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Biology

人类多能干细胞的高效分化为心肌细胞，并鉴定流式细胞仪

Published: September 23, 2014 doi: 10.3791/52010
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 3, 2, 4,5, 1,6
1Department of Biochemistry, Medical College of Wisconsin, 2Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 3Department of Anesthesiology, Medical College of Wisconsin, 4Stem Cell and Regenerative Medicine Consortium, LKS Faculty of Medicine, Hong Kong University, 5Division of Cardiology, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Cardiovascular Research Center, Biotechnology and Bioengineering Center, Medical College of Wisconsin
* These authors contributed equally

Summary

该文章描述的详细方法通过选择性调节Wnt通路，随后通过流式细胞仪的参考标记分析来评估群体的均匀性和同一性的有效分化人多能干细胞分化为心肌细胞。

Abstract

目前迫切需要开发用于修复受损的心脏，发现没有对心脏毒性作用的新的治疗药物，改善策略，以准确地模拟心脏疾病的方法。利用人类诱导多能干细胞（hiPSC）技术，“一盘”为这些应用程序生成心肌的潜力继续产生很高的热情。近年来，为了有效地生成人类多能干细胞（hPSCs）心肌细胞的能力有很大的提高，为我们提供了新的机会，以模拟人类心脏发育的早期阶段，否则无法访问。相反，许多以前的方法中，心肌细胞的分化这里描述的协议不需要的细胞聚集或添加激活素A或BMP4和鲁棒生成细胞的，这对于心肌肌钙蛋白高度阳性培养物I和T（TNNI3，TNNT2），iroquois-一流的同源蛋白IRX-4（IRX4），肌球蛋白调节轻链2，室/心肌亚型（MLC2v）和肌球蛋白调节轻链2，心房异构体（MLC2a）由10天对所有的人胚胎干细胞（胚胎干细胞）和hiPSC行测试，以日期。细胞可以传代并保持在培养90天以上。该战略在技术上实现简单，具有成本效益。从多能干细胞的心肌细胞的特性通常包括参考标记的分析，无论是在mRNA和蛋白质水平。对于蛋白质分析，流式细胞仪是评估细胞的培养质量，确定亚群同质化的强大的分析工具。然而，在样品制备技术变化可能显著影响流式细胞仪检测数据的质量。因此，染色方法的标准化应该促进各种差异化策略之间的比较。因此，对于IRX4，MLC2v，MLC2a，TNNI3和TNN的分析而优化的染色方法T2通过流式细胞术进行了描述。

Introduction

心肌细胞从hPSCs，包括胚胎干细胞和hiPSC，生成可作为非常早期的人类心脏发育过程中的体外模型，提供了洞察阶段不进行机理研究，否则访问。该模型系统提供了独特的机会来研究控制心脏谱系的承诺和细胞命运规范的分子途径。近年来，为了有效地生成心肌细胞从hPSCs的能力大大改善了1-15。然而，其中的协议存在的细胞系的变化相对于在产生心肌细胞和定时，在该细胞表达腔特异性标记物（ 例如 ，心室和心房）的效率。理想情况下，该模型系统的未来应用，功能上定义的细胞更均匀种群是期望的。与以前的方法中，心肌细胞的分化这里描述的协议不要求CELL聚集或添加激活素A和骨形态发生蛋白4（BMP4）和强劲的生成TNNI3，TNNT2，IRX4，MLC2v和MLC2a文化非常积极的一天10细胞穿过测试日的所有人类胚胎干细胞和hiPSC线。该策略在技术上容易实现，尤其是相对于三维培养，大量培养，或胚状体基础的策略4-9，并且在一项研究描述了一种小分子具有选择性毒性，对hPSCs（Boheler 等人最近被限定。 ）65。该协议的功能包括使用人类胚胎干细胞资格基质（基质胶）的单层，利用小分子完全定义的媒体来调节Wnt信号（类似，但有别于1,2,7,13）单层培养hPSCs的分化，流式细胞仪染色方法的分化效率和小区标识评价的优化流程。综上所述，本协议的优点相比之前的报道，包括其高性价比eness，重现性，以及其高效率，用于产生在多个HPSC线，包括胚胎干细胞和hiPSC线心肌细胞。

