Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

בידול יעילות גבוה של תאי גזע pluripotent האדם לשריר לב ואפיון על ידי cytometry הזרימה

Published: September 23, 2014 doi: 10.3791/52010
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 3, 2, 4,5, 1,6
1Department of Biochemistry, Medical College of Wisconsin, 2Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 3Department of Anesthesiology, Medical College of Wisconsin, 4Stem Cell and Regenerative Medicine Consortium, LKS Faculty of Medicine, Hong Kong University, 5Division of Cardiology, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Cardiovascular Research Center, Biotechnology and Bioengineering Center, Medical College of Wisconsin
* These authors contributed equally

Summary

המאמר מתאר את המתודולוגיה מפורטת להבחין ביעילות תאי גזע pluripotent אנושיים לשריר לב על ידי באופן סלקטיבי ויסות מסלול Wnt, ואחרי ניתוח cytometry זרימה של סמני התייחסות להעריך הומוגניות וזהותה של האוכלוסייה.

Abstract

יש צורך דחוף לפתח גישות לתיקון הלב הפגוע, שגילו תרופות טיפוליות חדשות שאין להם השפעות רעילות על הלב, ושיפור אסטרטגיות לדגמן מחלות לב באופן מדויק. הפוטנציאל של ניצול טכנולוגיה אנושית מושרה בתאי גזע pluripotent (hiPSC) כדי ליצור שריר לב "בצלחת" עבור יישומים אלה ממשיך לייצר גבוהה התלהבות. בשנים האחרונות, את היכולת ליצור ביעילות תאי cardiomyogenic מתאי גזע pluripotent האנושיים (hPSCs) השתפרה מאוד, מציעה לנו הזדמנויות חדשות למודל של פיתוח לב אנושי שלבים מוקדמים מאוד לא אחרת נגישות. בניגוד לרבים שיטות קודמות, פרוטוקול בידול cardiomyocyte מתואר כאן אינו דורש צבירת תא או תוספת של Activin או BMP4 וחסונה מייצר תרביות של תאים שהם חיוביים מאוד לטרופונין לבי וT (TNNI3, TNNT2), iroquois- חלבון homeodomain הכיתהIRX-4 (IRX4), שרשרת אור הרגולציה שרירן 2, איזופורם חדרית / שריר לב (MLC2v) ושרשרת אור הרגולציה שרירן 2, איזופורם פרוזדורים (MLC2a) ביום 10 בכל תא הגזע העוברי האנושי (hESC) וקווי hiPSC נבדק כדי תאריך. ניתן passaged תאים ונשמרו במשך יותר מ 90 ימים בתרבות. האסטרטגיה היא פשוטה מבחינה טכנית ליישום וחסכוני. אפיון של שריר לב שמקורם בתאי pluripotent לעתים קרובות כולל ניתוח של סמני התייחסות, הן בmRNA ורמת חלבון. לניתוח חלבונים, cytometry זרימה הוא כלי אנליטי רב עוצמה להערכת איכות של תאים בתרבית וקביעת ההומוגניות תת אוכלוסיות. עם זאת, וריאציה טכנית בהכנת מדגם יכולה באופן משמעותי להשפיע על איכות של cytometry זרימת הנתונים. לפיכך, סטנדרטיזציה של פרוטוקולים מכתים צריכה לאפשר השוואה בין אסטרטגיות בידול שונות. בהתאם לכך, מותאם פרוטוקולי צביעה לניתוח IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, וTNNT2 על ידי cytometry זרימה מתוארים.

Introduction

הדור של שריר לב מhPSCs, כולל hESC וhiPSC, יכול לתפקד כמודל במבחנה של תהליכים התפתחותיים לב אנושיים מאוד מוקדם, מתן תובנה שלבים לא אחרת נגישים למחקרים מכניסטית. מערכת מודל זה מספקת הזדמנויות ייחודיות ללמוד את המסלולים המולקולריים השולטים במחויבות שושלת לב ומפרט גורל תא. בשנים האחרונות, היכולת לייצר תאי cardiomyogenic ביעילות מhPSCs השתפרה 1-15 מאוד. עם זאת, בין פרוטוקולים יש וריאציה שורת תאים ביחס ליעילות ביצירת תאי cardiomyogenic ועיתוי שבו התאים להביע סמני תא ספציפי (לדוגמא, חדר ופרוזדורים). באופן אידיאלי, ליישומים עתידיים של מערכת מודל זה, אוכלוסיות הומוגניות יותר של תאים מוגדרים מבחינה תפקודית הן רצויים. בניגוד לשיטות קודמות, פרוטוקול בידול cardiomyocyte מתואר כאן אינו דורש ceצבירת ll או התוספת של חלבון Activin או עצם המוךפו"גנטי 4 (BMP4) ובאופן עמיד יוצרת תרבויות חיוביות מאוד עבור TNNI3, TNNT2, IRX4, MLC2v, וMLC2a ביום 10 תאים על פני כל קווי hESC וhiPSC נוסו עד היום. האסטרטגיה היא פשוטה מבחינה טכנית ליישום, במיוחד בהשוואה לתרבויות תלת ממדים, תרבות המונים, או אסטרטגיות המבוססות גוף embryoid 4-9, והוגדרה לאחרונה במחקר שמתאר מולקולה קטנה עם רעילות סלקטיבית לhPSCs (Boheler et al. ) 65. תכונות של פרוטוקול זה כוללים בידול של hPSCs בתרבות monolayer באמצעות שכבה יחידה של מטריצה ​​מוסמכת hESC (Matrigel), תקשורת מוגדרת באופן מלא באמצעות מולקולות קטנות לווסת איתות של Wnt (דומה, אך שונה מ1,2,7,13), ו זרימה מותאמת cytometry שיטות צביעה להערכת יעילות בידול וזהות תא. לסיכום, יתרונות של פרוטוקול זה בהשוואה לדוחות קודמים כוללים עלות effectiveness, שחזור, ויעילותו הגבוהה ליצירת שריר לב בקרב שורות hPSC מרובות, כולל קווי hESC וhiPSC.

Cytometry זרימה הוא כלי אנליטי רב עוצמה להערכת האיכות של תאים בתרבית וקביעת ההומוגניות תת אוכלוסיות, ועם עיצוב ניסיוני נכון, יכול לספק מדידות כמותיות. כמו בכל האסטרטגיות המבוסס על הנוגדן, פרשנות מדויקת של תוצאות ניסויים דורשת כי אלמנטים של עיצוב assay כוללים ריכוז נוגדנים וקיבעון ותנאי permeabilization (כאשר מיקוד אנטיגנים תאיים) נבדקים בקפידה עבור כל נוגדן כתנאים תת אופטימליים להשפיע על יעילות של נוגדן באופן משמעותי מחייב, ולכן, פרשנות של תוצאות. חשוב לציין, אם נדרש לכמת, נוגדנים חד שבטיים הם חיוניים, כמו נוגדנים polyclonal יכולים לזהות אפיטופים רבים ונוטים לוריאציה אצווה ל-אצווה. נכון לעכשיו, מגוון רחב של נוגדנים (פופרוטוקולי lyclonal וחד שבטיים) והצביעה תוארו להערכת בידול במבחנה, ולכן קשה להשוות את היעילות של cardiomyogenesis בין פרוטוקולי 1,2,9,11. מסיבה זו, נוגדנים חד שבטיים משמשים בעת זמינה עבור כל cytometry זרימת מנתח. במבט קדימה, הוא צפוי סטנדרטיזציה של פרוטוקולים מכתים אלה, במיוחד בכל הקשור לכימות, צריכים טוב יותר לאפשר השוואה בין אסטרטגיות בידול.

