Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

High Efficiency Differentiering af humane pluripotente stamceller til hjertemuskelceller og karakterisering ved hjælp af flowcytometri

Published: September 23, 2014 doi: 10.3791/52010
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 3, 2, 4,5, 1,6
1Department of Biochemistry, Medical College of Wisconsin, 2Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 3Department of Anesthesiology, Medical College of Wisconsin, 4Stem Cell and Regenerative Medicine Consortium, LKS Faculty of Medicine, Hong Kong University, 5Division of Cardiology, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Cardiovascular Research Center, Biotechnology and Bioengineering Center, Medical College of Wisconsin
* These authors contributed equally

Summary

Artiklen beskriver den detaljerede metode til effektivt at differentiere humane pluripotente stamceller til kardiomyocytter ved selektivt at modulere Wnt vej, efterfulgt af flowcytometri analyse af referencemarkører at vurdere homogenitet og identitet af befolkningen.

Abstract

Der er et presserende behov for at udvikle metoder til at reparere det beskadigede hjerte, opdager nye terapeutiske lægemidler, der ikke har toksiske virkninger på hjerte, og forbedre strategier til nøjagtigt modellere hjertesygdomme. Potentialet for at udnytte menneskeskabte pluripotente stamceller (hiPSC) teknologi til at generere hjertemuskulatur "i en skål" for disse applikationer fortsætter med at generere høj entusiasme. I de senere år har mulighed for effektivt at generere cardiomyogenic celler fra humane pluripotente stamceller (hPSCs) stærkt forbedret, tilbyder os nye muligheder for at modellere meget tidlige stadier af menneskets kardiel udvikling ellers ikke har adgang. I modsætning til mange tidligere fremgangsmåder er cardiomyocyte differentiering protokollen beskrevet her kræver ikke celleaggregering eller tilsætning af activin A eller BMP4 og robust genererer kulturer af celler, der er yderst positivt for kardial troponin I og T (TNNI3, TNNT2) iroquois- klasse homeodomænet proteinIRX-4 (IRX4), myosin regulerende let kæde 2, ventrikulær / hjertemuskulaturen isoform (MLC2v) og myosin regulerende let kæde 2, atrial isoform (MLC2a) på dag 10 på tværs af alle humane embryonale stamceller (embryonale) og hiPSC linjer testet dato. Celler kan passeres og opretholdt i mere end 90 dage i kultur. Strategien er teknisk enkel at gennemføre og omkostningseffektive. Karakterisering af cardiomyocytter stammer fra pluripotente celler ofte omfatter analyse af referencemarkører, både mRNA og proteinniveauet. Til proteinanalyse, flowcytometri er et kraftfuldt analytisk værktøj til vurdering af kvaliteten af ​​celler i kultur og bestemme underpopulation homogenitet. Dog kan teknisk variation i prøveforberedelse væsentlig indflydelse kvaliteten af ​​flowcytometri data. Derfor bør standardisering af farvningsprotokoller lette sammenligninger mellem forskellige differentiering strategier. Derfor optimeret farvningsprotokoller til analyse af IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3 og TNNT2 ved flowcytometri er beskrevet.

Introduction

Produktion af kardiomyocytter fra hPSCs, herunder embryonale og hiPSC, kan fungere som en in vitro model af meget tidlige humane kardiale udviklingsprocesser, som giver indsigt i etaper ellers ikke har adgang til mekanistiske undersøgelser. Denne model system giver enestående muligheder for at studere de molekylære veje, der styrer kardiel afstamning engagement og celle skæbne specifikation. I de senere år har evne til effektivt at generere cardiomyogenic celler fra hPSCs forbedret 1-15. Men blandt protokoller er cellelinje variation med hensyn til effektivitet i at generere cardiomyogenic celler og timing, ved hvilken cellerne udtrykker kammer-specifikke markører (f.eks ventrikel og atria). Ideelt for fremtidige anvendelser af denne model system mere homogene populationer af funktionelt definerede celler ønskes. I modsætning til tidligere metoder, den cardiomyocyte differentiering protokollen beskrevet her kræver ikke cell sammenlægning eller tilsætningen af ​​Activin A eller knoglemorfogenprotein 4 (BMP4) og håndfast genererer kulturer yderst positivt for TNNI3, TNNT2, IRX4, MLC2v og MLC2a ved dag 10 celler i hele testet til dato alle hESC og hiPSC linjer. Strategien er teknisk enkel at gennemføre, især i forhold til tre-dimensionelle kulturer, massekultur eller embryoid krop baserede strategier 4-9, og blev for nylig defineret i en undersøgelse, der beskriver et lille molekyle med selektiv toksicitet for hPSCs (Boheler et al. ) 65. Funktioner i denne protokol omfatter differentiering af hPSCs i monolagskultur hjælp af et enkelt lag af en hESC kvalificeret matrix (Matrigel), fuldt definerede medier ved hjælp af små molekyler til at modulere Wnt signalering (ligner, men alligevel adskiller sig fra 1,2,7,13), og optimeret flowcytometri farvning metoder til evaluering af differentiering effektivitet og celle identitet. Sammenfattende fordele ved denne protokol i forhold til tidligere rapporter omfatter sin cost-virkningsfuldeness, reproducerbarhed, og den høje effektivitet til at generere kardiomyocytter blandt flere hPSC linjer, herunder hESC og hiPSC linjer.

Flowcytometri er et stærkt analytisk værktøj til at vurdere kvaliteten af ​​celler i kultur og fastlæggelse delpopulation homogenitet, og med korrekt eksperimentelt design, kan give kvantitative målinger. Som med alle antistof-baserede strategier, præcis fortolkning af forsøgsresultater kræver, at elementer af analysen design, herunder antistof koncentration og fiksering og permeabilisering forhold (når målretning intracellulære antigener) omhyggeligt testes for hvert antistof som sub-optimale forhold påvirker effektiviteten af ​​antistof signifikant binding, og derfor fortolkning af resultaterne. Vigtigere er det, hvis kvantificering er påkrævet, monoklonale antistoffer er af afgørende betydning, som polyklonale antistoffer kan genkende flere epitoper og er tilbøjelige til batch-til-batch-variation. I øjeblikket, en række af antistoffer (polyclonal og monoklonale) og farvningsprotokoller er blevet beskrevet til vurdering af in vitro-differentiering, hvilket gør det vanskeligt at sammenligne effektiviteten af cardiomyogenesis blandt protokoller 1,2,9,11. Derfor anvendes monoklonale antistoffer, når tilgængelige for alle flowcytometri analyser. Fremadrettet forventes det, at standardisering af disse farvningsprotokoller, især med hensyn til kvantificering bør bedre muliggøre sammenligning mellem differentiering strategier.