流式细胞仪是评估细胞的培养质量，确定亚群同质化的强大的分析工具，以及适当的实验设计，可以提供定量测量。与所有的抗体为基础的策略，实验结果准确解释要求的试验设计元素，包括抗体浓度和固定和通透条件（针对细胞内的抗原时），经过认真的检查每一个抗体作为次优条件显著影响抗体的效结合，因此，结果的解释。重要的是，如果需要进行定量的，单克隆抗体是至关重要的，因为多克隆抗体可以识别多个表位，并且容易发生批次到批次的变化。目前，各种抗体（POlyclonal和单克隆）和染色方案已经描述了用于在体外分化的评估，从而难以比较中协议1,2,9,11 cardiomyogenesis的效率。出于这个原因，单克隆抗体用于仅当对于所有流式细胞仪分析。展望未来，预计这些染色方法的标准化，特别是关于定量，最好允许差异化战略之间的比较。

标记物的选择，以及它们相应的抗体，用于评估在体外 cardiomyogenesis纯度之间的报告而有所不同。 TNNT2一直被认为是细胞致力于心肌命运的指标和常规用于评价心肌分化方法的效率。然而，TNNT2也早期小鸡和大鼠发展16,17表达在骨骼肌中，它是存在于人平滑肌18 在体外的特异性标志物。 MLC2v和MLC2a通常用于为心室和心房亚型的替代指标，分别为。然而，与依托MLC2v和MLC2a确定在体外分化的上下文心肌亚型挑战源自以下事实：这些基因产物可以不通过成人限于整个心脏发育的特定腔室，从心脏管。在啮齿动物心脏循环，MLC2a基因是主要的心房/流道面积和MLC2v基因主要是在室/流出道地区。在环状心脏，共表达MLC2a和MLC2v的mRNA中的流入道，房室通道，并流出道19,20进行观察。由出生后3天，MLC2v mRNA表达被限制在心室和由出生后10天，MLC2a被限制到心房中的新生大鼠心脏19。因此，解释关于cardiomyogenesis效率和亚型的身份不但要考虑的参考标志物水平的存在和数量，但必须考虑到发展阶段（县）的分化所分析的时间点对应的数据。这是特别重要的考虑是由hPSCs的体外分化产生心肌细胞的成熟阶段最相似的那些胚胎/胎儿发育21-25。因此，依靠标记的空间表现在出生后心脏可能不适合HPSC源性细胞的评估，至少在某些情况下。

在努力促进更具体标准的发展，用于定义在体外心肌细胞的身份，TNNI3被认为是一种有价值的标志物，用于评估cardiomyogenesis 体外 ，它被限制为心肌整个胚胎发育中的小鸡和斑马鱼15,20并且不存在于人胎儿骨骼肌26。而TNNI1是存在于人类胎儿心脏，TNNI3是唯一TNNI存在于正常成人心脏27,28亚型。对于心肌细胞亚型的身份，IRX4 29-31是细胞与心室命运的信息标记。在蛋白质水平上，IRX4最近已显示被限制在从线性心脏管通过新生儿阶段的心室中的鼠标32。因此，优化的染色方法为TNNI3的通过流式细胞术分析和IRX4进行说明。就我们所知，这是高效率的基于抗体染色并在人心肌IRX4水平的流式细胞仪分析的方法的第一次描述。