הבחירה של סמנים, והנוגדנים המקבילים שלהם, המשמש להערכת טוהר במבחנה cardiomyogenesis משתנים בין דיווחים. TNNT2 כבר נחשב מחוון של תאים מחויבים לגורל cardiomyogenic ומשמש באופן שגרתי כדי להעריך את היעילות של פרוטוקולי בידול לב. עם זאת, TNNT2 בא לידי ביטוי גם בשרירי שלד במהלך התפתחות אפרוח ועכברוש המוקדמת 16,17 והוא נמצא בשריר חלק אנושי 18 במבחנה. MLC2v וMLC2a משמשים באופן שגרתי כסמנים פונדקאיות של תת חדרית ופרוזדורים, בהתאמה. עם זאת, אתגרים עם הסתמכות על MLC2v וMLC2a כדי לקבוע תת סוג cardiomyocyte בהקשר של בידול במבחנה נובעים מהעובדה שמוצרי גן אלה לא יכולים להיות מוגבלים לחדר ספציפי בכל התפתחות של הלב, מצינור לב דרך מבוגר. במכרסמי כרך לב, MLC2a mRNA הוא השולט בפרוזדורים / האזור בדרכי יבוא וMLC2v mRNA הוא השולט באזורי מערכת חדרית / יצוא. בלב הכרך, שיתוף ביטוי של MLC2a וMLC2v mRNAs הם נצפו במערכת יבוא, תעלה בין עליות וחדרים, ומערכת יצוא 19,20. על ידי 3 ימים לאחר לידה, MLC2v mRNA מוגבל לחדר ועל ידי 10 ימים לאחר לידה, MLC2a מוגבל לפרוזדורים בלב החולדה בילוד 19. לכן, פרשנותנתונים על יעילות cardiomyogenesis וזהות תת סוג חייבת לא רק לקחת בחשבון את הנוכחות והכמות של רמות סמן התייחסות, אך יש לקחת בחשבון את השלב ההתפתחותי (ים) שנקודתי הזמן של בידול שמנותחים מתאימות. זה חשוב במיוחד בהתחשב בכך שהשלב ההבשלה של תאי cardiomyogenic שנוצרו על ידי במבחנה בידול של hPSCs הדומה ביותר אלה של התפתחות העובר / עוברית 21-25. לפיכך, בהסתמך על הביטוי המרחבי של סמן בלב לאחר הלידה לא יכול להיות מתאים להערכת נגזרים תאי hPSC, לפחות בחלק מהמקרים.

במאמץ להקל על הפיתוח של קריטריונים ספציפיים יותר להגדרת זהות cardiomyocyte במבחנה, TNNI3 נחשב סמן חשוב להערכת cardiomyogenesis במבחנה כפי שהוא מוגבל לשריר לב בכל עובר בחומוס ודג הזברה 15,20והוא נעדר בשרירי שלד של העובר אנושי 26. בעוד TNNI1 נמצא בלבו של העובר אנושי, TNNI3 הוא הווה איזופורם TNNI רק בלב מבוגר נורמלי 27,28. לגבי זהות תת סוג cardiomyocyte, IRX4 29-31 הוא סמן אינפורמטיבי של תאים עם גורל חדרית. ברמת החלבון, IRX4 לאחרונה הוכח להיות מוגבל לחדר מצינור לב ליניארי דרך שלבים בילוד בעכבר 32. בהתאם לכך, פרוטוקולי צביעה מותאמות לניתוח TNNI3 וIRX4 ידי cytometry זרימה מתוארים. למיטב ידיעתנו, זה הוא התיאור הראשון של שיטה לצביעה יעילה המבוסס על נוגדן וניתוח של רמות IRX4 בשריר לב אנושי על ידי cytometry זרימה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

.1 פתרון ומדיה הכנה

  1. פתרון מניות ציפוי מטריקס מוסמך hESC
    1. לאט להפשיר hESC מטריצה ​​מוסמכת (5 מ"ל) על קרח בשעה 4 ºC לילה. לוותר aliquots לתוך צינורות microcentrifuge מראש צונן, 1.5 מ"ל סטרילי ולאחסן מייד ב-20 ºC.
      הערה: נפח aliquot ישתנה בהתאם להרבה, ובדרך כלל נע 270-350 μl. יצרן מספק פרטים בדבר היקף aliquot הנדרש כדי להשיג את ריכוז 1x על דילול ל25 מ"ל כמתואר בשלב 2.1.
  2. hPSC פתרונות מניות מדיה
    1. השתמש במי ultrapure כמדלל, אלא אם כן צוין אחרת. לעקר את כל הרכיבים באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. אחסן הבאים כפתרונות בתפזורת ב4 ºC: סודיום ביקרבונט (75 מ"ג / מ"ל); חומצת לימון (10 מ"מ, pH = 3).
    2. לעקר את כל הרכיבים באמצעות מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר ולאחסן את כל aliquots ב -20 ºC: kinase מעכבי Rho (ROCK) Y-27632 (10מ"מ בDPBS, 100 aliquot μl); חומצת L-אסקורבית 2 פוספט (64 מ"ג / מ"ל, aliquot 500 μl); selenite נתרן (70 מיקרוגרם / מ"ל, 100 aliquot μl); transferrin (50 מ"ג / מ"ל, 107 μl aliquot); גורם גדילה פיברובלסטים 2 (FGF2; 200 ng / μl בDPBS, 250 aliquot μl); הפיכה בטא גורם גדילת 1 (TGFβ1, 100 ng / μl בקור חומצת לימון מ"מ 10, 10 aliquot μl).
  3. הרכב hPSC מדיה E8 פתרון
    1. הכן מדיה באמצעות aliquots מוכנים בשלב 1.2: DMEM / F12 (עם L-גלוטמין וHEPES; 500 מ"ל), סודיום ביקרבונט (3.62 מ"ל; סופי: 543 מיקרוגרם / מ"ל), חומצת L-אסקורבית 2 פוספט (500 μl; סופי : 64 מיקרוגרם / מ"ל), selenite נתרן (100 μl; סופי: 140 ng / ml), transferrin (μl 107; סופי: 10.7 מיקרוגרם / מ"ל), אינסולין (1 מ"ל; סופי: 20 מיקרוגרם / מ"ל), FGF2 (250 μl; סופי: 100 ng / ml), TGFβ1 (10 μl; סופי: 2 ng / ml).
    2. מערבבים את כל הרכיבים, סנן לעקר ולאחסן ב 4 ºC עד 2 שבועות.
  4. hPSC מדיה E8 עם מונעי ROCK
    1. הוספת מעכב ROCK 15 μl ל12 מ"ל של תקשורת E8 הכין כאמור לעיל ומערבבים היטב. ודא שהריכוז הסופי הוא 10 מיקרומטר לאחר תוספת של תאים / מדיה בשלב 3.7.
  5. פתרונות מאגר מאפנני Wnt
    1. אחסן את aliquots הבאים ב-20 ºC. Chir 99,021 (6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5​-methyl-1 H -imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethy​l]amino]-3-pyridinecarbonitrile; 10 מ"מ בDMSO, 15 aliquot μl). IWR-1 (4 (1,3,3a, 4,7,7a-Hexahydro-1,3-dioxo-4,7-methano-2H-isoindol-2-י.ל.) -N-8-quinolinyl-Benzamide; 10 מ"מ בDMSO, 6 aliquot μl).
  6. מדיה בידול
    1. הכן תקשורת בידול # 1 עם RPMI 1640 (עם L-גלוטמין) עם 2% תוספת אינסולין מינוס B27.
    2. הכן תקשורת בידול # 2 עם RPMI 1640 (עם L-גלוטמין) עם B27 2% בתוספת תוספת אינסולין ו2% FBS.
  7. תא f לשטוף פתרוןאו תרבית תאים
    1. השתמש מלוח של Dulbecco פוספט (DPBS), ללא סידן או מגנזיום.
  8. תא לשטוף פתרון לcytometry הזרימה
    1. השתמש בופר פוספט (PBS, ללא סידן או מגנזיום) עם 1% FBS. חנות ב 4 ºC.
  9. פתרון תחזוקת התא לcytometry הזרימה
    1. השתמש במאוזן תמיסת מלח של האנק (HBSS; ללא סידן או מגנזיום) עם 5% FBS. חנות ב 4 ºC.
  10. פתרונות קיבוע לcytometry הזרימה
    1. השתמש חיץ Cytofix כפתרון קיבעון לנוגדני TNNI3 וIRX4.
    2. השתמש paraformaldehyde 4% PBS 1x (לעשות טרי) כפתרון קיבעון לנוגדני TNNT2 וMLC2a.
    3. השתמש 70% אצטון מתנול / 30% כפתרון קיבעון לנוגדן MLC2v.
    4. אחסן את כל הפתרונות ב4 ºC.
  11. פתרונות permeabilization לcytometry הזרימה
    1. השתמש Phosflow פר הצפת III כf פתרון permeabilizationאו נוגדני TNNI3 וIRX4. אחסן בטמפרטורת חדר (25 מעלות צלזיוס).
    2. השתמש 0.2% טריטון X-100 ב1x PBS כפתרון permeabilization לנוגדני TNNT2, MLC2v, וMLC2a. חנות ב 4 ºC.
  12. פתרון חסימה
    1. השתמש בסרום עיזים 10% ב1x PBS. הפוך טרי ולאחסן ב 4 ºC עד לשימוש.

ציפוי 2 פלייט

  1. לאט להפשיר aliquot 1 של מטריצה ​​מוסמכת hESC ב 4 ºC ל30 דקות, להוסיף ל25 מ"ל של DMEM / F12 המצונן ומערבבים היטב במכסת מנוע בתרבית רקמה מעוקרת מייד לפני ציפוי 6 גם צלחות.
  2. הוסף 1 מ"ל לכל טוב של צלחת 6 היטב מתחת למכסת מנוע בתרבית רקמה מעוקרת (aliquot 1 של המטריצה ​​מוסמכת hESC מספיק כדי מעיל ארבעה 6 גם צלחות).
  3. לאפשר מטריצה ​​מוסמכת hESC להגדיר ל30 דקות בטמפרטורת חדר מתחת למכסת המנוע. לשאוב את המטריצה ​​מוסמכת hESC העודף ולהוסיף 2 מ"ל של תקשורת E8 עם מעכב ROCK היטב כל אחד. צלחות שימוש באופן מיידי, או אם desired החנות ב 4 ° C מייד לאחר ציפוי, למשך שבוע עד 1 ולאזן לטמפרטורת חדר למשך 30 דקות לפני השימוש.

.3 Passaging ותחזוקה של hPSCs המובחן בחד שכבתית תרבות

  1. לשמור hPSCs בתרבות monolayer ב6 גם צלחות ולבצע את כל השלבים מתחת למכסת מנוע בתרבית רקמה סטרילית.
  2. השתמש בקווי hPSC שמבוססים היטב (> P20) ולהציג מורפולוגיה הומוגנית ללא הנוכחות של תאים עם מורפולוגיה עצבית, epithelial- או דמוי פיברובלסט. ודא תאים להתרבות וחסונה, ובממוצע, מעבר לשלושה ימים במפגש 75% כאשר זורעים ב0.75 x 10 6 לכל טוב.
  3. hPSCs מעבר עם ניתוק לרמת התא הבודד 5x לפחות לפני תחילת בידול על מנת להבטיח יעילות בידול המרבית. לhPSCs מעבר, תקשורת ולשאוב E8 לשטוף תאים פעמיים עם 4 מ"ל של 1x DPBS (מראש חימם לטמפרטורת חדר). הוסף 1 מ"ל של ניתוק התאפתרון ment (מראש חימם לטמפרטורת חדר) זה טוב ולהשאיר גם באין מפריע במשך 3-7 דקות, עד שגבולות תא מתחילים עיגול לטובה.
  4. השתמש בפיפטה זכוכית מחוברת כותנה עם הנורה כדי לסלק תאים ולהעביר לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 1 מ"ל של תקשורת / F12 DMEM (כדי להשבית את פתרון ניתוק תא).
  5. הסר 10 aliquot μl של פתרון תא ומערבבים עם 10 μl של trypan כחול בצינור microcentrifuge. ספירת תאים (לדוגמא אוטומטית או hemocytometer הידנית) ואילו שאר תאים שנאספו על ידי צנטריפוגה ב130 XG למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. שימוש בפרוטוקול זה, מצפה כדאיות 70-80% באמצעות hemocytometer אוטומטי והולך קדימה, בסיס כל המספרים הסלולריים בסך הכל ספירת תאים.
  6. תקשורת לשאוב וresuspend התא גלולה ב DMEM / F12 לריכוז סופי של 0.75 x 10 6 תאים לכל 500 μl.
  7. הוסף 500 μl של ההשעיה התא היטב בכל צלחת 6 היטב שבו כל contai גםns 2 מדיה מ"ל E8 עם מעכב ROCK, מוכן בשלב 2.3. השארת צלחת על משטח העבודה, בעדינות להזיז בתאים קדימה ואחורה ותנועה מצד לצד כדי לפזר באופן אחיד על פני הבאר. חזור תאים לאינקובטור ב 5% CO 2, 37 ºC.
  8. החל 24 שעות לאחר passaging, להחליף תקשורת יומית באמצעות 2 מ"ל / גם E8 ללא מעכב ROCK. לייעל צפיפות זריעה כדי להשיג 100 מפגש% לפני תחילת הבידול. זרעים 0.75 x 10 6 תאים / היטב ארבעה ימים לפני תחילת הבידול, אבל אופטימיזציה עבור כל שורת תא לפי צורך.

.4 האינדוקציה Cardiomyocyte של hPSCs ידי האפנון סלקטיבי של נתיב Wnt

  1. רענן תקשורת (2 מ"ל / טוב) מדי יום במהלך הימים 0-7, וכל יום אחר אחרי יום 8.
  2. ביום 0, להתחיל את תהליך בידול על ידי החלפת מדיה E8 עם תקשורת בידול # 1. הוספת 1.2 Chir (6 מיקרומטר סופי) μl היטב כל אחד. חזור על פעולה ביום 1.
  3. בימים 2-3, להחליף עם בידול טריתקשורת tiation # 1.
  4. ביום 4, להחליף עם תקשורת # 1 בידול טרי. הוספת μl 1 IWR-1 (5 מיקרומטר הסופי) זה טוב. חזור על פעולה ביום 5.
  5. בימים 6-7, להחליף עם תקשורת # 1 בידול טרי.
  6. ביום 8, להחליף עם תקשורת # בידול טרי 2.
  7. תמשיך להחליף עם תקשורת בידול # 2 כל יום אחר לזמן רצוי של התרבות.
  8. אם תרצה בכך, שריר לב מעבר באמצעות פתרון ניתוק התא הבא צעדים המפורטים ב3.3-3.6, אבל החלפת תקשורת עם תקשורת בידול # 2. במהלך passaging, לנתק את שריר לב בצבירים קטנים של ~ 3-10 תאים. זרע ב ~ 6 x 10 5 תאים לכל בארות באמצעות היטב hESC מטריצה ​​מוסמכת מצופים ו# תקשורת בידול 2.

.5 אוסף של תאים לcytometry הזרימה

  1. לבצע את כל ההיבטים הנותרים של צעדי 5-9 על ספסל המעבדה (כלומר, לא סטרילי).
  2. תקשורת וצמיחה לשאוב לשטוף תאים פעמיים עם 1x PBS.הוסף 1 מ"ל של פתרון ניתוק תא (מראש חימם לטמפ 'חדר) זה טוב ולהשאיר באין מפריע במשך 3-7 דקות, עד שגבולות תא מתחילים עיגול לטובה. השתמש בפיפטה חד פעמית זכוכית בורוסיליקט פקוק כותנה 9 "עם הנורה כדי לסלק תאים ולהעביר לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל על קרח.
  3. לאורך כל שארית של פרוטוקול, לשמור על תאים על קרח ולבצע centrifugations בXG 200 במשך 5 דקות ב 4 ºC.
  4. איסוף תאים על ידי צנטריפוגה ופתרון לשאוב. תאי Resuspend בפתרון לשטוף תא 10 מ"ל בעזרת פיפטה סרולוגית 10 מ"ל עם טחינה דקה חוזרת ונשנית כדי להבטיח גושי תאים מפוזרים לתוך תאים בודדים. ספירת תאים כמו בשלב 3.5 בעוד שאר תאים שנאספו על ידי צנטריפוגה.
  5. תאים גלולים במטפלים פתרון לשטוף תא לdisaggregate לחלוטין תא גלולה וaliquot 1 x 10 6 תאים לכל צינור תחתון עגול. איסוף תאים על ידי צנטריפוגה ופתרון לשאוב.

ו -6 קיבועPermeabilization של תאים לתאיים Antigen הכתמה

  1. הוסף פתרון קיבעון 100 μl לתא גלולה. להוסיף טיפה חכמה פתרון עם vortexing העדין רציף ולאחר מכן להגדיר על קרח במשך 15 דקות.
  2. הוספת פתרון לשטוף תא 3 מ"ל. איסוף תאים על ידי צנטריפוגה ופתרון לשאוב.
  3. הוסף פתרון permeabilization 100 μl לתא גלולה. להוסיף טיפה חכמה פתרון עם vortexing העדין הרציף ולאחר מכן קבע על קרח למשך 30 דקות. השתמש תנאי קיבעון וpermeabilization כפי שתואר עבור כל נוגדן בטבלה 1.
  4. הוספת פתרון לשטוף תא 3 מ"ל. איסוף תאים על ידי צנטריפוגה ופתרון לשאוב. חזור על פעולה עבור הסכום כולל של שתי שטיפות לאחר permeabilization.
עיקרי נוגדן (Clone) Immunogen / אפיטופ מוכר Istotype בקרה הסכום של נוגדן ראשוני לכל 1 x 10 6 תאים ב100 μl קיבעון פתרון Permeabilization פתרון נוגדנים משני כמות נוגדנים משני / 1 x 10 6 תאים ב100 μl
למדידות חיוביות אחוזים לAntigen Quantitation
TNNI3 (284 (19C7) ISASRKLQL (אדם) עכבר IgG2b 1.0 מיקרוגרם 3.0 מיקרוגרם BD Cytofix סלסול BD Phosflow III העז אנטי עכבר IgG2b-Alexa488 600 ng
TNNT2 (1C11) אורך מלא חלבון T טרופונין אדם היליד מטוהר. העכבר IgG1 1.0 מיקרוגרם 2.0 מיקרוגרם PFA 4%ב1% PBS 0.2% טריטון X-100 ב1% PBS IgG1 אנטי עכבר העז - Alexa 488 600 ng
MLC2v (330G5) FDPEGKG עכבר IgG2a 2.0 מיקרוגרם 3.0 מיקרוגרם 70% אצטון מתנול / 30% 0.2% טריטון X-100 ב1% PBS אנטי העכבר עז IgG2a - Alexa 647 600 ng
MLC2a (4E7) חלבון רקומביננטי אנושי באורך מלא של myl7 האנושי המיוצר בE. coli העכבר IgG1 0.5 מיקרוגרם 3.0 מיקרוגרם PFA 4% ב1% PBS 0.2% טריטון X-100 ב1% PBS IgG1 אנטי עכבר העז - Alexa 488 600 ng
IRX4 LQEHRKNP
YPTKGEKI
MLAIITKM
TLTQVST 		ארנב IgG 0.5 מיקרוגרם 0.5 מיקרוגרם BD Cytofix סלסול BD Phosflow III אנטי ra עיזיםbbit IgG-PE 600 ng

טבלת 1 נוגדן ריכוזים. ברשימה הוא הנוגדן הראשוני, שיבוט (אם חד שבטי), ריכוזים מותאמים ותנאי קיבעון וpermeabilization עבור כל נוגדן ראשוני והמשני המשמשים לזרימה cytometry ניתוחים. כריכוזי מניית הנוגדן יכולים להשתנות בין ספקים מאותו השיבוט, ריכוזים סופיים של כל נוגדן לכל 1 x 10 6 תאים בנפח assay קבוע, ולא דילולים, מסופקים. Immunogen השתמש כדי ליצור את הנוגדן, או אפיטופ מוכר על ידי נוגדן, כפי שנקבע על ידי יצרן, מופיע ברשימה אבל לא באופן ניסיוני שאומת.

.7 נוגדן מכתים

  1. לכל ניסוי, כולל שליטה אחד בלא כתם לקיבעון / מצב permeabilization ושליטת אלוטיפ המתאימה לכל נוגדן ראשוני בשימוש. כולל סוגי תאים שאינם cardiomyocyte כפקדים שליליים (למשל, תאי גזע pluripotent או fibroblasts). השתמש בפקדי אלוטיפ באותו הריכוז כמו מקביל נוגדן ראשוני (ראה טבלה 1).
  2. תאים גלולים ב100 μl חסימת פתרון באמצעות פיפטה P200 לdisaggregate תאים. דגימות סט על קרח דק 25 עם נדנדה עדינה.
  3. מבלי להסיר חסימת פתרון, להוסיף נוגדן ראשוני או שליטת אלוטיפ בהתאם להנחיות בטבלה 1. דגירה 45 דקות על קרח עם נדנדה עדינה.
  4. הוספת פתרון לשטוף תא 3 מ"ל. איסוף תאים על ידי צנטריפוגה ופתרון לשאוב. חזור על פעולה עבור הסכום כולל של שתי שטיפות לאחר תיוג נוגדן ראשוני.
  5. אם נעשה שימוש בנוגדן ראשוני fluorophore מצומדות-, להמשיך ל8.1. כאשר נעשה שימוש בנוגדן ראשוני unconjugated (כגון לכל הסמנים שתוארו כאן), לבצע תיוג עם נוגדנים משני שמצומדת לfluorophore כדלקמן.
  6. תאים גלולים ב100 μl חסימת פתרון באמצעות פיפטה P200 לDisaתאי ggregate.
  7. הוספת נוגדנים משני להנחיות בטבלה 1. דגירה 30 דקות על קרח עם נדנדה עדינה.
  8. הוספת פתרון לשטוף תא 3 מ"ל. איסוף תאים על ידי צנטריפוגה ופתרון לשאוב. חזור על פעולה עבור הסכום כולל של שתי שטיפות לאחר תיוג נוגדנים משני.

.8 הכנת התאים לcytometry הזרימה

  1. תאים גלולים ב400 פתרון תחזוקת תא μl באמצעות פיפטה P1000 לdisaggregate תאים.
  2. הכן כובע מסננת תא בצינור תחתון עגול על ידי מראש הרטבה עם פתרון תחזוקת תא 50 μl. הגדר צינור על קרח. השתמש בכובע מסננת התא כדי למנוע אגרגטים תא מסתימת cytometer את הזרימה.
  3. העבר את פתרון תא לתא כובע מסננת ולאפשר השעיה תא לניקוז על ידי כוח הכבידה. הקש תחתון של צינור בעדינות על גבי ספסל במידת צורך, כך שהתאים שנאספו לתוך צינור ולהגדיר בחזרה על קרח במהירות אפשרית. מסננת לשטוף עם תחזוקת תא 250 μl כךlution כדי להבטיח התאוששות מקסימלי של תאים.
  4. שמור על תאים על קרח ולהגן מפני אור עד נותח על ידי cytometry זרימה.

.9 ניתוח cytometry זרימה

הגדרות רכישה מפורטות תשתנה בין מכשירים. פרמטרים בסיסיים לשקול לאיסוף נתונים אופטימלי מתוארים להלן.

  1. ליציבות זרם אופטימלית, ודא שגודל הזרבובית עולה 5-6x הקוטר של התא להיות מנותח.
    הערה: זה עשוי להשתנות בין מכשירים אך הוא שיקול חשוב הן למנתחים ובחירת גודל נחיר מתאים למיון תא. הקוטר הממוצע של יום 10 שריר לב הוא 11 מיקרומטר (הנע 8-14 מיקרומטר); וכך, צינור הזרקת מדגם 150 מיקרומטר סטנדרטי על מנתח עובד היטב.
  2. בסמוך למועד ניתוח נתונים, מערבולת צינור אחד לזמן קצר לפיזור אגרגטים תא.
  3. לייעל קדימה והגדרות מתח פיזור צד לכל סוג תא המבוססות עלשליטה בלא כתם לכל מצב הקיבעון / permeabilization המשמש בניסוי כזה שהאוכלוסיות של עניין הן בקנה מידה ומרוכזת (איור 2 א).
    1. לשמור הגדרות אלה בניסוי יחיד ולהיות עקבי מניסוי לניסוי באותו המכשיר, כמו משמרות משמעותיות עשויות להצביע על בעיות פוטנציאליות עם הזרם cytometer או הכנת מדגם.
  4. עבור כל fluorophore, לנתח את שליטת אלוטיפ ולהתאים מתח לייזר מתאים כדי לקבוע את עוצמת המינימום הנדרשת כדי להשיג היסטוגרמה הקרינה המציגה קצות שמאל וימין של השיא. לשמור את הגדרות לייזר עבור כל פקד אלוטיפ בעת רכישת נתונים על דגימות המתאימות מוכתם נוגדן.
    הערה: אות להיסחף לעתים קרובות מתרחשת לאורך זמן באותו המכשיר. זה קריטי כדי להתאים את הגדרות לייזר בתחילת כל ניסוי המבוסס על שליטת אלוטיפ המתאימה.
  5. לאסוף מינימום של10,000 אירועים. 50,000 אירועים עדיפים.
  6. עבור ניתוחים סטטיסטיים, שער אוכלוסיית התא החי להוציא פסולת (איור 2 א). לקבוע תאים חיוביים אחוזים באוכלוסייה מגודרת המבוססת על מיקום סמן המאפשר תרומת ≤2% משליטת אלוטיפ, כפי שמוצג באיור 2, C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ביום 0, תאים ומחוברות% 100 עם מורפולוגיה קומפקטית ופסולת תא מינימאלית. בימים 1-2, זה מקובל לצפות מוות של תאים משמעותיים (40-50%), אבל תאים מצורפים ישמרו מורפולוגיה קומפקטית (איור 1 א). במהלך תקופה זו, תקשורת היא כתומה ועכורה. תקשורת פינק מציינת מוות של תאים מופרזים, ובמקרה זה, לאשר עם trypan הכחול ולהפסיק אם המוות של תאים עולה על 70%. תאים יתאוששו בימים 3-4 וצפיפות תגדל. בימים 5-6, מוות של תאים מינימאליים מתרחש וטלאים צפופים עשויים להתחיל להופיע. על ידי ימים 7-8, monolayer ומחוברות מושגת עם מורפולוגיה קומפקטית וביניהם כתמים צפופים. תאים מתחילים באופן ספונטני על ידי כיווץ יום 8 וההתכווצויות הראשונות תהיינה לעתים קרובות נראות בטלאים הצפופים. ביום 10, התכווצות חזקה יותר הוא ציין ותמשיך להתפשט בכל התרבות בימים שלאחר מכן. צביעת Immunocytochemistry לα-actinin ומבנה sarcomere מופע TNNT2(איור 1 א). כפי שהוא נמדד על ידי תגובה בזמן אמת כמותי השרשרת של פולימראז (qRT-PCR), רמות mRNA של סמני התייחסות של פרופילים זמניים המזודרם ותצוגת מחויבות cardiomyogenic כצפוי (איור 1), עם ביטוי חזק של חלבון homeobox סמני לב Nkx-2.5 (NKX2.5 ), TNNI3, MLC2a, MLC2v, ושרירן-6 (MYH6). נמוך מאוד לרמות שאינן גילוי של שריר חלק (שרשרת השרירן כבדה 11, MYH11) ושרירי שלד (myogenin, MYOG) סמנים הם שיגרתי. עולה בקנה אחד עם התפתחות המוקדמת שבו ביטוי הוא ציין בשניהם שריר הלב ושלד לפני שמוגבל לשרירי שלד במבוגרים 20,27,28, טרופונין isoforms TNNI1 וTNNI2 מזוהים חסונה בימים 7-8.

עולה בקנה אחד עם דיווחים אחרים, במבחנה אסטרטגיית בידול זה יוצר שריר לב עם מאפיינים של אבות לב מוקדמים (מורפולוגיה מעוגלת, שיתוף ביטוי של MLC2a, MLC2v) 19 30,32. בcytometry זרימה, פרופילי פיזור האור משתנים בין סוגי תאים ולשנות במידה ניכרת בין הקיבעון / תנאי permeabilization (איור 2 א). תחת אלה תנאי הכנת תא שונים, cytometry זרימת ניתוח מגלה פקדי אלוטיפ עם פסגות יחידים עם הבחנה ברורה בין שליטת אלוטיפ ונוגדנים (איור 2). תאי pluripotent או תאים שאינם cardiomyocyte אחרים הם שליליים לסמנים המשמשים כאן.

תוך שימוש בפרוטוקול בידול וצביעה זו, אוכלוסיית תא וכתוצאה מכך היא בדרך כלל TNNI3 99%, 96% + IRX4, 91% MLC2v +, ו96% MLC2a + ביום 10 של בידול, כפי שנמדד על ידי cytometry זרימה. TNNT2 + תאי 99% הם נצפו (איורים 2C, 2D), אבל כפי שתואר לעיל, TNNT2 אינו ייחודילשריר לב במהלך פיתוח ובכך הטענה שתאי שריר לב אותנטי 99% ביום 10 מבוסס על חלבון TNNI3. יצוין, כי עם culturing המשך מעבר ליום 10, רמות החלבון של חלבונים מבניים יישארו גבוהות למרות שרמות ביטוי גנים יחסי תקטן ביחס לשיא ביטוי כפיקוח על ידי qRT-PCR, עולות בקנה אחד עם יציבות חלבון ושיעורי מחזור של 3.2 ו3.5 ימים, בהתאמה, לTNNI וTNNT 33. דוגמא להבחנה זו מוצגת לTNNT2 (ביטוי mRNA שיא ביום 11 (איור 1), רמות חלבון חזקות ביום 20+ (איור 2E).

איור 1
איור 1 סכמטי הכולל של בידול cardiomyocyte מhPSCs ונתונים מייצגים. סכמטי של differentiatio cardiomyocyte () פרוטוקול n מבואר עם שלב מקביל של שושלת ו / או מחויבת גורל תא. נציג תמונות בניגוד שלב של תאים בשלבים עיקריים של תהליך ההתמיינות. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. ימין קיצוני = תמונת immunocytochemistry של α-actinin (ירוק) ועליהן TNNT2 (אדום) וגרעינים (כחול). (ב) ניתוח qRT-PCR (עבור קבוצת בדיקה, ראה טבלת חומרים) של 18 המזודרם התייחסות וסמני פיתוח לב במהלך 17 הימים הראשונים של בידול. כל הנתונים הם ממוצע של שלוש חזרות ביולוגיות ניתוח כל אחד בשלושה עותקים, שבו ברים שגיאה מייצגים סטיית התקן של ממוצע, והם מנורמלים ליקטינו (ACTB). רמות הודעה לכל נקודות הזמן ביחס ליום הראשון של בידול שבו ערכי Ct הם לגילוי (כלומר Ct <35). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

t "FO: לשמור-together.within-page =" תמיד "> איור 2
אפיון דמות 2 של שריר לב על ידי cytometry זרימה ואלקטרופיזיולוגיה. () פרופילי פיזור אור של יום 10 שריר לב נגזר hiPSC בתנאי קיבעון וpermeabilization שונים. 50,000 אירועים נאספו ואוכלוסיית הנשלטים (פסולת למעט כלומר) המשמשת לניתוחים סטטיסטיים מוצגת באדום. (B) היסטוגרמות של IRX4 ביום 10 של בידול באמצעות שלושה תנאי הקיבעון / permeabilization שונים, הממחישים את ההבדלים במכתימים יעילות בין השיטות. ריבועים להראות הבדלים בצביעת IRX4 על hiPSCs שימוש בכל מצב. נתונים אלה ממחישים מדוע מתנול / אצטון הוא נמנע לIRX4 עקב נמוכה, אך גילוי, צביעה על hiPSCs. (C) היסטוגרמות של TNNI3, TNNT2, MLC2v, MLC2a ביום 10 של differenti ני באמצעות תנאי צביעה מותאמות לתאי אחוזים מרביים חיוביים מפורט בטבלה 1. (D) היסטוגרמות של TNNT2 מניסויי טיטרציה הנוגדן, הממחישות ש0.5 מיקרוגרם הוא הסכום המינימאלי הדרוש למדידת TNNT2 + תאי 99%, אבל זה 2 מיקרוגרם היא נקודת רוויה נדרש כדי לכמת. רק שליטת אלוטיפ אחד מוצגת, אך ניסויי טיטרציה מחושבים על בסיס השוואת כל נוגדן לטיטרציה המקבילה שליטה שלה אלוטיפ. (E) Quantitation של חלבון TNNT2 בשריר לב בימים 0-24 של בידול, מיוצגת כהפרש עוצמת הקרינה החציונית בין הנוגדן ושליטה אלוטיפ עבור כל נקודה. פוטנציאל פעולה (F) רשם מcardiomyocyte כמו חדרית-ספונטני קבלנות אחת ביום 46 של בידול באמצעות תצורת המהדק הנוכחית כל התא של טכניקת מהדק תיקון זמן.es / ftp_upload / 52010 52010fig2highres.jpg "target =" / _blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture
BD Matrigel, hESC-qualified matrix BD Biosciences 354277
Accutase cell detachment solution Stem Cell Technologies 7920
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium Life Technologies 14190-136
Dimethyl sulfoxide (DMSO, Hybri-Max, sterile-filtered) Sigma Aldrich D2650
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich 53817
Citric acid Sigma Aldrich C2404-100G
Y-27632 dihydrochloride selective p160ROCK inhibitor R&D Systems 1254
L-Ascorbic acid-2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma Aldrich A8960-5G
Sodium selenite Sigma Aldrich S5261-10G
Transferrin (Optiferrin – Defined, Animal-free, Recombinant Human) Invitria 777TRF029
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) R&D Systems 4144-TC-01M
Transforming growth factor beta 1 (TGFβ1) Peprotech 100-21
DMEM/F12 with L-Glutamine and 15 mM HEPES Life Technologies 11330-032
Insulin Sigma Aldrich I9278-5ML
CHIR-99021 HCl Sellekchem S2924
IWR-1 Sigma Aldrich I0161
RPMI 1640 with L-Glutamine Life Technologies 11875-093
B-27 Supplement Minus Insulin Life Technologies A1895601
B-27 Supplement (with Insulin) Life Technologies 17504-044
Fetal bovine serum Life Technologies 10437
Flow Cytometry Reagents
Phosphate buffered saline (10x) Quality Biological Inc. 119-069-151
Hank's balanced salt solution without Ca2+ and Mg2+ Life Technologies 14175-095
BD Cytofix BD Biosciences 554655
BD Phosflow perm buffer III BD Biosciences 558050
16% Paraformaldehyde Thermo Scientific 28906
Methanol Sigma Aldrich 179957-4L
Acetone Mallenckrodt Chemicals  2440-16
Triton X-100 Amresco M236-10ML
Goat serum Life Technologies 16210-064
Trypan blue solution, 0.4% Life Technologies 15250-061
Materials
5 ml Round bottom polystyrene tube (without cap) Corning 352008 For preparation of cells for flow cytometry
5 ml Round bottom polystyrene tube (with 35 µM cell strainer snap cap) Corning 352235 For preparation of cells for flow cytometry
2 ml rubber bulbs Fischer Scientific 03-448-24
9" borosilicate unplugged glass Pasteur pipets BioExpress P-2904-2
0.65 ml Microcentrifuge tubes, graduated, green GeneMate C-3259-G
1.5 ml Microcentrifuge tubes, graduated, red GeneMate C-3260-R
TC20 automated cell counter BioRad 145-0102
Counting slides for TC20 BioRad 145-0011
6-well Flat bottom tissue-culture treated plate Corning 353046
20 ml Syringes BD Plastipak 300613 For filter sterilization of aliquots
Sterile syringe filters, 0.2 µm polyethersulfone VWR 28145-501 For filter sterilization of aliquots
250 ml Filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding Corning 431096 For filter sterilization of bulk media 
500 ml filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding Corning 431097 For filter sterilization of bulk media
Antibodies and Isotype Controls
Anti-TNNI3 (clone: 284 (19C7)) Abcam ab19615 Primary antibody
Anti-TNNT2 (clone: 1C11) Thermo Scientific MA1-16687 Primary antibody
Anti-MYL2 (MLC2v, clone: 330G5) Synaptic Systems 310111 Primary antibody
Anti-MYL7 (MLC2a, clone: 4E7) Abcam AB131661 Primary antibody
Anti-IRX4   Bioss BS-9464R Primary antibody
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG1  Life Technologies A21121 Secondary antibody
Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG2a Life Technologies A21241 Secondary antibody
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG2b Life Technologies A21141 Secondary antibody
Phycoerythrin(PE) Goat anti-rabbit IgG R&D Systems F0110 Secondary antibody
Mouse IgG1 BD Biosciences 557273 Isotype Control
Mouse IgG2a eBiosciences 16-4724-81 Isotype Control
Rabbit IgG-PE R&D Systems IC105P Isotype Control
TaqMan Probesets for qRT-PCR
ACTB Life Technologies Hs01060665
Brachyury T Life Technologies Hs00610080
CASQ2 Life Technologies Hs00154286
IRX4 Life Technologies Hs01100809
ISL1 Life Technologies Hs00158126
MESP1 Life Technologies Hs01001283
MYH11 (SMMHC) Life Technologies Hs00224610
MYH6 Life Technologies Hs01101425
MYL2 (MLC2v) Life Technologies Hs00166405
MYL7 (MLC2a) Life Technologies Hs01085598
MYOG Life Technologies Hs01072232
NKX2.5 Life Technologies Hs00231763
NPPA Life Technologies Hs01081097
POU5F1 Life Technologies Hs04260367
SOX17 Life Technologies HS00751752
TNNI1 Life Technologies Hs00913333
TNNI2 Life Technologies Hs00268536
TNNI3 Life Technologies HS00165957
TNNT2 Life Technologies Hs00165960

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E1848-E1857 (2012).
  2. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nat Protoc. 8, 162-175 (2013).
  3. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
  4. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6, e18293 (2011).
  5. Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453, 524-528 (2008).
  6. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8, 228-240 (2011).
  7. Willems, E., et al. Small-molecule inhibitors of the Wnt pathway potently promote cardiomyocytes from human embryonic stem cell-derived mesoderm. Circ Res. 109, 360-364 (2011).
  8. Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25, 929-938 (2007).
  9. Elliott, D. A., et al. NKX2-5(eGFP/w) hESCs for isolation of human cardiac progenitors and cardiomyocytes. Nat Methods. 8, 1037-1040 (2011).
  10. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nat Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
  11. Zhang, Q., et al. Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals. Cell Res. 21, 579-587 (2011).
  12. Uosaki, H., et al. Efficient and scalable purification of cardiomyocytes from human embryonic and induced pluripotent stem cells by VCAM1 surface expression. PLoS One. 6, e23657 (2011).
  13. Hudson, J., Titmarsh, D., Hidalgo, A., Wolvetang, E., Cooper-White, J. Primitive Cardiac Cells from Human Embryonic Stem Cells. Stem Cells Dev. 21, 1513-1523 (2011).
  14. Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circ Res. 111, 1125-1136 (2012).
  15. Ban, K., et al. Purification of cardiomyocytes from differentiating pluripotent stem cells using molecular beacons that target cardiomyocyte-specific mRNA. Circulation. 128, 1897-1909 (2013).
  16. Toyota, N., Shimada, Y. Differentiation of troponin in cardiac and skeletal muscles in chicken embryos as studied by immunofluorescence microscopy. J Cell Biol. 91, 497-504 (1981).
  17. Saggin, L., Gorza, L., Ausoni, S., Schiaffino, S. Cardiac troponin T in developing, regenerating and denervated rat skeletal muscle. Development. 110, 547-554 (1990).
  18. Kajioka, S., et al. Endogenous cardiac troponin T modulates Ca(2+)-mediated smooth muscle contraction. Sci Rep. 2, 979 (2012).
  19. Franco, D., et al. Myosin light chain 2a and 2v identifies the embryonic outflow tract myocardium in the developing rodent heart. Anat Rec. 254, 135-146 (1999).
  20. Franco, D., Lamers, W. H., Moorman, A. F. Patterns of expression in the developing myocardium: towards a morphologically integrated transcriptional model. Cardiovasc Res. 38, 25-53 (1998).
  21. Poon, E., et al. Transcriptome-guided functional analyses reveal novel biological properties and regulatory hierarchy of human embryonic stem cell-derived ventricular cardiomyocytes crucial for maturation. PLoS One. 8, e77784 (2013).
  22. Lieu, D. K., et al. Absence of transverse tubules contributes to non-uniform Ca(2+) wavefronts in mouse and human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells Dev. 18, 1493-1500 (2009).
  23. Cao, F., et al. Transcriptional and functional profiling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. PLoS One. 3, e3474 (2008).
  24. Satin, J., et al. Calcium handling in human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells. 26, 1961-1972 (2008).
  25. Itzhaki, I., et al. Calcium handling in human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes. PLoS One. 6, e18037 (2011).
  26. Bodor, G. S., Porterfield, D., Voss, E. M., Smith, S., Apple, F. S. Cardiac troponin-I is not expressed in fetal and healthy or diseased adult human skeletal muscle tissue. Clin Chem. 41, 1710-1715 (1995).
  27. Hunkeler, N. M., Kullman, J., Murphy, A. M. Troponin I isoform expression in human heart. Circ Res. 69, 1409-1414 (1991).
  28. Bhavsar, P. K., et al. Developmental expression of troponin I isoforms in fetal human heart. FEBS Lett. 292, 5-8 (1991).
  29. Christoffels, V. M., Keijser, A. G., Houweling, A. C., Clout, D. E., Moorman, A. F. Patterning the embryonic heart: identification of five mouse Iroquois homeobox genes in the developing heart. Dev Biol. 224, 263-274 (2000).
  30. Bruneau, B. G., et al. Cardiac expression of the ventricle-specific homeobox gene Irx4 is modulated by Nkx2-5 and dHand. Dev Biol. 217, 266-277 (2000).
  31. Bao, Z. Z., Bruneau, B. G., Seidman, J. G., Seidman, C. E., Cepko, C. L. Regulation of chamber-specific gene expression in the developing heart by Irx4. Science. 283, 1161-1164 (1999).
  32. Nelson, D. O., Jin, D., Downs, K., Kamp, T. J., Lyons, G. E. Irx4 identifies a chamber-specific cell population that contributes to ventricular myocardium development. Dev Dyn. 243, 381-392 (2013).
  33. Martin, A. F. Turnover of cardiac troponin subunits. Kinetic evidence for a precursor pool of troponin-I. J Biol Chem. 256, 964-968 (1981).
  34. Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 22, 1991-2002 (2013).
  35. Farrell, H. M., et al. Nomenclature of the proteins of cows" milk--sixth revision. Journal of dairy science. 87, 1641-1674 (2004).
  36. Micusan, V. V., Borduas, A. G. Biological properties of goat immunoglobulins. G. Immunology. 32, 373-381 (1977).
  37. Lyons, G. E. In situ analysis of the cardiac muscle gene program during embryogenesis. Trends Cardiovasc Med. 4, 70-77 (1994).
  38. Nakagawa, O., Nakagawa, M., Richardson, J. A., Olson, E. N., Srivastava, D. H. R. T. 1 HRT2, and HRT3: a new subclass of bHLH transcription factors marking specific cardiac, somitic, and pharyngeal arch segments. Dev Biol. 216, 72-84 (1999).
  39. Xin, M., et al. Essential roles of the bHLH transcription factor Hrt2 in repression of atrial gene expression and maintenance of postnatal cardiac function. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 7975-7980 (2007).
  40. Davis, L. M., Rodefeld, M. E., Green, K., Beyer, E. C., Saffitz, J. E. Gap junction protein phenotypes of the human heart and conduction system. J Cardiovasc Electrophysiol. 6, 813-822 (1995).
  41. Minamisawa, S., et al. Atrial chamber-specific expression of sarcolipin is regulated during development and hypertrophic remodeling. J Biol Chem. 278, 9570-9575 (2003).
  42. Larsen, T. H. Atrial natriuretic factor in the heart of the human embryo. Acta Anat (Basel. 138, 132-136 (1990).
  43. Claycomb, W. C. Atrial-natriuretic-factor mRNA is developmentally regulated in heart ventricles and actively expressed in cultured ventricular cardiac muscle cells of rat and human). Biochem J. 255, 617-620 (1988).
  44. Franco, D., et al. Divergent expression of delayed rectifier K(+) channel subunits during mouse heart development. Cardiovasc Res. 52, 65-75 (2001).
  45. Hoogaars, W. M., et al. The transcriptional repressor Tbx3 delineates the developing central conduction system of the heart. Cardiovasc Res. 62, 489-499 (2004).
  46. Hollenberg, S. M., Sternglanz, R., Cheng, P. F., Weintraub, H. Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system. Mol Cell Biol. 15, 3813-3822 (1995).
  47. Srivastava, D., Cserjesi, P., Olson, E. N. A subclass of bHLH proteins required for cardiac morphogenesis. Science. 270, 1995-1999 (1995).
  48. Firulli, A. B., McFadden, D. G., Lin, Q., Srivastava, D., Olson, E. N. Heart and extra-embryonic mesodermal defects in mouse embryos lacking the bHLH transcription factor Hand1. Nat Genet. 18, 266-270 (1998).
  49. Calejo, A. I., et al. Differences in the expression pattern of HCN isoforms among mammalian tissues: sources and implications. Mol Biol Rep. 41, 297-307 (2013).
  50. Stevens, S. M., Pu, W. T. HCN4 charges up the first heart field. Circ Res. 113, 350-351 (2013).
  51. Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nat Cell Biol. 15, 1098-1106 (2013).
  52. Davis, R. P., vanden Berg, C. W., Casini, S., Braam, S. R., Mummery, C. L. Pluripotent stem cell models of cardiac disease and their implication for drug discovery and development. Trends Mol Med. 17, 475-484 (2011).
  53. Mummery, C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. , 107-2733 (2003).
  54. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
  55. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29, 1011-1018 (2011).
  56. Samal, R., et al. OMICS-based exploration of the molecular phenotype of resident cardiac progenitor cells from adult murine heart. J Proteomics. 75, 5304-5315 (2012).
  57. Van Hoof, D., et al. Identification of cell surface proteins for antibody-based selection of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. J Proteome Res. 9, 1610-1618 (2010).
  58. Gundry, R. L., Boheler, K. R., Van Eyk, J. E., Wollscheid, B. A novel role for proteomics in the discovery of cell-surface markers on stem cells: Scratching the surface. Proteomics Clin Appl. 2, 892-903 (2008).
  59. Gundry, R. L., Burridge, P. W., Boheler, K. R. Pluripotent Stem Cell Heterogeneity and the Evolving Role of Proteomic Technologies in Stem Cell Biology. Proteomics. 11, 3947-3961 (2011).
  60. Gundry, R. L., et al. A Cell Surfaceome Map for Immunophenotyping and Sorting Pluripotent Stem Cells. Mol Cell Proteomics. , 303-316 (2012).
  61. Bryder, D., Rossi, D. J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cells: the paradigmatic tissue-specific stem cell. Am J Pathol. 169, 338-346 (2006).
  62. Kondo, M., et al. Biology of hematopoietic stem cells and progenitors: implications for clinical application. Annu Rev Immunol. 21, 759-806 (2003).
  63. Shizuru, J. A., Negrin, R. S., Weissman, I. L. Hematopoietic stem and progenitor cells: clinical and preclinical regeneration of the hematolymphoid system. Annu Rev Med. 56, 509-538 (2005).
  64. Weissman, I. L., Shizuru, J. A. The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases. Blood. 112, 3543-3553 (2008).
  65. Boheler, K. R., Bhattacharya, S., Chuppa, S., Riordon, D. R., Kropp, E., Burridge, P. W., Wu, J. C., Wersto, R. P., Wollscheid Rao,, Gundry, B., L, R. A Human Pluripotent Stem Cell Surface N-Glycoproteome Resource Reveals New Markers, Extracellular Epitopes, and Drug Targets. Stem Cell Reports. , 185-203 (2014).

Tags

ביולוגיה תאית גיליון 91 תאי גזע pluripotent אנושיים מושרה cytometry זרימה בידול מכוון cardiomyocyte IRX4 TNNI3 TNNT2 MCL2v MLC2a
בידול יעילות גבוה של תאי גזע pluripotent האדם לשריר לב ואפיון על ידי cytometry הזרימה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bhattacharya, S., Burridge, P. W.,… More

Bhattacharya, S., Burridge, P. W., Kropp, E. M., Chuppa, S. L., Kwok, W. M., Wu, J. C., Boheler, K. R., Gundry, R. L. High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (91), e52010, doi:10.3791/52010 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter