेल लाइन (चित्रा 2) में क्यू पीसीआर द्वारा Wnt7A और Fzd9 की अभिव्यक्ति की पुष्टि की. हमारे पिछले काम दिखाया गया है, PPARγ Wnt7A / Fzd9 संकेत के बहाव के प्रेरक है. WNT संकेत दे रास्ते विविध रहे हैं. इसलिए, एक विशेष Wnt और उसके FZD रिसेप्टर की उचित अभिव्यक्ति और सक्रियण गधे होना चाहिएब्याज की Wnt / FZD जोड़ी से सक्रिय होने के लिए जाना जाता है कि एक बहाव प्रेरक का उपयोग sed. Wnt7A और Fzd9 के लिए, PPARγ इस कारण चुना गया था. हम एक PPARγ प्रतिक्रिया तत्व युक्त एक luciferase रिपोर्टर निर्माण के साथ खाली वैक्टर (LNCX / LPCX) या Wnt7A / Fzd9 overexpressing CMT167 कोशिकाओं ट्रांसफ़ेक्ट. हम अपने CMT167 डालूँगा Wnt7A / Fzd9 सेल लाइन लगभग छह गुना वृद्धि हुई PPAR-रे गतिविधि (चित्रा 3) के लिए किया था कि पता चला है. इन विट्रो में Wnt7A और Fzd9 का ट्यूमर शमन गतिविधि पुष्टि करने के लिए, जैसा कि पहले उल्लेख अंत में, हम एक नरम अगर कॉलोनी गठन परख प्रदर्शन किया. CMT167 वेक्टर व्यक्त और Wnt7A / Fzd9 स्थिर सेल लाइनों मुलायम अगर प्लेटों पर चढ़ाया और दो से तीन सप्ताह के लिए कालोनियों फार्म की अनुमति दी गई व्यक्त. Wnt7A और Fzd9 (चित्रा 4) के ट्यूमर शमन समारोह illustrating, वेक्टर ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की तुलना में जब CMT167 डालूँगा Wnt7A / Fzd9 कोशिकाओं काफी कम कालोनियों का गठन. तस्वीरें सभी प्लेटों का लिया, और Colonie गयाएक इमेजर और इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर गिना रहे थे.

चित्रा 1
चित्रा 1: MLE-12 कोशिकाओं की तुलना में CMT167 कोशिकाओं में Wnt7A और Fzd9 mRNA की स्तर कम क्यू पीसीआर विश्लेषण GAPDH के लिए सामान्यीकृत Wnt7a और Fzd9 की mRNA स्तर निर्धारित करने के लिए प्रदर्शन किया था.. CME167 murine फेफड़ों कार्सिनोमा कोशिकाओं में स्तर 1.0 के लिए सामान्यीकृत थे जो MLE-12 SV40 तब्दील murine फेफड़ों उपकला कोशिकाओं में उन लोगों की तुलना में थे. CMT167 कोशिकाओं MLE-12 कोशिकाओं की तुलना में जब Wnt7a (ए) और Fzd9 (बी) mRNA की निचले स्तर से पता चला है.

चित्रा 2
चित्रा 2:. CMT167 डालूँगा Wnt7a / Fzd9 स्थिर सेल लाइन में Wnt7a / Fzd9 की overexpression Wnt7A / Fzd9 स्थिर overexpression मानव निर्माणों एक एलएन का उपयोग किया गया CX रेट्रोवायरल वेक्टर. क्यू पीसीआर Wnt7A और Fzd9 के लिए प्रदर्शन किया गया था, और mRNA स्तर खाली वेक्टर ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में और Wnt7A / Fzd9 overexpressing कोशिकाओं में GAPDH के लिए सामान्यीकृत थे. CMT167 डालूँगा Wnt7a / Fzd9 कोशिकाओं Wnt7a (ए) और Fzd9 (बी) mRNA की उच्च स्तर व्यक्त किया.

चित्रा 3
चित्रा 3: CMT167 Wnt7a / Fzd9 स्थिर overexpressing सेल लाइन दर्शाती PPAR-रे प्रमोटर गतिविधि में वृद्धि हुई CMT167 डालूँगा Wnt7a / Fzd9 या खाली वेक्टर CMT167 LNCX / LPCX स्थिर overexpressing कोशिकाओं Lipofectamine अभिकर्मक का उपयोग कर एक PPAR प्रतिक्रिया तत्व प्रमोटर luciferase प्लाज्मिड के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे.. प्रमोटर गतिविधि प्रमोटर गतिविधि 1.0 के लिए सामान्यीकृत किया गया था जहां वेक्टर ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की तुलना में मात्रा निर्धारित किया गया था. CMT167 डालूँगा Wnt7a / Fzd9 स्थिर overexpressing कोशिकाओं PPAR प्रमोटर गतिविधि में लगभग छह गुना वृद्धि देखी गई.

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चित्रा 4:. कोशिकाओं overexpressing कोशिकाओं overexpressing वेक्टर व्यक्त CMT167 LNCX / LPCX कोशिकाओं और CMT167 डालूँगा Wnt7a / Fzd9 की शीतल अग्रवाल कालोनी गठन परख वेक्टर व्यक्त CMT167 LNCX / LPCX कोशिकाओं और CMT167 डालूँगा Wnt7A / Fzd9 एक नरम अगर कॉलोनी गठन में चढ़ाया गया प्रोटोकॉल के अनुसार परख ऊपर वर्णित है. CMT167 डालूँगा Wnt7A / Fzd9 कोशिकाओं कॉलोनी के गठन में एक उल्लेखनीय कमी देखी गई. प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए कालोनियों दिखा प्रतिनिधि कुओं. कुओं का चित्र तीन स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं.

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Discussion

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संकेत प्रोटीन का ट्यूमर दमनकारी समारोह की इन विट्रो पुष्टि में मुश्किल है. इस संपत्ति की जांच के लिए उपलब्ध सबसे कठोर assays के एक नरम अगर कॉलोनी गठन परख है. यहाँ, हम स्थिरतापूर्वक अपने पैतृक CMT167 सेल लाइन की तुलना में Wnt7a और Fzd9 overexpressing एक murine फेफड़ों कार्सिनोमा सेल लाइन का उपयोग कर नरम अगर कॉलोनी गठन परख सचित्र है.

नरम अगर परख के बारे में विचार करने के लिए कई महत्वपूर्ण बातें हैं. इस परख में सबसे महत्वपूर्ण कदम कोशिकाओं के चढ़ाना है. कोशिकाओं की गिनती सही होने चाहिए, और अगर समाधान भी गर्म नहीं होना चाहिए. कोई कालोनियों का गठन कर रहे हैं, कोशिकाओं तनाव गर्मी की वजह से क्षतिग्रस्त हो गया है. इस स्थिति में, परख संभव के रूप में 42 डिग्री सेल्सियस के करीब अगर तापमान रखने के लिए सावधानियां बरतने, दोहराया जाना चाहिए. वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या चढ़ाया जा सकता है.

नरम अगर परख करने के लिए कुछ सीमाएं हैं.ऐसा ही एक सीमा है कि यह पूरा करने के लिए दो से तीन सप्ताह लेता है. एक और इसे पूरा होने पर सेल पुनः प्राप्ति के लिए अनुमति नहीं देता है. इस तकनीक का संशोधन कोशिकाओं परख पूरा होने पर डीएनए या प्रोटीन के लिए काटा जा करने के लिए अनुमति देने के लिए विशेष अगर समाधान को रोजगार. वैकल्पिक तरीकों भी उच्च throughput assays के लिए अनुमति देने के लिए fluorometric डाई का उपयोग. फिर भी, पारंपरिक नरम अगर कॉलोनी गठन परख लंगर स्वतंत्र सेल के विकास की पुष्टि के लिए सबसे कठोर परीक्षण में से एक के रूप में बनी हुई है.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cancer Cell Line of Interest Sigma-Aldrich 10032302 CMT-167 Cells
Powdered RPMI 1640 Medium Gibco 31800-089 Used to prepare 2x cell culture medium.
Liquid RPMI 1650 Medium Cellgro 10-040-CV Referred to as 1x cell culture medium.
Fetal Bovine Serum HyClone SH30910.03 Used to supplement cell culture medium.
Penicillin/Streptomycin CellGro 30-002-Cl Used in cell culture medium.
Difco Noble Agar BD Biosciences 214230 Used to prepare 1.0% and 0.6% agar.
Sodium Bicarbonate Fisher BP-328-1 Used in 2x cell culture medium.
Trypsin Cellgro 25-050-Cl
Sterile Bottle-Top Filters Fisher 09-761-126 Used to sterile filter 2x medium.
Lipofectamine Reagent Invitrogen 18324-020 Used in PPAR-RE luciferase assay.
6-well Plates Tissue-culture Treated
37 °C/5% CO2 Incubator
Chemi-Doc Imager Bio-Rad Used to take pictures of colonies.
Quantity One Software Bio-Rad Used to count cell colonies.
15 ml Conical Tubes
50 ml Conical Tubes
250 ml Erlenmeyer Flasks
Microwave
5 ml Serological Pipettes
Pipette Aid
Micropipette
Hemacytometer w/ cover slip
Pipette Tips
Inverted Light Microscope
Centrifuge
Heat-Resistant Gloves
Saran Wrap
Ice Bucket

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References

  1. Puck, T. T., Marcus, P. I., Cieciura, S. J. Clonal growth of mammalian cells in vitro; growth characteristics of colonies from single HeLa cells with and without a feeder layer. J Exp Med. 103, 273-283 (1956).
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Borowicz, S., Van Scoyk, M., Avasarala, S., Karuppusamy Rathinam, M. K., Tauler, J., Bikkavilli, R. K., Winn, R. A. The Soft Agar Colony Formation Assay. J. Vis. Exp. (92), e51998, doi:10.3791/51998 (2014).More

Borowicz, S., Van Scoyk, M., Avasarala, S., Karuppusamy Rathinam, M. K., Tauler, J., Bikkavilli, R. K., Winn, R. A. The Soft Agar Colony Formation Assay. J. Vis. Exp. (92), e51998, doi:10.3791/51998 (2014).

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