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Protocol

1，解决方案和媒体准备

  1. 人类胚胎干细胞合格基质涂层原液
    1. 慢慢解冻胚胎干细胞在冰上合格基质（5毫升）中的4ºC过夜。分配等份放入预冷的1.5毫升的无菌微量离心管中并立即存储于-20℃。
      注：在等分试样的体积将根据许多变化，并且通常为270〜350微升。制造商提供的步骤2.1中所述关于实现稀释后的1X浓度为25毫升需要等分的音量的详细信息。
  2. HPSC媒体原液
    1. 使用超纯水作为稀释剂，除非另有说明。消毒用0.22微米的过滤器的所有组件。存储以下的本体溶​​液在4ºC：碳酸氢钠（75毫克/毫升）;柠檬酸（10毫米，pH值= 3）。
    2. 消毒用0.2微米的注射器过滤所有的组件，每个等分储存在-20℃：卢激酶（ROCK）抑制剂Y-27632（10毫在DPBS中，将100μl等分试样）; L-抗坏血酸2 - 磷酸盐（64毫克/毫升，500微升等分试样）;亚硒酸钠（70微克/毫升，100微升等分试样）;转铁蛋白（50毫克/毫升，107微升等分试样）;成纤维细胞生长因子2（FGF2 200纳克/微升的DPBS，250μL分装）;转化生长因子β1（TGFβ1，100纳克/微升冷的10mM柠檬酸，10微升等分试样）。
  3. HPSC媒体E8溶液组成
    1. 准备使用的等分试样在步骤1.2中制备的介质：DMEM / F12（含L-谷氨酰胺和HEPES 500毫升），碳酸氢钠（3.62毫升，最终：543微克/毫升），L-抗坏血酸2 - 磷酸盐（500微升;终：64微克/毫升），亚硒酸钠（100微升;最终：140毫微克/毫升），转铁蛋白（107微升;最后：10.7微克/毫升），胰岛素（1毫升;最后：20微克/毫升），FGF2（250微升;决赛：100毫微克/毫升），转化生长因子β1（10微升;决赛：2毫微克/毫升）。
    2. 结合所有组件，过滤消毒，并储存在4°C下长达2周。
  4. HPSC媒体E8与ROCK抑制剂
    1. 加入15微升ROCK抑制剂来12毫升E8媒体按上述方法制备拌匀。确保最终浓度是除细胞/媒体在步骤3.7之后为10μM。
  5. Wnt信号调制器储液
    1. 存储以下分装置于-20℃。 CHIR 99021 (6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5​-methyl-1 H -imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethy​l]amino]-3-pyridinecarbonitrile; 10mM的DMSO中，将15μl等分试样）。 IWR-1（4-（和1,3,3a，4,7,7a-六氢-1,3 - 二氧代-4,7亚甲基-2H-异吲哚-2 - 基） - N-8-喹啉基 - 苯甲酰胺; 10mM的DMSO中，6微升等份）。
  6. 分化培养基
    1. 制备分化培养基＃1的RPMI 1640（含L-谷氨酰胺）中有2％B27减去胰岛素补充。
    2. 制备分化培养基＃2的RPMI 1640（含L-谷氨酰胺）中有2％B27加上胰岛素补充和2％FBS中。
  7. 细胞洗涤溶液F或细胞培养
    1. 用Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水（DPBS），无钙或镁。
  8. 细胞清洗液的流式细胞仪
    1. 用磷酸盐缓冲盐水（PBS，无钙或镁），有1％FBS。商店在4ºC。
  9. 在流式细胞仪电池维修解决方案
    1. 用Hank氏平衡盐溶液（HBSS;没有钙或镁），用5％FBS中。商店在4ºC。
  10. 固定解流式细胞仪
    1. 使用Cytofix缓冲器作为TNNI3和IRX4抗体固定溶液。
    2. 使用1X PBS中的4％多聚甲醛（使鲜）为TNNT2和MLC2a抗体固定的解决方案。
    3. 用70％甲醇/ 30％丙酮作为MLC2v抗体固定溶液。
    4. 存储所有的解决方案在4ºC。
  11. 透解流式细胞仪
    1. 使用Phosflow彼尔姆缓冲三世通透溶液F或TNNI3和IRX4抗体。储存于室温（25℃）。
    2. 在1X PBS用0.2％的Triton X-100作为TNNT2，MLC2v和MLC2a抗体通透的解决方案。商店在4ºC。
  12. 封闭液
    1. 用10％山羊血清中的1X PBS。使新鲜和储存在4ºC备用。

2，涂层板

  1. 慢慢解冻1等份的hESC合格基质，在4°C下30分钟，加至25ml冷的DMEM / F 12，然后立即涂敷的6孔板前在无菌组织培养罩拌匀。
  2. 添加每一个6孔板的1毫升下灭菌组织培养罩（1等分的hESC合格基质足以外套4个6孔板）。
  3. 允许的hESC合格基质在室温下罩30分钟设定。吸出过量的hESC合格基质和添加2毫升E8媒体与ROCK抑制剂到每个孔中。使用平板立即，或者如果德IRED，在4°C店镀长达1周后立即并平衡至室温，使用前30分钟。

3，传代和未分化hPSCs的单层培养维护

  1. 保持hPSCs在单层培养在6孔板中，并在无菌组织培养罩执行所有步骤。
  2. 使用已经非常成熟HPSC线（> P20），并没有表现出细胞的神经，上皮 - 或成纤维细胞样形态的存在同质形态。确保细胞增殖鲁棒性，并且平均通道，每三天，在75％汇合时，在0.75×10 6每接种好。
  3. 通路hPSCs与解离为单细胞水平的至少5倍之前开始分化，以确保最高的分化效率。到通道hPSCs，吸E8媒体和两次用4ml 1X DPBS（预加热至室温）的洗细胞。加入1 ml的细胞分离的精神疾病的溶液（已预先加热至室温）至各孔中，离开井静置3-7分钟，直至小区边界开始到舍入。
  4. 用棉栓的玻璃移液管与灯泡撞出细胞转移到15毫升锥形管中含有1ml的DMEM / F12培养基（以灭活细胞剥离溶液）。
  5. 除去的细胞溶液10微升等分试样，并用10微升台盼蓝的微量离心管中混合。计数细胞（ 例如自动或手动的血球），而细胞的其余部分通过离心在130 XG收集5分钟，在室温下进行。通过此协议，预计使用自动血细胞计数器，还是今后，基地总细胞数的所有细胞数量的70-80％存活率。
  6. 吸出介质并重新悬浮在DMEM / F 12细胞沉淀以每500μl的0.75×10 6个细胞的终浓度。
  7. 加入500微升细胞悬浮液到6孔板的各孔中，其中每个孔周转箱NS2毫升E8媒体ROCK抑制剂，在步骤2.3准备。在拼接件离开板，轻柔地在前端至后端和侧到另一侧的运动，以均匀地分散细胞穿过井移动。回到细胞培养箱中在5％CO 2，37℃。
  8. 传代后开始的24小时，每天使用2个毫升/ E8没有ROCK抑制剂更换介质。最佳接种密度达到之前100％汇合，开始分化。播种0.75×10 6个细胞/孔的四天内开始分化，但根据需要优化每个细胞系之前。

hPSCs 4。心肌细胞诱导的Wnt信号通路的选择性调节

  1. 在天0-7每日更新媒体（2毫升/孔），和第8天之后每隔一天。
  2. 在第0天，用分化培养基＃1替换E8媒体开始分化过程。加入1.2微升CHIR（6μM终浓度）至各孔中。重复第1天。
  3. 在2-3天，更换新鲜不同的应tiation媒体＃1。
  4. 在第4天，更换新鲜分化培养基＃1。加入1μlIWR-1（5μM终浓度）至各孔中。重复第5天。
  5. 在6-7天，更换新鲜分化培养基＃1。
  6. 在第8天，更换新鲜分化培养基＃2。
  7. 继续更换分化培养基＃2隔日文化所需的时间。
  8. 如果需要的话，使用该细胞剥离溶液以下在3.3-3.6中概述的步骤，但用分化培养基＃2代媒体通路心肌细胞。传代过程中，游离心肌成小群〜3-10细胞。种子在〜6×10 5％使用人类胚胎干细胞以及合格的矩阵涂井和分化培养基＃2单元。

5，收集细胞进行流式细胞仪

  1. 执行5-9的实验台（ 即 ，未育）的步骤，所有剩余的问题。
  2. 吸生长介质，并用1×PBS洗涤细胞两次。加入1 ml的细胞剥离溶液（预先温热至室温）至每孔，并留下静置3-7分钟，直至小区边界开始到舍入。用棉花塞住硼硅玻璃一次性9“吸管球撞出细胞转移到15 mL锥形管上的冰。
  3. 在整个协议的其余部分，维持细胞在冰上并在200 XG在4ºC进行离心5分钟。
  4. 收集细胞，离心，吸出的解决方案。用10ml的血清吸液管反复研磨，以确保细胞团块重悬细胞于10ml细胞洗涤溶液中分散成单个细胞。计数细胞，在步骤3.5，而细胞的其余部分通过离心收集。
  5. 重悬的细胞在细胞洗涤溶液照顾到完全解聚的细胞沉淀并等分每圆底管1×10 6个细胞。收集细胞，离心，吸出的解决方案。

6，固定和细胞内抗原染色的透

  1. 加入100μl固定的解决方案，以细胞团。加入溶液中逐滴连续温和的震荡，然后在冰上置15分钟。
  2. 加入3 ml的细胞洗涤液。收集细胞，离心，吸出的解决方案。
  3. 加入100μl通透的解决方案，以细胞团。加入溶液中逐滴连续温和涡旋然后在冰上置30分钟。使用固定和透化条件如表1中概述了每种抗体。
  4. 加入3 ml的细胞洗涤液。收集细胞，离心，吸出的解决方案。重复一共有两个洗透了。
初级抗体（克隆） 免疫/抗原表位识别的 Istotype控制 在100μl每1×10 6个细胞的一抗的量 固定液 通透的解决方案 二抗 二次抗体的量/ 1×10 6个细胞于100μl
对于％的正测量 抗原定量
TNNI3（284（19C7） ISASRKLQL（人） 小鼠IgG2b 1.0微克 3.0微克 BD Cytofix BD Phosflow烫发三山羊抗小鼠IgG2b-Alexa488 600纳克
TNNT2（1C11） 全长纯天然人肌钙蛋白T蛋白。 小鼠IgG1 1.0微克 2.0微克 4％PFA在1％的PBS中 0.2％的Triton X-100在1％的PBS中山羊抗小鼠IgG1 - 的Alexa 488 600纳克
MLC2v（330G5） FDPEGKG 小鼠IgG2a 2.0微克 3.0微克 70％甲醇/ 30％丙酮 0.2％的Triton X-100在1％的PBS中山羊抗小鼠IgG2a - 的Alexa 647 600纳克
MLC2a（4E7） 在大肠杆菌中产生的人MYL7的全长人重组蛋白大肠杆菌 小鼠IgG1 0.5微克 3.0微克在1％的PBS中的4％PFA中 0.2％的Triton X-100在1％的PBS中山羊抗小鼠IgG1 - 的Alexa 488 600纳克
IRX4 LQEHRKNP
YPTKGEKI
MLAIITKM
TLTQVST 		兔IgG 0.5微克 0.5微克 BD Cytofix BD Phosflow烫发三山羊抗-RABBIT的IgG-PE 600纳克

表1中的抗体浓度。列出的是初级抗体，克隆（如单克隆）用于流量，优化的浓度和固定和透化条件的每个初级和次级抗体流式细胞仪分析。作为抗体的库存浓度可以在同一克隆的供应商之间变化，最终浓度每1×10 6个细胞的各抗体的固定测定体积，而不是稀释液中，提供了。免疫原用于产生抗体，或识别由抗体的表位，由制造商所提供的，被列出，但未经实验此处验证。

7抗体染色

  1. 对于每一个实验中，包括一种未染色的对照每固定/透化条件和相应的同种型对照为每个使用的初级抗体。包括非心肌细胞的细胞类型作为阴性对照（例如 ，多能干细胞或成纤维细胞）。使用同种型对照在相同的浓度对应的第一抗体（ 见表1）。
  2. 悬浮细胞在100μl封闭液使用的是P200的吸管分解细胞。在冰上25分钟，并轻轻摇动样本集。
  3. 无需拆卸封闭液，加入一抗，或按照表1的准则同型对照。在冰上轻轻摇动45分钟。
  4. 加入3 ml的细胞洗涤液。收集细胞，离心，吸出的解决方案。重复总共初级抗体标记后洗涤两次。
  5. 如果一个荧光标记的一抗的情况下，进入8.1。当未结合的第一抗体被使用（如在这里所描述的所有标记物），与缀合至荧光基团如下的二次抗体进行标记。
  6. 使用P200的吸管DISA悬浮细胞在100μl封闭液ggregate细胞。
  7. 每添加表1中的指引二级抗体。在冰上用温和的摇摆30分钟。
  8. 加入3 ml的细胞洗涤液。收集细胞，离心，吸出的解决方案。重复一共有两个洗二次抗体标记后。

8，制备细胞流式细胞仪

  1. 使用P1000的吸管分解细胞重悬细胞于400μl细胞的维护解决方案。
  2. 通过预湿50微升细胞保养液准备在圆底管中的细胞过滤器盖。冰上集管。用细胞过滤网帽，以防止细胞聚集体堵塞的流式细胞仪。
  3. 转移细胞溶液至细胞过滤帽，并允许细胞悬浮液通过重力排水。挖掘管的底部轻轻地放在台面作为必要的，这样的细胞被收集到管中，并置回冰上尽可能快。冲洗滤网用250微升细胞维持这样lution，以确保电池的最大恢复。
  4. 维持细胞在冰上避光，直到流式细胞仪分析。

9，流式细胞仪分析

详细的收购设置将仪器各不相同。基本参数考虑为最佳的数据收集进行说明。

  1. 为了获得最佳的流稳定，确保喷嘴大小超过5-6x被分析的细胞的直径。
    注意：这可能文书之间变化，但是一个重要的考虑因素都对分析仪和细胞分选选择适当的喷嘴尺寸。第10天心肌细胞的平均直径为11微米（范围8-14微米）;因此，在分析仪标准的150微米的样品进样管效果很好。
  2. 紧接之前的数据的分析，涡流每个管短暂地分散细胞聚集体。
  3. 优化前向和侧向散射光的电压设置为不同的细胞类型的基础上未染色的对照的实验中，使得所感兴趣的种群上规模和居中（ 图2A）中使用的每个固定/透化条件。
    1. 保持整个单次实验中这些设置，并从实验一致的实验在同一台仪器，因为显著转变可能表明流式细胞仪和样品制备潜在的问题。
  4. 对于每个荧光团，分析同种型对照和调整相应的激光的电压来确定，以获得可显示的峰的左，右边缘的荧光直方图所需的最小强度。相应抗体染色标本采集数据时，要保持每个同型对照激光设置。
    注：信号漂移往往发生在对的时间在同一台仪器。关键是在基于适当的同种型对照各实验开始时，以调整激光的设置。
  5. 收取最低10,000个事件。 50,000个事件是优选的。
  6. 对于统计分析，门的活细胞群，以排除碎片（ 图2A）。基于标记放置，允许≤2％贡献来自同种型对照， 如图2B所示，C中的门控群体中确定阳性细胞百分数。

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Representative Results

在第0天，将细胞100％汇合以紧凑的形态和最小的细胞碎片。于第1-2天，通常观察显著细胞死亡（40-50％），但附着的细胞将保留紧凑的形态（ 图1A）。在这段时间内，媒体是橙色和浑浊的。粉红媒体表示过度的细胞死亡，并且在这种情况下，确认用锥虫蓝和停止，如果细胞死亡高于70％。细胞会在3-4天恢复和密度就会增加。在5-6天，最小的细胞死亡，并出现密集的修补程序可能开始出现。经7-8天，覆盖单层与紧凑的形态点缀着密密麻麻的补丁来实现的。细胞开始自发地由8天收缩和第一收缩往往会在致密斑块可见。通过10天的，更强大的收缩观察，并会继续在整个文化传播在以后的日子。免疫细胞化学染色α辅肌动蛋白和TNNT2秀肌节结构（ 图1A）。如通过定量实时聚合酶链式反应（QRT-PCR）测定的中胚层和心肌承诺显示时间轮廓的参考标记物mRNA水平如预期（ 图1B），与心脏标志物同源异型盒蛋白NKX-2.5（NKX2.5的鲁棒表达），TNNI3，MLC2a，MLC2v和肌球蛋白-6（MYH6）。非常低的平滑肌（肌球蛋白重链11，MYH11）和骨骼肌中不可检测的水平（肌细胞生成素，MYOG）标记是例程。一致的早期发展，其中表达在心脏和骨骼肌中观察到之前被限制到骨骼肌成人20,27,28中，肌钙蛋白亚型TNNI1和TNNI2中7-8天被鲁棒地检测到。

符合其他报告，这在体外分化的战略产生了早期心脏祖细胞特征的心肌细胞（圆的形态，共同表达MLC2a的，MLC2v）19 30,32。在流式细胞仪中，光散射轮廓将中间细胞类型而变化，同时改变其中的固定/透化条件下（ 图2A）。在这些不同的细胞制备条件，流式细胞仪分析显示，单峰型对照抗体（ 图2B）之间有着明显的区别同型对照。多能干细胞或其它非心肌细胞是阴性的这里所用的标记。

使用这种分化和染色方案，将所得的细胞群体通常是99％TNNI3，96％IRX4 +，91％MLC2v +和96％MLC2a +由分化的第10天通过流式细胞术测定。 99％TNNT2 +细胞被观察到（ 图2C，2D），但如上所述，TNNT2不唯一该细胞是99％，真正的心肌细胞10天的基础上TNNI3蛋白质的发展，从而断言期间心肌细胞。值得注意的是与超过10天续培养，结构蛋白的蛋白水平将保持高位虽然相对基因表达水平会降低相对于峰值表达通过qRT-PCR所监测，与蛋白质的稳定性和3.2和3.5天周转率一致，分别为TNNI和TNNT 33。这种观察的一个例子示于TNNT2（在第11天（ 图1B）峰的mRNA表达，健壮的蛋白水平在20 +天（ 图2E）。

图1
图1：从hPSCs和代表性的数据心肌细胞分化的整体示意图。 （一）心肌differentiatio示意图 N协议注明沿袭和/或细胞的命运承担相应的阶段。细胞代表相衬图像在分化过程中的重要阶段。比例尺=10μm以下。最右边=α-辅肌动蛋白（绿色）的免疫组织化学图像中覆盖有TNNT2（红色）和细胞核（蓝色）（B）的qRT-PCR分析（用于探针组，见材料表）18参考胚层和心脏发育标记物第一17天分化。所有数据是平均3次生物学重复三份，其中误差棒代表平均值的标准误差的每个分析，并进行归一化，以肌动蛋白（ACTB）。消息层面 ​​的所有时间点是相对差异化的第一天，其中Ct值是检测（ 即的Ct <35）。 请点击这里查看该图的放大版本。

T“FO：保together.within页=”总是“> 图2
心肌细胞通过流式细胞术和电生理学的图2表征：（A）10 hiPSC衍生的心肌天的各种固定和透化条件下的光散射分布。 50,000个事件收集和门控群体（ 即不包括碎屑）用于统计分析显示为红色。IRX4上使用了三种不同的固定/透化条件下分化的第10天（B）的直方图，示出了在染色中的方法效率差。插图显示使用的每个条件iPS细胞在IRX4染色差异。这些数据说明了为什么可避免甲醇/丙酮为IRX4由于低，但检测的，染色的人iPS细胞（C）上differenti 10天TNNI3，TNNT2，MLC2v，MLC2a的直方图 TNNT2的使用优化的染色条件，在表1中详述的最大阳性细胞百分数ATION（D）直方图从抗体滴定实验中，示出了0.5微克是必需的，用于测量99％TNNT2 +细胞的最小量，但该2微克的饱和点所需的定量。只有一个单一的同种型对照示出，但滴定实验是基于每种抗体进行比较，以同种型对照的其相应的滴定计算的。TNNT2蛋白（E）的定量上的心肌细胞上的天分化的0-24，表示为中位数荧光强度差间抗体和同种型对照对每个时间点，从一个单一的自发收缩心室样心肌记录在使用膜片钳技术的全细胞电流钳构造分化46天（F）动作电位。ES / ftp_upload / 52010 / 52010fig2highres.jpg“目标=”_ blank将“>请点击这里查看该图的放大版本。

Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture
BD Matrigel, hESC-qualified matrix BD Biosciences 354277
Accutase cell detachment solution Stem Cell Technologies 7920
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium Life Technologies 14190-136
Dimethyl sulfoxide (DMSO, Hybri-Max, sterile-filtered) Sigma Aldrich D2650
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich 53817
Citric acid Sigma Aldrich C2404-100G
Y-27632 dihydrochloride selective p160ROCK inhibitor R&D Systems 1254
L-Ascorbic acid-2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma Aldrich A8960-5G
Sodium selenite Sigma Aldrich S5261-10G
Transferrin (Optiferrin – Defined, Animal-free, Recombinant Human) Invitria 777TRF029
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) R&D Systems 4144-TC-01M
Transforming growth factor beta 1 (TGFβ1) Peprotech 100-21
DMEM/F12 with L-Glutamine and 15 mM HEPES Life Technologies 11330-032
Insulin Sigma Aldrich I9278-5ML
CHIR-99021 HCl Sellekchem S2924
IWR-1 Sigma Aldrich I0161
RPMI 1640 with L-Glutamine Life Technologies 11875-093
B-27 Supplement Minus Insulin Life Technologies A1895601
B-27 Supplement (with Insulin) Life Technologies 17504-044
Fetal bovine serum Life Technologies 10437
Flow Cytometry Reagents
Phosphate buffered saline (10x) Quality Biological Inc. 119-069-151
Hank's balanced salt solution without Ca2+ and Mg2+ Life Technologies 14175-095
BD Cytofix BD Biosciences 554655
BD Phosflow perm buffer III BD Biosciences 558050
16% Paraformaldehyde Thermo Scientific 28906
Methanol Sigma Aldrich 179957-4L
Acetone Mallenckrodt Chemicals  2440-16
Triton X-100 Amresco M236-10ML
Goat serum Life Technologies 16210-064
Trypan blue solution, 0.4% Life Technologies 15250-061
Materials
5 ml Round bottom polystyrene tube (without cap) Corning 352008 For preparation of cells for flow cytometry
5 ml Round bottom polystyrene tube (with 35 µM cell strainer snap cap) Corning 352235 For preparation of cells for flow cytometry
2 ml rubber bulbs Fischer Scientific 03-448-24
9" borosilicate unplugged glass Pasteur pipets BioExpress P-2904-2
0.65 ml Microcentrifuge tubes, graduated, green GeneMate C-3259-G
1.5 ml Microcentrifuge tubes, graduated, red GeneMate C-3260-R
TC20 automated cell counter BioRad 145-0102
Counting slides for TC20 BioRad 145-0011
6-well Flat bottom tissue-culture treated plate Corning 353046
20 ml Syringes BD Plastipak 300613 For filter sterilization of aliquots
Sterile syringe filters, 0.2 µm polyethersulfone VWR 28145-501 For filter sterilization of aliquots
250 ml Filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding Corning 431096 For filter sterilization of bulk media 
500 ml filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding Corning 431097 For filter sterilization of bulk media
Antibodies and Isotype Controls
Anti-TNNI3 (clone: 284 (19C7)) Abcam ab19615 Primary antibody
Anti-TNNT2 (clone: 1C11) Thermo Scientific MA1-16687 Primary antibody
Anti-MYL2 (MLC2v, clone: 330G5) Synaptic Systems 310111 Primary antibody
Anti-MYL7 (MLC2a, clone: 4E7) Abcam AB131661 Primary antibody
Anti-IRX4   Bioss BS-9464R Primary antibody
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG1  Life Technologies A21121 Secondary antibody
Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG2a Life Technologies A21241 Secondary antibody
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG2b Life Technologies A21141 Secondary antibody
Phycoerythrin(PE) Goat anti-rabbit IgG R&D Systems F0110 Secondary antibody
Mouse IgG1 BD Biosciences 557273 Isotype Control
Mouse IgG2a eBiosciences 16-4724-81 Isotype Control
Rabbit IgG-PE R&D Systems IC105P Isotype Control
TaqMan Probesets for qRT-PCR
ACTB Life Technologies Hs01060665
Brachyury T Life Technologies Hs00610080
CASQ2 Life Technologies Hs00154286
IRX4 Life Technologies Hs01100809
ISL1 Life Technologies Hs00158126
MESP1 Life Technologies Hs01001283
MYH11 (SMMHC) Life Technologies Hs00224610
MYH6 Life Technologies Hs01101425
MYL2 (MLC2v) Life Technologies Hs00166405
MYL7 (MLC2a) Life Technologies Hs01085598
MYOG Life Technologies Hs01072232
NKX2.5 Life Technologies Hs00231763
NPPA Life Technologies Hs01081097
POU5F1 Life Technologies Hs04260367
SOX17 Life Technologies HS00751752
TNNI1 Life Technologies Hs00913333
TNNI2 Life Technologies Hs00268536
TNNI3 Life Technologies HS00165957
TNNT2 Life Technologies Hs00165960

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References

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细胞生物学，第91，人类诱导多能干细胞，流式细胞仪，定向分化，心肌细胞，IRX4，TNNI3，TNNT2，MCL2v，MLC2a
人类多能干细胞的高效分化为心肌细胞，并鉴定流式细胞仪
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Bhattacharya, S., Burridge, P. W., Kropp, E. M., Chuppa, S. L., Kwok, W. M., Wu, J. C., Boheler, K. R., Gundry, R. L. High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (91), e52010, doi:10.3791/52010 (2014).

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