Valget af markører, og deres tilsvarende antistoffer, anvendes til at vurdere renheden af in vitro-cardiomyogenesis varierer blandt rapporter. TNNT2 er blevet betragtet som en indikator af celler forpligtet til cardiomyogenic skæbne og anvendes rutinemæssigt til at vurdere effektiviteten af ​​hjerte differentiering protokoller. Dog er TNNT2 også til udtryk i skeletmuskulatur under tidlig kylling og rotte udvikling 16,17, og det er til stede i human glat muskel 18 in vitro. MLC2v og MLC2a anvendes rutinemæssigt som surrogat markører for ventrikulær og atrial undertyper hhv. Men udfordringer med at stole på MLC2v og MLC2a at bestemme cardiomyocyte undertype i forbindelse med in vitro-differentiering skyldes, at disse genprodukter ikke kan være begrænset til en bestemt kammer hele kardiel udvikling, fra hjerte rør gennem voksen. I gnaver loopes hjerte, MLC2a mRNA er fremherskende i atriale / tilstrømning tarmkanalen område og MLC2v mRNA er fremherskende i ventrikel / udstrømning tarmkanalen regioner. I loopes hjerte, er co-ekspression af MLC2a og MLC2v mRNA'er observeret i tilgangen tarmkanalen, atrioventrikulær kanalen, og udstrømningen tarmkanalen 19,20. Ved 3 dage efter fødslen, MLC2v mRNA begrænset til ventriklen og 10 dage efter fødslen, MLC2a begrænset til atrierne i den neonatale rotte hjerte 19. Derfor fortolkningaf data vedrørende cardiomyogenesis effektivitet og subtype identitet skal ikke kun overveje tilstedeværelsen og mængden af ​​referencemarkør niveauer, men skal overveje udviklingsstadiet (r), som tidspunkter af differentiering, der analyseres svarer. Dette er især vigtigt i betragtning af at modning fase af cardiomyogenic celler frembragt ved in vitro differentiering af hPSCs ligner nærmest de embryonale / føtale udvikling 21-25. Således bygger på en markør rumlige udtryk i den postnatale hjerte kan ikke være hensigtsmæssigt for vurderingen af ​​hPSC-afledte celler, i det mindste i nogle tilfælde.

I et forsøg på at fremme udviklingen af mere specifikke kriterier for cardiomyocyte identitet in vitro, er TNNI3 anses for at være en værdifuld markør for at vurdere cardiomyogenesis in vitro som det er begrænset til hjertemusklen hele embryogenese i kylling og zebrafisk 15,20og er fraværende i human føtal skeletmuskel 26. Mens TNNI1 er til stede i human føtal hjerte, TNNI3 er den eneste TNNI isoform til stede i normalt voksent hjerte 27,28. Vedrørende cardiomyocyte undertype identitet, IRX4 29-31 er en informativ markør for celler med en ventrikulær skæbne. På proteinniveauet IRX4 nylig blevet vist at være begrænset til ventriklen fra lineære hjerte røret gennem neonatale stadier i musen 32. Følgelig er optimeret farvningsprotokoller til analyse af TNNI3 og IRX4 ved flowcytometri beskrevet. Til vores viden, er dette den første beskrivelse af en fremgangsmåde til effektiv antistof-baserede farvning og analyse af IRX4 niveauer i humane cardiomyocytter ved flowcytometri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Løsning og medier Forberedelse

  1. embryonale Kvalificeret Matrix Coating stamopløsning
    1. Langsomt tø embryonale kvalificeret matrix (5 ml) på is ved 4 * C natten over. Dispensere portioner i nedkølede, 1,5 ml sterilt mikrocentrifugerør og straks opbevares ved -20 ° C.
      BEMÆRK: rumfang af prøve vil variere baseret på parti og ligger typisk i området fra 270 til 350 pi. Producent giver oplysninger om mængden af ​​prøve kræves for at opnå en 1x koncentration efter fortynding i 25 ml, som beskrevet i trin 2.1.
  2. hPSC Media Stamopløsninqer
    1. Brug ultrarent vand som fortyndingsmiddel, medmindre andet er angivet. Sterilisere alle komponenter ved hjælp af en 0,22 um filter. Opbevar følgende som bulkopløsninger ved 4 * C: natriumbicarbonat (75 mg / ml); citronsyre (10 mM, pH = 3).
    2. Sterilisere alle komponenter, der bruger 0,2 um sprøjtefilter og gemme hver som portioner ved -20 ° C: Rho-kinase (ROCK) hæmmer Y-27632 (10mM i DPBS 100 ul alikvot); L-ascorbinsyre-2-phosphat (64 mg / ml, 500 pi portion); natriumselenit (70 ug / ml, 100 ul alikvot); transferrin (50 mg / ml, 107 pi portion); fibroblastvækstfaktor 2 (FGF2, 200 ng / pi i DPBS 250 pi portion); transformerende vækstfaktor beta 1 (TGFβ1, 100 ng / gl i kold 10 mM citronsyre, 10 pi alikvot).
  3. hPSC Media E8 Solution Sammensætning
    1. Forbered medier ved hjælp af alikvoter fremstillet i trin 1.2: DMEM / F12 (med L-glutamin og HEPES, 500 ml), natriumbicarbonat (3,62 ml, endelig: 543 ug / ml), L-ascorbinsyre-2-phosphat (500 pi; endelige : 64 ug / ml), natriumselenit (100 pi; endelig: 140 ng / ml), transferrin (107 pi; endelig: 10,7 ug / ml), insulin (1 ml endelig: 20 ug / ml), FGF2 (250 pi; endelig: 100 ng / ml), TGFβ1 (10 pi; endelig: 2 ng / ml).
    2. Kombiner alle komponenter Filtersteriliser og opbevares ved 4 ° C i op til 2 uger.
  4. hPSC Media E8 med ROCK-hæmmer
    1. Der tilsættes 15 pi ROCK-inhibitor til 12 ml E8 medier fremstillet som ovenfor, og bland godt. Sørg for, at den endelige koncentration er 10 uM efter tilsætning af celler / medier i trin 3.7.
  5. Stamopløsninger af Wnt modulatorer
    1. Opbevar følgende delprøver ved -20 * C. CHIR 99021 (6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5​-methyl-1 H -imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethy​l]amino]-3-pyridinecarbonitrile; 10 mM i DMSO, 15 pi alikvote). IWR-1 (4 (-1,3,3a, 4,7,7a-hexahydro-1,3-dioxo-4,7-methano-2H-isoindol-2-yl)-N-8-quinolinyl-benzamid; 10 mM i DMSO, 6 pi alikvote).
  6. Differentiering Medier
    1. Forbered differentiering medier # 1 med RPMI 1640 (med L-glutamin) med 2% B27 minus insulin supplement.
    2. Forbered differentiering medier # 2 med RPMI 1640 (med L-glutamin) med 2% B27 plus insulin tillæg og 2% FBS.
  7. Celle Wash Solution feller Cell Culture
    1. Brug Dulbeccos phosphatbufret saltvand (DPBS), uden calcium eller magnesium.
  8. Cell vaskebuffer til flowcytometri
    1. Brug phosphatbufret saltvand (PBS uden calcium eller magnesium) med 1% FBS. Opbevar ved 4 * C.
  9. Celle Vedligeholdelse Løsning til flowcytometri
    1. Brug Hanks Balanced Salt Solution (HBSS, uden calcium eller magnesium) med 5% FBS. Opbevar ved 4 * C.
  10. Fiksering Løsninger til flowcytometri
    1. Brug Cytofix buffer som fiksering opløsning TNNI3 og IRX4 antistoffer.
    2. Brug 4% paraformaldehyd i 1x PBS (gøre frisk) som fiksering løsning for TNNT2 og MLC2a antistoffer.
    3. Brug 70% methanol / 30% acetone som fiksering opløsning MLC2v antistof.
    4. Opbevar alle løsninger ved 4 * C.
  11. Permeabilisering Løsninger til flowcytometri
    1. Brug Phosflow Perm Buffer III som permeabilization løsning feller TNNI3 og IRX4 antistoffer. Opbevares ved stuetemperatur (25 ° C).
    2. Brug 0,2% Triton X-100 i 1x PBS som permeabilization løsning for TNNT2, MLC2v og MLC2a antistoffer. Opbevar ved 4 * C.
  12. Blokering Løsning
    1. Brug 10% gedeserum i 1x PBS. Gøre frisk og opbevares ved 4 ° C indtil brug.

2. Plade Coating

  1. Langsomt tø 1 portion af embryonale kvalificeret matrix ved 4 * C i 30 min, tilsættes til 25 ml kølet DMEM / F12 og bland godt i steriliseret vævskultur hætte umiddelbart før coating 6-brønds plader.
  2. 1 ml per brønd i en 6-brønds plade under steriliseret vævskultur hætte (1 aliquot af embryonale kvalificeret matrix er tilstrækkelig til at belægge fire 6-brønds plader).
  3. Tillad hESC kvalificeret matrix for at sætte i 30 minutter ved stuetemperatur under kølerhjelmen. Aspirere overskydende embryonale kvalificerede matrix og tilsættes 2 ml E8 medier med ROCK-hæmmer til hver brønd. Brug plader med det samme, eller hvis desIRED opbevar ved 4 ° C umiddelbart efter udpladning i op til 1 uge og tempereres til stuetemperatur i 30 minutter før brug.

3. Passage og vedligeholdelse af udifferentierede hPSCs i monolagskultur

  1. Vedligehold hPSCs i monolagskultur i 6-brønds plader og udfør alle trin under en steril vævskultur hætte.
  2. Brug hPSC linjer, der er veletableret (> P20) og udviser en homogen morfologi uden tilstedeværelse af celler med en neural, epithelial- eller fibroblastlignende morfologi. Sikre prolifererer robust og i gennemsnit passage hver tre dage ved 75% konfluens, når podet på 0,75 x 10 6 per brønd.
  3. Passage hPSCs med afstandtagen til den enkelt celle niveau, der mindst 5x før start af differentiering for at sikre maksimal differentiering effektivitet. Passage hPSCs, aspireres E8 medier og to gange vask celler med 4 ml 1x DPBS (opvarmet til stuetemperatur). Der tilsættes 1 ml cellen detachling opløsning (opvarmet til stuetemperatur) til hver brønd og forlade godt uforstyrret i 3-7 minutter, indtil cellegrænser begynder at runde op.
  4. Brug en bomuld-sluttet glaspipette med pære til at fjerne celler og overføres til et 15 ml konisk rør indeholdende 1 ml DMEM / F12-medium (for at inaktivere celle løsrivelse opløsning).
  5. Fjern 10 pi alikvot af celle opløsningen og blandes med 10 ul af trypanblåt i et mikrocentrifugerør. Tæl celler (fx automatiseret eller manuel hæmocytometer), mens resten af cellerne opsamles ved centrifugering ved 130 xg i 5 minutter ved stuetemperatur. Ved hjælp af denne protokol, forventer 70-80% levedygtighed ved hjælp af en automatiseret hæmocytometer og fremadrettet basen alle celle numre på de samlede celletal.
  6. Aspirer medier og resuspender cellepelleten i DMEM / F12 til en slutkoncentration på 0,75 x 10 6 celler pr 500 pi.
  7. Tilsæt 500 pi af cellesuspension til hver brønd i en 6-brønds plade, hvor hver brønd contains 2 ml E8 medier med ROCK-hæmmer, fremstillet i trin 2.3. Forlader plade på bordpladen, forsigtigt bevæger sig i en front-to-back og fra side til side bevægelse til ensartet sprede celler på tværs af godt. Retur celler til inkubator ved 5% CO2, 37 ° C.
  8. Begyndende 24 timer efter passage erstatte medier dagligt med 2 ml / brønd E8 uden ROCK inhibitor. Optimer podningstæthed at opnå 100% sammenløb før start af differentiering. Seed 0,75 x 10 6 celler / brønd fire dage før start af differentiering, men optimere for hver cellelinie efter behov.

4. Cardiomyocyte Induktion af hPSCs ved Selektiv Graduering af Wnt Pathway

  1. Opdater medier (2 ml / brønd) dagligt i dagene 0-7, og hver anden dag efter dag 8.
  2. På dag 0, begynder differentiering proces ved at erstatte E8 medier med differentiering medier # 1. Tilsæt 1,2 pi CHIR (6 uM endelig) til hver brønd. Gentag på dag 1.
  3. På dagene 2-3, erstatte med frisk differendybde og kan medier nr.1.
  4. På dag 4 erstatte med frisk differentiering medier nr.1. Tilsæt 1 pi IWR-1 (5 uM endelig) til hver brønd. Gentag på dag 5.
  5. På dagene 6-7, erstatte med frisk differentiering medier nr.1.
  6. På dag 8, erstat med frisk differentiering medier # 2.
  7. Fortsæt med at erstatte med differentiering medier # 2 hver anden dag i den ønskede tid af kulturen.
  8. Hvis det ønskes, passage kardiomyocytter anvender cellen detachement løsning efter trinene i 3,3-3,6, men erstatte medier med differentiering medier # 2. Under passage, dissociere kardiomyocytter i små klynger af ~ 3-10 celler. Frø på ~ 6 x 10 5 celler per brønd ved hjælp af hESC kvalificeret matrix coatede brønde og differentiering medier 2 #.

5. samling af celler til flowcytometri

  1. Udfør alle de resterende aspekter af trin 5-9 på laboratoriet bænken (dvs. ikke steril).
  2. Aspirer vækstmedier og to gange vask celler med 1x PBS.Der tilsættes 1 ml af cellen løsrivelse opløsning (opvarmet til stuetemperatur) til hver brønd og henstår i 3-7 minutter, indtil cellegrænser begynder at runde op. Brug en bomulds-sluttet borosilikatglas engangs 9 "pipette med pære til at fjerne celler og overføres til en 15 ml konisk rør på is.
  3. Gennem resten af ​​protokollen, vedligeholde cellerne på is og udføre centrifugeringer ved 200 xg i 5 min ved 4 * C.
  4. Saml cellerne ved centrifugering og aspirat løsning. Resuspender cellerne i 10 ml cellevask løsning med en 10 ml serologisk pipette med gentagen findeling at sikre celleklumper spredes ind i enkeltceller. Tæl celler som i trin 3.5, mens resten af ​​cellerne opsamles ved centrifugering.
  5. Resuspender cellerne i cellevask løsning at tage sig til helt at opdele cellepellet og alikvot 1 x 10 6 celler pr runde bund rør. Saml cellerne ved centrifugering og aspirat løsning.

6. Fiksering ogPermeabilisering Celler til intracellulær antigenfarvning

  1. Tilsæt 100 pi fiksering løsning cellepellet. Tilføj løsning dråbevis med løbende blid hvirvelblanding og derefter indstille på is i 15 min.
  2. Tilsæt 3 ml cellevask løsning. Saml cellerne ved centrifugering og aspirat løsning.
  3. Tilsæt 100 pi permeabilisering løsning cellepellet. Tilføj løsning dråbevis med kontinuerlig blid vortexblanding derefter indstille på is i 30 min. Brug Fastgørelses- og permeabilisering betingelser som beskrevet for hvert antistof i tabel 1.
  4. Tilsæt 3 ml cellevask løsning. Saml cellerne ved centrifugering og aspirat løsning. Gentag for i alt to vaske efter permeabilisering.
Primært antistof (klon) Immunogen / genkendte epitop Istotype Kontrol Mængden af primært antistof pr 1 x 10 6 celler i 100 pi Fiksering Løsning Permeabilisering Solution Sekundært antistof Mængden af sekundært antistof / 1 x 10 6 celler i 100 pi
For procent positive målinger For antigen Kvantificering
TNNI3 (284 (19C7) ISASRKLQL (human) Mus IgG2b 1,0 ug 3,0 ug BD Cytofix BD Phosflow Perm III Gede-anti-muse-IgG2b-Alexa488 600 ng
TNNT2 (1C11) Fuld længde oprenset nativ human troponin T-protein. Mus IgG1 1,0 ug 2,0 ug 4% PFAi 1% PBS 0,2% Triton X-100 i 1% PBS Gede-anti-muse-lgG1 - Alexa 488 600 ng
MLC2v (330G5) FDPEGKG Muse-IgG2a 2,0 ug 3,0 ug 70% methanol / 30% acetone 0,2% Triton X-100 i 1% PBS Gede-anti-muse-IgG2a - Alexa 647 600 ng
MLC2a (4E7) humane fuldlængde rekombinant protein af human MYL7 produceret i E. coli Mus IgG1 0,5 ug 3,0 ug 4% PFA i 1% PBS 0,2% Triton X-100 i 1% PBS Gede-anti-muse-lgG1 - Alexa 488 600 ng
IRX4 LQEHRKNP
YPTKGEKI
MLAIITKM
TLTQVST 		Kanin-IgG 0,5 ug 0,5 ug BD Cytofix BD Phosflow Perm III Gede-anti-raBBIT IgG-PE 600 ng

Tabel 1. antistofkoncentrationer. Listed er det primære antistof, klon (hvis monoklonale), optimerede koncentrationer og fiksering og permeabilisering betingelser for hvert primært og sekundært antistof anvendes til flowcytometri analyser. Som antistof stock koncentrationer kan variere mellem sælgere af samme klon, slutkoncentrationerne af hvert antistof pr 1 x 10 6 celler i et fast assayvolumen, snarere end fortyndinger, der er forudsat. Den anvendte immunogen til at frembringe antistoffet eller epitop, der genkendes af antistoffet, som af fabrikanten, er angivet men ikke eksperimentelt bekræftet her.

7. antistoffarvning

  1. For hvert forsøg, omfatter et ufarvet kontrol pr fiksering / permeabilization tilstand og den passende isotypekontrol for hver primære antistof anvendes. Omfatte ikke-cardiomyocyte celletyper som negative kontroller (fx pluripotente stamceller eller fibroblaster). Brug isotypekontroller i samme koncentration som tilsvarende primære antistof (se tabel 1).
  2. Resuspender cellerne i 100 pi blokerende løsning med en P200 pipette at opdele celler. Sæt prøverne på is i 25 min med blide vuggende.
  3. Uden at fjerne blokerende opløsning tilsættes primært antistof eller isotypekontrol pr retningslinjerne i tabel 1. Inkuber 45 minutter på is med blid vuggen.
  4. Tilsæt 3 ml cellevask løsning. Saml cellerne ved centrifugering og aspirat løsning. Gentag for i alt to vaske efter primær antistofmærkning.
  5. Hvis der anvendes en fluorofor-konjugeret primære antistof, gå til 8.1. Når der anvendes en ukonjugeret primært antistof (som for alle markører er beskrevet her), udføre mærkning med sekundært antistof, der er konjugeret til en fluorofor som følger.
  6. Resuspender cellerne i 100 pi blokerende opløsning ved hjælp af en P200 pipette til DISAggregate celler.
  7. Tilføj sekundært antistof pr retningslinjerne i tabel 1. Inkuber 30 minutter på is med blid vuggende.
  8. Tilsæt 3 ml cellevask løsning. Saml cellerne ved centrifugering og aspirat løsning. Gentag for i alt to vaske efter sekundært antistof mærkning.

8. Forberedelse af celler til flowcytometri

  1. Resuspender cellerne i 400 ul celle vedligeholdelse løsning med en P1000 pipette at opdele celler.
  2. Forbered en cellefilter hætte på en rund bund rør ved præ-befugtning med 50 ul celle vedligeholdelse løsning. Sæt røret på is. Brug cellefilter hætten for at forhindre celleaggregater tilstopning flowcytometeret.
  3. Overførsel celle løsning cellefilter hætte og tillade cellesuspension at dræne ved tyngdekraften. Tryk bunden af ​​røret forsigtigt på bænken toppen som nødvendigt, så celler opsamles i rør og sat tilbage på is så hurtigt som muligt. Skyl si med 250 ul celle vedligeholdelse, såurening at sikre maksimal genvinding af celler.
  4. Oprethold celler på is og beskytte mod lys indtil analyse ved flowcytometri.

9. Flowcytometri Analyse

Detaljerede indstillinger Købet vil variere blandt instrumenter. Grundlæggende parametre at overveje for optimal dataindsamling er beskrevet nedenfor.

  1. For optimal strøm stabilitet sikre, at dysen størrelsen overstiger doseret med 5-6 gange diameteren af ​​cellen blive analyseret.
    BEMÆRK: Dette kan variere mellem de forskellige instrumenter, men er en vigtig overvejelse både for analysatorer og vælge passende dyse størrelse for celle sortering. Den gennemsnitlige diameter af dagen 10 cardiomyocytes er 11 um (lige 8-14 um); således en standard 150 um prøveinjektion rør på en analysator fungerer godt.
  2. Umiddelbart forud for dataanalyse, at vortex hvert rør øjeblik for at sprede celleaggregater.
  3. Optimer fremad og sidespredning spænding indstillinger for hver celletype baseret påufarvet kontrol for hver fiksering / permeabilization tilstand, der anvendes i forsøget, således at bestandene af interesse er på skalaen og centreret (figur 2A).
    1. Bevar disse indstillinger i hele et enkelt eksperiment og være konsekvent fra eksperiment til eksperiment på det samme instrument, som store forskydninger kan indikere mulige problemer med flowcytometret eller prøveforberedelse.
  4. For hver fluorophor, analysere isotypekontrol og justere passende laser spænding at bestemme den minimale intensitet kræves for at opnå en fluorescenshistogram der viser både venstre og højre kanter af top. Vedligehold laser indstillinger for hver isotypekontrol ved erhvervelse af data om tilsvarende antistof-farvede prøver.
    BEMÆRK: Signal glider ofte sker over tid på det samme instrument. Det er vigtigt at justere laser indstillinger ved begyndelsen af ​​hvert eksperiment baseret på passende isotypekontrol.
  5. Saml mindst10.000 begivenheder. 50.000 begivenheder foretrækkes.
  6. Til statistiske analyser til gate levende cellepopulation udelukke snavs (figur 2A). Bestem procent positive celler inden for det kanaliserede befolkning baseret på markør placering, der giver ≤2% bidrag fra isotypekontrol, som vist i figur 2B, C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

På dag 0 celler er 100% sammenflydende kompakt morfologi og minimal cellerester. På dagene 1-2, er det almindeligt at observere en betydelig celledød (40-50%), men vedhæftede celler bevarer kompakt morfologi (figur 1A). I løbet af denne tid, medier er orange og grumset. Pink medier indikerer overdreven celledød, og i dette tilfælde, og bekræft med trypanblåt og afbryde hvis celledød overstiger 70%. Celler vil komme i løbet af dag 3-4 og densitet vil stige. Under dage 5-6, forekommer minimal celledød og tætte plastre kan begynde at dukke op. Ved dage 7-8 er et sammenflydende monolag opnås med kompakt morfologi spækket med tætte patches. Celler begynder spontant kontraherende ved dag 8 og de første sammentrækninger vil ofte være synlig i de tætte patches. Ved dag 10, observeres mere robust sammentrækning og vil fortsætte med at sprede sig over hele kulturen i de efterfølgende dage. Immuncytokemi farvning for α-actinin og TNNT2 viser sarkomer struktur(Figur 1A). Som målt ved kvantitativ realtid polymerasekædereaktion (QRT-PCR), mRNA-niveauer af referencemarkører af mesoderm og cardiomyogenic engagement display temporale profiler som forventet (figur 1B), med robust ekspression af hjerte markører homeobox protein NKX-2.5 (NKX2.5 ), TNNI3, MLC2a, MLC2v og myosin-6 (MYH6). Meget lavt til ikke-påviselige niveauer af glat muskulatur (Myosin tung kæde 11, MYH11) og skeletmuskulatur (myogenin, MYOG) markører er rutine. I overensstemmelse med den tidlige udvikling, hvor udtrykket er observeret i både hjerte-og skeletmuskulatur, før at være begrænset til skeletmuskulaturen i den voksne 20,27,28, troponin isoformer TNNI1 og TNNI2 er robust detekteres under dage 7-8.

I overensstemmelse med andre rapporter, dette in vitro differentiering strategi genererer kardiomyocytter med karakteristika for tidlige kardiale stamceller (afrundet morfologi, co-ekspression af MLC2a, MLC2v) 19 30,32. I flowcytometri vil lysspredningen profilerne varierer blandt celletyper og ændre sig betydeligt blandt fiksering / Permeabilisering betingelser (figur 2A). Under disse forskellige celleforarbejdningsprocesser betingelser, flowcytometri analyse afslører isotypekontroller med enkelte toppe med en klar sondring mellem isotypekontrol og antistof (figur 2B). Pluripotente celler eller andre ikke-cardiomyocyte celler er negativ for markører, der anvendes her.

Brug af denne differentiering og farvningsprotokol, den resulterende cellepopulation er typisk 99% TNNI3, 96% IRX4 +, 91% MLC2v +, og 96% MLC2a + af 10 dages differentiering som målt ved flowcytometri. 99% TNNT2 + celler observeres (figur 2C, 2D), men som beskrevet ovenfor, TNNT2 er ikke eneståendetil kardiomyocytter under udvikling og dermed påstanden om, at cellerne er 99% autentisk cardiomyocytter ved dag 10 er baseret på TNNI3 protein. Det bemærkes, at med fortsat dyrkning over dag 10, vil protein niveauer af strukturelle proteiner forbliver høj, selv om relativ genekspressionsniveauer vil falde i forhold til maksimal ekspression som overvåget ved QRT-PCR i overensstemmelse med proteinstabilitet og omsætningshastigheder på 3,2 og 3,5 dage henholdsvis for TNNI og TNNT 33. Et eksempel på denne observation er vist for TNNT2 (højeste mRNA-ekspression på dag 11 (figur 1B), robuste proteinniveauer på dag 20 + (Figur 2E).

Figur 1
Figur 1. Samlet skematisk cardiomyocyte differentiering fra hPSCs og repræsentative data. (A) Skematisk af cardiomyocyte differentiatio n protokol kommenteret med tilsvarende stadium af afstamning og / eller celle skæbne engagement. Repræsentative fase kontrast billeder af celler ved større stadier af differentiering proces. Scale bar = 10 um. Yderst til højre = immunocytokemi billede af α-actinin (grøn) overlejret med TNNT2 (rød) og kerner (blå). (B) QRT-PCR-analyse (til sonde sæt, se Materialer tabellen) af 18. henvisning mesoderm og hjerte udvikling markører i løbet af de første 17 dage af differentiering. Alle data er et gennemsnit af tre biologiske replikater hver analyseret i tre eksemplarer, hvor fejlsøjler repræsenterer standardafvigelsen af ​​middelværdien, og normaliseres til actin (ACTB). Besked niveauer for alle tidspunkter er i forhold til den første dag i differentiering, hvor Ct-værdier er påviselige (dvs. Ct <35). Klik her for at se en større version af dette tal.

t "FO: keep-together.within-page =" altid "> Figur 2
Figur 2. Karakterisering af kardiomyocytter ved flowcytometri og elektrofysiologi. (A) Lette scatter profiler af dag 10 hiPSC-afledte kardiomyocytter under forskellige Fastgørelses- og permeabilisering forhold. 50.000 hændelser blev opsamlet, og gated befolkning (dvs. eksklusive vragrester), der anvendes til statistiske analyser er vist med rødt. (B) Histogrammer af IRX4 på dag 10 af differentiering ved hjælp af tre forskellige fiksering / permeabilisering betingelser, der illustrerer forskelle i farvning effektivitet blandt de metoder. Mellemværker viser forskelle i farvning af IRX4 på hiPSCs anvender hver betingelse. Disse data viser, hvorfor methanol / acetone undgås IRX4 grund af lav, men detekterbar, farvning på hiPSCs. (C) Histogrammer af TNNI3, TNNT2, MLC2v, MLC2a på dag 10 af differenti ation hjælp optimerede farvning betingelser for maksimal procent positive celler er beskrevet i tabel 1. (D) Histogrammer af TNNT2 fra antistoftitrering eksperimenter, der illustrerer, at 0,5 ug er det mindste beløb, der kræves til måling af 99% TNNT2 + celler, men at 2 ug er mætningspunktet kræves til kvantificering. Kun en enkelt isotypekontrol vises, men titreringsforsøg er beregnet på baggrund af en sammenligning hvert antistof til dets tilsvarende titrering af isotypekontrol. (E) Kvantificering af TNNT2 protein på kardiomyocytter på dag 0-24 af differentiering, repræsenteret som den mediane fluorescensintensitet forskel mellem antistof og isotypekontrol for hvert tidspunkt. (F) potentiale Action optaget fra en enkelt spontant kontraherende ventrikel-lignende cardiomyocyte på dag 46 af differentiering ved anvendelse af helcelle-strømtang konfiguration af patch-clamp-teknik.es / ftp_upload / 52010 / 52010fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture
BD Matrigel, hESC-qualified matrix BD Biosciences 354277
Accutase cell detachment solution Stem Cell Technologies 7920
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium Life Technologies 14190-136
Dimethyl sulfoxide (DMSO, Hybri-Max, sterile-filtered) Sigma Aldrich D2650
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich 53817
Citric acid Sigma Aldrich C2404-100G
Y-27632 dihydrochloride selective p160ROCK inhibitor R&D Systems 1254
L-Ascorbic acid-2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma Aldrich A8960-5G
Sodium selenite Sigma Aldrich S5261-10G
Transferrin (Optiferrin – Defined, Animal-free, Recombinant Human) Invitria 777TRF029
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) R&D Systems 4144-TC-01M
Transforming growth factor beta 1 (TGFβ1) Peprotech 100-21
DMEM/F12 with L-Glutamine and 15 mM HEPES Life Technologies 11330-032
Insulin Sigma Aldrich I9278-5ML
CHIR-99021 HCl Sellekchem S2924
IWR-1 Sigma Aldrich I0161
RPMI 1640 with L-Glutamine Life Technologies 11875-093
B-27 Supplement Minus Insulin Life Technologies A1895601
B-27 Supplement (with Insulin) Life Technologies 17504-044
Fetal bovine serum Life Technologies 10437
Flow Cytometry Reagents
Phosphate buffered saline (10x) Quality Biological Inc. 119-069-151
Hank's balanced salt solution without Ca2+ and Mg2+ Life Technologies 14175-095
BD Cytofix BD Biosciences 554655
BD Phosflow perm buffer III BD Biosciences 558050
16% Paraformaldehyde Thermo Scientific 28906
Methanol Sigma Aldrich 179957-4L
Acetone Mallenckrodt Chemicals  2440-16
Triton X-100 Amresco M236-10ML
Goat serum Life Technologies 16210-064
Trypan blue solution, 0.4% Life Technologies 15250-061
Materials
5 ml Round bottom polystyrene tube (without cap) Corning 352008 For preparation of cells for flow cytometry
5 ml Round bottom polystyrene tube (with 35 µM cell strainer snap cap) Corning 352235 For preparation of cells for flow cytometry
2 ml rubber bulbs Fischer Scientific 03-448-24
9" borosilicate unplugged glass Pasteur pipets BioExpress P-2904-2
0.65 ml Microcentrifuge tubes, graduated, green GeneMate C-3259-G
1.5 ml Microcentrifuge tubes, graduated, red GeneMate C-3260-R
TC20 automated cell counter BioRad 145-0102
Counting slides for TC20 BioRad 145-0011
6-well Flat bottom tissue-culture treated plate Corning 353046
20 ml Syringes BD Plastipak 300613 For filter sterilization of aliquots
Sterile syringe filters, 0.2 µm polyethersulfone VWR 28145-501 For filter sterilization of aliquots
250 ml Filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding Corning 431096 For filter sterilization of bulk media 
500 ml filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding Corning 431097 For filter sterilization of bulk media
Antibodies and Isotype Controls
Anti-TNNI3 (clone: 284 (19C7)) Abcam ab19615 Primary antibody
Anti-TNNT2 (clone: 1C11) Thermo Scientific MA1-16687 Primary antibody
Anti-MYL2 (MLC2v, clone: 330G5) Synaptic Systems 310111 Primary antibody
Anti-MYL7 (MLC2a, clone: 4E7) Abcam AB131661 Primary antibody
Anti-IRX4   Bioss BS-9464R Primary antibody
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG1  Life Technologies A21121 Secondary antibody
Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG2a Life Technologies A21241 Secondary antibody
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG2b Life Technologies A21141 Secondary antibody
Phycoerythrin(PE) Goat anti-rabbit IgG R&D Systems F0110 Secondary antibody
Mouse IgG1 BD Biosciences 557273 Isotype Control
Mouse IgG2a eBiosciences 16-4724-81 Isotype Control
Rabbit IgG-PE R&D Systems IC105P Isotype Control
TaqMan Probesets for qRT-PCR
ACTB Life Technologies Hs01060665
Brachyury T Life Technologies Hs00610080
CASQ2 Life Technologies Hs00154286
IRX4 Life Technologies Hs01100809
ISL1 Life Technologies Hs00158126
MESP1 Life Technologies Hs01001283
MYH11 (SMMHC) Life Technologies Hs00224610
MYH6 Life Technologies Hs01101425
MYL2 (MLC2v) Life Technologies Hs00166405
MYL7 (MLC2a) Life Technologies Hs01085598
MYOG Life Technologies Hs01072232
NKX2.5 Life Technologies Hs00231763
NPPA Life Technologies Hs01081097
POU5F1 Life Technologies Hs04260367
SOX17 Life Technologies HS00751752
TNNI1 Life Technologies Hs00913333
TNNI2 Life Technologies Hs00268536
TNNI3 Life Technologies HS00165957
TNNT2 Life Technologies Hs00165960

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E1848-E1857 (2012).
  2. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nat Protoc. 8, 162-175 (2013).
  3. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
  4. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6, e18293 (2011).
  5. Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453, 524-528 (2008).
  6. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8, 228-240 (2011).
  7. Willems, E., et al. Small-molecule inhibitors of the Wnt pathway potently promote cardiomyocytes from human embryonic stem cell-derived mesoderm. Circ Res. 109, 360-364 (2011).
  8. Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25, 929-938 (2007).
  9. Elliott, D. A., et al. NKX2-5(eGFP/w) hESCs for isolation of human cardiac progenitors and cardiomyocytes. Nat Methods. 8, 1037-1040 (2011).
  10. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nat Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
  11. Zhang, Q., et al. Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals. Cell Res. 21, 579-587 (2011).
  12. Uosaki, H., et al. Efficient and scalable purification of cardiomyocytes from human embryonic and induced pluripotent stem cells by VCAM1 surface expression. PLoS One. 6, e23657 (2011).
  13. Hudson, J., Titmarsh, D., Hidalgo, A., Wolvetang, E., Cooper-White, J. Primitive Cardiac Cells from Human Embryonic Stem Cells. Stem Cells Dev. 21, 1513-1523 (2011).
  14. Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circ Res. 111, 1125-1136 (2012).
  15. Ban, K., et al. Purification of cardiomyocytes from differentiating pluripotent stem cells using molecular beacons that target cardiomyocyte-specific mRNA. Circulation. 128, 1897-1909 (2013).
  16. Toyota, N., Shimada, Y. Differentiation of troponin in cardiac and skeletal muscles in chicken embryos as studied by immunofluorescence microscopy. J Cell Biol. 91, 497-504 (1981).
  17. Saggin, L., Gorza, L., Ausoni, S., Schiaffino, S. Cardiac troponin T in developing, regenerating and denervated rat skeletal muscle. Development. 110, 547-554 (1990).
  18. Kajioka, S., et al. Endogenous cardiac troponin T modulates Ca(2+)-mediated smooth muscle contraction. Sci Rep. 2, 979 (2012).
  19. Franco, D., et al. Myosin light chain 2a and 2v identifies the embryonic outflow tract myocardium in the developing rodent heart. Anat Rec. 254, 135-146 (1999).
  20. Franco, D., Lamers, W. H., Moorman, A. F. Patterns of expression in the developing myocardium: towards a morphologically integrated transcriptional model. Cardiovasc Res. 38, 25-53 (1998).
  21. Poon, E., et al. Transcriptome-guided functional analyses reveal novel biological properties and regulatory hierarchy of human embryonic stem cell-derived ventricular cardiomyocytes crucial for maturation. PLoS One. 8, e77784 (2013).
  22. Lieu, D. K., et al. Absence of transverse tubules contributes to non-uniform Ca(2+) wavefronts in mouse and human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells Dev. 18, 1493-1500 (2009).
  23. Cao, F., et al. Transcriptional and functional profiling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. PLoS One. 3, e3474 (2008).
  24. Satin, J., et al. Calcium handling in human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells. 26, 1961-1972 (2008).
  25. Itzhaki, I., et al. Calcium handling in human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes. PLoS One. 6, e18037 (2011).
  26. Bodor, G. S., Porterfield, D., Voss, E. M., Smith, S., Apple, F. S. Cardiac troponin-I is not expressed in fetal and healthy or diseased adult human skeletal muscle tissue. Clin Chem. 41, 1710-1715 (1995).
  27. Hunkeler, N. M., Kullman, J., Murphy, A. M. Troponin I isoform expression in human heart. Circ Res. 69, 1409-1414 (1991).
  28. Bhavsar, P. K., et al. Developmental expression of troponin I isoforms in fetal human heart. FEBS Lett. 292, 5-8 (1991).
  29. Christoffels, V. M., Keijser, A. G., Houweling, A. C., Clout, D. E., Moorman, A. F. Patterning the embryonic heart: identification of five mouse Iroquois homeobox genes in the developing heart. Dev Biol. 224, 263-274 (2000).
  30. Bruneau, B. G., et al. Cardiac expression of the ventricle-specific homeobox gene Irx4 is modulated by Nkx2-5 and dHand. Dev Biol. 217, 266-277 (2000).
  31. Bao, Z. Z., Bruneau, B. G., Seidman, J. G., Seidman, C. E., Cepko, C. L. Regulation of chamber-specific gene expression in the developing heart by Irx4. Science. 283, 1161-1164 (1999).
  32. Nelson, D. O., Jin, D., Downs, K., Kamp, T. J., Lyons, G. E. Irx4 identifies a chamber-specific cell population that contributes to ventricular myocardium development. Dev Dyn. 243, 381-392 (2013).
  33. Martin, A. F. Turnover of cardiac troponin subunits. Kinetic evidence for a precursor pool of troponin-I. J Biol Chem. 256, 964-968 (1981).
  34. Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 22, 1991-2002 (2013).
  35. Farrell, H. M., et al. Nomenclature of the proteins of cows" milk--sixth revision. Journal of dairy science. 87, 1641-1674 (2004).
  36. Micusan, V. V., Borduas, A. G. Biological properties of goat immunoglobulins. G. Immunology. 32, 373-381 (1977).
  37. Lyons, G. E. In situ analysis of the cardiac muscle gene program during embryogenesis. Trends Cardiovasc Med. 4, 70-77 (1994).
  38. Nakagawa, O., Nakagawa, M., Richardson, J. A., Olson, E. N., Srivastava, D. H. R. T. 1 HRT2, and HRT3: a new subclass of bHLH transcription factors marking specific cardiac, somitic, and pharyngeal arch segments. Dev Biol. 216, 72-84 (1999).
  39. Xin, M., et al. Essential roles of the bHLH transcription factor Hrt2 in repression of atrial gene expression and maintenance of postnatal cardiac function. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 7975-7980 (2007).
  40. Davis, L. M., Rodefeld, M. E., Green, K., Beyer, E. C., Saffitz, J. E. Gap junction protein phenotypes of the human heart and conduction system. J Cardiovasc Electrophysiol. 6, 813-822 (1995).
  41. Minamisawa, S., et al. Atrial chamber-specific expression of sarcolipin is regulated during development and hypertrophic remodeling. J Biol Chem. 278, 9570-9575 (2003).
  42. Larsen, T. H. Atrial natriuretic factor in the heart of the human embryo. Acta Anat (Basel. 138, 132-136 (1990).
  43. Claycomb, W. C. Atrial-natriuretic-factor mRNA is developmentally regulated in heart ventricles and actively expressed in cultured ventricular cardiac muscle cells of rat and human). Biochem J. 255, 617-620 (1988).
  44. Franco, D., et al. Divergent expression of delayed rectifier K(+) channel subunits during mouse heart development. Cardiovasc Res. 52, 65-75 (2001).
  45. Hoogaars, W. M., et al. The transcriptional repressor Tbx3 delineates the developing central conduction system of the heart. Cardiovasc Res. 62, 489-499 (2004).
  46. Hollenberg, S. M., Sternglanz, R., Cheng, P. F., Weintraub, H. Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system. Mol Cell Biol. 15, 3813-3822 (1995).
  47. Srivastava, D., Cserjesi, P., Olson, E. N. A subclass of bHLH proteins required for cardiac morphogenesis. Science. 270, 1995-1999 (1995).
  48. Firulli, A. B., McFadden, D. G., Lin, Q., Srivastava, D., Olson, E. N. Heart and extra-embryonic mesodermal defects in mouse embryos lacking the bHLH transcription factor Hand1. Nat Genet. 18, 266-270 (1998).
  49. Calejo, A. I., et al. Differences in the expression pattern of HCN isoforms among mammalian tissues: sources and implications. Mol Biol Rep. 41, 297-307 (2013).
  50. Stevens, S. M., Pu, W. T. HCN4 charges up the first heart field. Circ Res. 113, 350-351 (2013).
  51. Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nat Cell Biol. 15, 1098-1106 (2013).
  52. Davis, R. P., vanden Berg, C. W., Casini, S., Braam, S. R., Mummery, C. L. Pluripotent stem cell models of cardiac disease and their implication for drug discovery and development. Trends Mol Med. 17, 475-484 (2011).
  53. Mummery, C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. , 107-2733 (2003).
  54. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
  55. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29, 1011-1018 (2011).
  56. Samal, R., et al. OMICS-based exploration of the molecular phenotype of resident cardiac progenitor cells from adult murine heart. J Proteomics. 75, 5304-5315 (2012).
  57. Van Hoof, D., et al. Identification of cell surface proteins for antibody-based selection of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. J Proteome Res. 9, 1610-1618 (2010).
  58. Gundry, R. L., Boheler, K. R., Van Eyk, J. E., Wollscheid, B. A novel role for proteomics in the discovery of cell-surface markers on stem cells: Scratching the surface. Proteomics Clin Appl. 2, 892-903 (2008).
  59. Gundry, R. L., Burridge, P. W., Boheler, K. R. Pluripotent Stem Cell Heterogeneity and the Evolving Role of Proteomic Technologies in Stem Cell Biology. Proteomics. 11, 3947-3961 (2011).
  60. Gundry, R. L., et al. A Cell Surfaceome Map for Immunophenotyping and Sorting Pluripotent Stem Cells. Mol Cell Proteomics. , 303-316 (2012).
  61. Bryder, D., Rossi, D. J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cells: the paradigmatic tissue-specific stem cell. Am J Pathol. 169, 338-346 (2006).
  62. Kondo, M., et al. Biology of hematopoietic stem cells and progenitors: implications for clinical application. Annu Rev Immunol. 21, 759-806 (2003).
  63. Shizuru, J. A., Negrin, R. S., Weissman, I. L. Hematopoietic stem and progenitor cells: clinical and preclinical regeneration of the hematolymphoid system. Annu Rev Med. 56, 509-538 (2005).
  64. Weissman, I. L., Shizuru, J. A. The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases. Blood. 112, 3543-3553 (2008).
  65. Boheler, K. R., Bhattacharya, S., Chuppa, S., Riordon, D. R., Kropp, E., Burridge, P. W., Wu, J. C., Wersto, R. P., Wollscheid Rao,, Gundry, B., L, R. A Human Pluripotent Stem Cell Surface N-Glycoproteome Resource Reveals New Markers, Extracellular Epitopes, and Drug Targets. Stem Cell Reports. , 185-203 (2014).

Tags

Cellebiologi menneskeskabte pluripotente stamceller flowcytometri instrueret differentiering cardiomyocyte IRX4 TNNI3 TNNT2 MCL2v MLC2a
High Efficiency Differentiering af humane pluripotente stamceller til hjertemuskelceller og karakterisering ved hjælp af flowcytometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bhattacharya, S., Burridge, P. W.,… More

Bhattacharya, S., Burridge, P. W., Kropp, E. M., Chuppa, S. L., Kwok, W. M., Wu, J. C., Boheler, K. R., Gundry, R. L. High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (91), e52010, doi:10.3791/52010 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter